全 文 ：第 51 卷 第 7 期
2 0 1 5 年 7 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 7
Jul．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20150718
收稿日期: 2014 － 01 － 02; 修回日期: 2015 － 04 － 14。
基金项目: 国家林业局“948”项目“木质纤维生物炼制丁醇汽油及聚乳酸生物塑料技术引进”(2011 － 4 － 13)。
* 王义强为通讯作者。
基于杨木发酵产异丁醇大肠杆菌工程菌构建*
王启业1 王义强1，2，3 田 宇1 彭牡丹1 陈章靖1 陆 利1
(1．中南林业科技大学生物技术实验室 长沙 410004; 2．经济林培育与保护教育部重点实验室 长沙 410004;
3．国家林业局生物乙醇研究中心 长沙 410004)
摘 要: 【目的】克隆异丁醇生物合成途径中的 2 个关键酶基因———乙醇脱氢酶基因( adh2)和 2 － 酮酸脱羧酶
基因( kivd)，构建产异丁醇的工程大肠杆菌;进一步以杨木水解液为底物进行发酵，以期能利用木质纤维原料发酵
生产异丁醇，为异丁醇的可再生生产提供研究基础。【方法】分别以酿酒酵母总 DNA 和乳酸乳球菌总 DNA 为模
板，通过 PCＲ 扩增异丁醇生物合成途径关键酶基因 adh2 和 kivd。同时构建重组质粒 pSTV-29-adh2 和 pSTV-29-
kivd，分别转化大肠杆菌 DH5α，构建重组菌株 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2 和 E． coli DH5α-pSTV-29-kivd。进一步构
建串联表达质粒 pSTV-29-adh2-kivd，导入大肠杆菌 DH5α 中，构建重组工程菌 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd。各
重组菌株经 IPTG 诱导表达后，采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定其粗酶提取液中目的蛋白含量，并通过 SDS-PAGE 电
泳检测重组菌株 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2，E． coli DH5α-pSTV-29-kivd 和 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd 中目的
基因 adh2 和 kivd 的蛋白表达量。利用各重组菌 E． coli DH5α 分别以葡萄糖和杨木水解液为原料发酵生产异丁醇，
采用气相色谱检测发酵液中异丁醇含量。【结果】重组质粒 pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd 和 pSTV-29-adh2-kivd 经菌
液 PCＲ、酶切及测序验证，得到的片段大小与目的基因 adh2(1 067 bp)和 kivd(1 667 bp)大小和质粒载体 pSTV-29
(2 999 bp)大小相符，adh2 和 kivd 基因测序结果与 NCBI 中对应基因序列完全一致，表明表达载体 pSTV-29-adh2，
pSTV-29-kivd 和 pSTV-29-adh2-kivd 构建成功。蛋白含量测定结果和 SDS-PAGE 电泳检测结果显示，目的基因
adh2，kivd 的蛋白在各重组菌中均得到表达，在电泳图谱中的对应位置 40 kD(Adh2 蛋白分子质量 40 kD)和 70 kD
(Kivd 蛋白分子质量 70 kD)处均有明显的蛋白特征条带，且 adh2 基因编码的乙醇脱氢酶蛋白比 kivd 基因编码的
2 －酮酸脱羧酶蛋白表达量高，而空白对照菌株未出现任何蛋白特征条带，表明各重组菌 E． coli DH5α-pSTV-29-
adh2，E． coli DH5α-pSTV-29-kivd 和 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd 构建成功。在发酵试验中，只有重组菌 E． coli
DH5α-pSTