全 文 ：·综述与专论· 2013年第5期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
目前，石油、煤炭及天然气等化石燃料在价格
不断上涨的同时，正面临资源枯竭的危险［1］。发展
生物燃料已成为许多国家提高能源安全、减排温室
气体、 应对气候变化的重要措施。当前市场上的生
物燃料以燃料乙醇和生物柴油最为常见，异丁醇与
这些生物燃料相比具有高能量密度和低吸湿性等优
势，因此被作为一种补充或替代汽油的新型生物燃
料加以重点研究。除作为生物燃料外，异丁醇也是
合成增塑剂、防老剂、人工麝香、果子精油和药物
的重要原料，还是生产涂料、清漆的重要配料，并
可作为正丁醇的代用品。异丁醇还可以脱水生成具
有更高价值的异丁烯，作为塑胶及柴油机燃料的原
料［2］。因此，异丁醇的研究开发日益受到许多国家
的重视。
1 异丁醇生产技术与现状
长久以来，异丁醇作为重要的中间物质被用于
收稿日期 ： 2013-01-16
基金项目 ：国家林业局“948”项目（2011-4-13）
作者简介 ：田宇，男，硕士，研究方向 ：应用生物化学 ；E-mail ：hyutian2012@163.com
通讯作者 ：王义强，男，教授，博士生导师，研究方向 ：生物能源与制药 ；E-mail ：wangyiqing12@yahoo.com.cn
异丁醇生物合成的研究进展
田宇  王义强  王启业
（中南林业科技大学 生物技术实验室，长沙 410004）
摘 要 : 异丁醇一直以来作为重要的化工原料被用于诸多领域。近年来发现异丁醇也可以作为新一代的生物燃料，并且具
有高热值、易混合、高辛烷值等特有的优势，体现出了巨大的发展潜力，越来越受到人们的关注。就异丁醇作为新型生物燃料的
生产现状和生物合成异丁醇在国内外的研究进展进行介绍与论述，并对生物合成异丁醇的未来发展的趋势进行展望。
关键词 : 异丁醇 生物燃料 生物合成 工程菌
Research Progress of Isobutanol Biosynthesis
Tian Yu Wang Yiqiang Wang Qiye
（Biotechnology Laboratory，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract:  As an important chemical raw material, isobutanol has always been used in many fields, which can be used as a new generation
of biofuels in recent foundation. The unique advantages of high calorific value, easy mixing and high octane number have huge development
potential and more attention. In this paper, the author gave presentations and discussion about the new bio-fuel production present situation of
isobutanol and research progress in biosynthesis of isobutanol at home and abroad, having prospects of the trends for biosynthesis of isobutanol.
Key words:  Isobutanol Biofuels Biosynthesis Gngineering bacteria
食品、医药和化工等多个行业［3］。作为新型生物燃
料，异丁醇有其独特的优势，更具有广阔的发展前景。
异丁醇具有不易吸水、挥发性低等特点，异丁醇的
运输可以直接利用现有的汽油输送管道及分销渠道，
且异丁醇对汽车引擎造成的损伤更小，现有汽车引
擎可直接使用，不需要掺入汽油，同时与生产 1 gal
的乙醇相比，生产 1 gal 的异丁醇所需要消耗的能量
更少，且能多生产至少 50％的可用能源［4］。异丁醇
代替生物乙醇作为汽车燃料有很大的可能性［5］。
目前生产异丁醇主要分成化学合成法和生物合
成法两大类，其中化学合成法占主导地位。化学合
成法主要有以下 3 种方法 ：（1）丙烯羰基合成法［6］
是在由丙烯和合成气制取正丁醇和２-乙基己醇工
业中副产异丁醛经加氢制得 ；（2）合成气在 Cu-Mg
催化剂作用下合成甲醇中得到异丁醇［7］；（3）由
Zn-Cr 氧化物催化剂低碳醇生产异丁醇［8］。目前，
2013年第5期 41田宇等 ：异丁醇生物合成的研究进展
世界上主要还是通过是丙烯羰基合成法生产异丁
醇。化学方法合成的异丁醇工艺繁琐，催化剂价格
高。同时，随着近年来石油价格的高涨与持续减少
和异丁醇需求的增长，再加之羰基合成醇装置的盈
利利润不高，一些欧洲生产商关停部分装置，而转
向其他产品发展，使得异丁醇供应形势十分紧张。
虽然几年来，国内的羰基醇装置的建成和调整装
置，使异丁醇供需矛盾将有一定改善，但是由于生
产异丁醇原料的严重不足和催化剂价格昂贵，导致
异丁醇供应不能满足当前的需要，市场缺口仍然很
大。生产异丁醇的原料供应对化学法大量合成异丁
醇形成了严重制约，并且在合成过程中造成的严重
环境问题，使人们不得不寻找新的异丁醇合成方法，
同时更加意识到生物合成异丁醇具有良好的发展
前景。
但生物合成法生产的异丁醇主要是通过粮食
发酵生产正丁醇中的少量副产。因此，利用生物合
成法直接发酵生产异丁醇被视为未来发展的重要
方向［9］。
2 异丁醇生物合成研究现状
燃料乙醇和丁醇已经通过酿酒酵母和丙酮丁醇
羧菌发酵生产达到了工业化的程度［10，11］，而到目
前为止，一直没有发现有原始菌株可以直接合成异
丁醇。1998 年，Dickinson 等［12］研究了酿酒酵母中
缬氨酸代谢途径中异丁醇的合成途径，但其是把它
作为缬氨酸代谢的微量副产物，不能达到工业化生
产的要求。 就目前的市场而言，如果要使发酵法生
产异丁醇在工业化方面较化学法更具有竞争力，发
酵法必须拥有短时间内达到较高产量和成本较低的
特点。传统的发酵菌株不能够满足工业化生产的需
要，因此我们需要对异丁醇生产的宿主菌株进行改
造，提高其对产物的耐受力、原料利用率等性状［13］。
2008 年 Atsumi 等［14］利用代谢工程手段对大肠杆菌
进行了改造，使其能够利用葡萄糖生产异丁醇，为
构建高产异丁醇基因工程菌提供了新的思路，开启
了生物合成异丁醇的大门。目前用于合成异丁醇研
究的菌株主要有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵
母等。下面对这几种菌的基因工程改造、生物合成
异丁醇的研究现状与进展进行综述。
2.1 大肠杆菌（Escherichia coli）生物合成异丁醇
E. coli 培养条件简单，生长迅速，底物范围广，
可发酵戊糖和己糖，有工业化生产的先例（生产重
组蛋白），并且传统醇类（如燃料乙醇）发酵也以
大肠杆菌工程菌进行。2008 年，Atsumi 等［14］发表
在 Nature 杂志上的文章表明，异丁醇的生物合成途
径是 ：在 2-酮酸脱羧酶（kivd）作用下，前体物质
2-酮异戊酸脱羧生成为异丁醛，然后由乙醇脱氢酶
（Adh2）将异丁醛还原为异丁醇。在启动子 PLlacol
的作用下过度表达 ilvHCD 基因和敲出在合成异丁
醇途径中产生的副产物的 adhE、dhA、frdAB、pflB、
fnr 和 pta 等基因，然后用转移性更高的枯草芽孢杆
菌的 alsS 基因替换活性较低的 ilvH 基因。经此改造
后的工程菌，发酵 110 h 后异丁醇的产量可高达 22
g/L， 相 当 于 理 论 值 的 86%。2009 年，Potera［2］ 在
发表的文章中阐述了美国杜邦公司已运用此方法生
产异丁醇。2010 年，郭媛等［15］将酿酒酵母菌株中
的 2-酮酸脱酸酶基因（aro10）及乙醇脱氢酶基因
（Adh2）导入工程菌，同时缺陷 pflB、frdAB 和 fnr 等
3 个基因，成功构建了可以利用蔗渣生产异丁醇的
工程菌菌株。同年，Ekaterina 等［16］成功将乙酰羟
酸合成酶、乙酰羟酸同分异构体还原酶（ilvC）、二
羟酸脱羧酶（ilvD）、2-酮酸脱酸酶（kivd）和乙醇
脱氢酶（Adh2）等基因引入大肠杆菌，构建了工程
菌，结果表明，该工程菌可以利用葡萄糖产生异丁
醇，在有氧条件下异丁醇产量到达 1.5%。2011 年，
林丽华等［17］将 2-酮酸脱羧酶基因（kdcA） 克隆到大
肠杆菌缺失型突变株 BW25113 中，将这些相关基因
串联在一个质粒中表达，发酵 24 h，产率达到 3 g/L。
该研究组进一步将大肠杆菌缺失型突变株 BW25113
中的 pflB、frdAB、fnr 和 Adh2 四个基因敲除，得到
工程菌异丁醇产量提高了 40%，达到了 4.2 g/L［18］。
2008 年，Atsumi 等［14］在大肠杆菌中将几种不同的
脱羧酶的编码基因进行了比较，包括来自 S. cerevisae
的 aro10、pdc6 和 thi3，来自 L. lactis 的 kivd 和来自 C.
aectobutylicum 的 pdc 等。研究结果表明，在异丁醇
的合成过程中，kivd 编码的脱羧酶活性最高。 2010 年，
Atsumi 等［19］对比了 L. lactis 中 adhA、S. cerevisae 中
的 Adh2 中和 E. coil 中 yqhD 三个基因在大肠杆菌中
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期42
的活性，研究表明 adhA 在大肠杆菌中呈现的异丁醛
还原酶的活性最大，所以 adhA 更适合作为大肠杆菌
中还原合成异丁醇的基因。Smith 等［20］利用 NTG 作
为诱变剂，对产异丁醇的 E. coli JCL16 进行诱变筛选，
获得了一株产量达到 590 mg/L 异丁醇的菌株 NV1 和
产量为 4.1 g/L 的 NV2，进一步对 NV2 进行诱变的
得到产量为 6.1 g/L 的 NV3。Bastian 等［21］利用定点
突变的手段，将 E. coil 异丁醇合成菌株中的酮酸还
原异构酶 ilvC 与乙醇脱氢酶 adhA 分别突变，得到
的改造菌株 E. coil pGVferm6，该菌株在厌氧条件下
异丁醇的合成量达到了 13.4 g/L，相对原菌种 E. coil
pGVferm2（2.3 g/L） 提 高 了 5.8 倍。Thrih 等［22］ 通
过研究 E. coli 合成异丁醇的碳代谢途径，确定了合
理的敲除途径，获得了能在厌氧条件下合成异丁醇
的 E. coli。2012 年，潘超强等［23］通过改造仅将 kivd
和 Adh2 串联克隆到 E. coli 中，24 h 后异丁醇的生物
合成量就达到 0.12 g/L。
2.2 枯草芽孢杆菌生物合成异丁醇
随 着 枯 草 芽 孢 杆 菌 基 因 图 谱 的 绘 制 完 成，
Bacillus subtilis 已被作为基因改造和工程菌构建的重
要菌株。2008 年，Fischer 等［13］研究发现，枯草芽
孢杆菌的对正丁醇的耐受性较好（异丁醇毒性与其
相似），在 2.0% 正丁醇存在时其生长速率约为大肠
杆菌的 8 倍。与此同时，枯草芽孢杆菌中的 alsS 基
因是对编码对丙酮酸有高度专一性的乙酰乳酸合酶
的优势基因。基于以上几点优势，枯草芽孢杆菌也
被作为生物合成异丁醇的改造菌株。
2010 年， 谢 夏 等［24］ 将 Adh2（S. cerevisae） 和
kivd（L. lactis）连接到载体上，由 p43 启动子启动
两个基因表达构建重组载体，再导入 B. subtilis 168
中，获得重组菌。然后，通过对重组菌发酵条件进
行优化，结果表明在发酵 35 h 后，异丁醇产量为 0.607
g/L。2011 年，Li 等［25］将外源的乙酰羟酸合成酶基因、
乙酰羟酸同分异构体还原酶基因（ilvC）、二羟酸脱
羧酶基因（ilvD）、2 -酮酸脱羧酶基因（kivd）和乙醇
脱氢酶基因（Adh2）等 5 个基因引入枯草芽孢杆菌，
过度表达乙酰羟酸合成酶基因，异丁醇的产率提高
2.8 倍。工程菌 B. subtilis 在微氧条件下发酵，得到
的异丁醇产量为 2.62 g/L 。Li 等［26］构建了 B. subtilis
异丁醇合成菌的基因组尺度代谢网络模型，该菌株
在好氧 - 微氧双阶段条件下培养，异丁醇产量达到
5.5 g/L，较原来菌株异丁醇生物合成量提高了 70%。
2.3 其他菌株生物合成异丁醇
除 上 述 几 种 菌 种 外， 酿 酒 酵 母 和 谷 氨 酸 杆
菌等也有发酵生产异丁醇的报道。早在 1998 年，
Dickinson 等［12］ 的研究结果，表明酿酒酵母内能
够通过缬氨酸代谢途径合成异丁醇，但产率不高。
Chen 等［27］研究表明，酿酒酵母厌氧发酵情况，通
过过度表达基因 ILV2、ILV3 和 ILV5，使异丁醇的
产量从 0.16 mg/g 葡萄糖提高到 0.97 mg/g 葡萄糖。
通过 BAT2 的过度表达，细胞质支链氨基酸的氨基
转移酶则可使异丁醇产量进一步提高两倍。Krause
等［28］通过失活 C. glutamicum 菌株中丙酮酸退青梅
复合体（PDHC）、苯醌氧化还原酶与氨基转移酶，
培养 72 h 后该菌株 kivd 生物合成量有明显提高。同
时，2011 年，张路路等［29］研究结果表明，酿酒酵
母耐受丁醇的特性远优于原核生物，耐受浓度达到
16 g/L，由此可以看出酿酒酵母很适合作为生物合成
异丁醇的宿主菌株。
2010 年，Smith 等［30］将 alsS（Bacillus subtilis）、
Adh2、ilvC、ilvD （C. glutamicum）和 kivd（Lactococcus
lactis）导入谷氨酸棒杆菌中并且过度表达，在适合
的条件下分批培养发酵 120 h 后，异丁醇产率达到
了 4.9 g/L。Blombach 等［31］以缺陷型 C. glutamicum
为宿主，失活 LDH 与苹果酸脱氢酶并过度表达 E.
coli 转氢酶 PntAB 后，菌株在好氧 - 厌氧双阶段条
件下，进行分批 - 补料发酵异丁醇产量提高到 13 g/L。
2009 年，Atsumi 等［32］对细长集球藻菌进行了
基因改造，将酮酸脱羧酶（kivd）基因、alsS 基因和
来自大肠杆菌的 ilvC 和 ilvD 等基因过度表达，在菌
液中检测到异丁醇量为 0.4 g/L。通过光合作用，转
基因蓝藻就可以产生异丁醇。2010 年，美国杜邦公
司和其合作伙伴 BioArchitecture Lab 获得美国国家资
助进行绿藻水产养殖，绿藻转化成可利用的糖，将
糖转化为异丁醇的工艺研究。
2011 年，Higashide 等［33］利用基因改造手段将
一株从腐烂的草中分离处能直接利用纤维素的梭菌
C. cellulolyticum，该工程菌可以直接利用纤维素合成
2013年第5期 43田宇等 ：异丁醇生物合成的研究进展
异丁醇，8 d 左右异丁醇产量已达到 660 mg/L。
3 小结
随着石油化工的快速发展和化学法合成异丁醇
的工业化生产，使得生物合成异丁醇产品缺乏经济
竞争力。主要有两方面原因 ：一是生物合成异丁醇
产量低，由于工程菌的 2-酮酸脱羧酶的表达量低直
接导致异丁醇量低，异源代谢产物及中间产物的积
累可能会导致细胞毒性反应影响产率，还有乙醇等
的生物合成代谢途径也会降低产率 ；二是目前的生
物异丁醇的合成主要是以葡萄糖为原料生产，生产
异丁醇成本太高，并且随着粮食价格的上涨及世界
粮食资源的匮乏，以粮食为原料生物合成丁醇的发
展必将处于劣势。所以，针对第一种情况，采用基
因工程和代谢工程技术，解除代谢过程中可能存在
的产物或者中间产物的抑制，构建对异丁醇耐受性
更高的基因工程菌株，敲除其他支路的基因、切断
其生物合成，寻找自身含有高酶活的 2-酮酸脱羧酶
菌株等方法均为提高生物合成异丁醇产量的有效途
径。对于第二种情况，通过利用廉价非粮类原料生
产异丁醇来降低其生产成本，以解决该产业所必须
直面的瓶颈问题。
目前，新型生物燃料占全球运输燃料市场的份
额不足 2%。根据专家的预测，生物燃料在未来运输
燃料结构中将占有重要比重，在主要市场中可望达
到 20%-30%［34］。由于生物异丁醇生产与生物乙醇
生产采用相似的工艺，现有的生物乙醇生产设施经
过改造便可转而生产生物异丁醇。因此，生物异丁
醇的市场潜力巨大。考虑到粮食安全和生产成本的
问题，生物异丁醇产业发展的出路在于应用非粮类
原料来生产异丁醇，如废糖蜜 、农作物秸秆，木薯
和木质纤维等。同时，随着人们对木质纤维素水解
研究的深入和纤维素酶成本的降低，此类可再生资
源用于异丁醇的发酵生产将成为必然的发展趋势。
另外，要增强异丁醇生物合成的经济竞争力，除了
采用廉价原料外，还需要运用基因工程和代谢工程
等现代分子生物学技术构建优良工程菌，革新生物
反应器，采取先进的发酵工艺和有效的回收技术等
措施。
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（责任编辑 狄艳红）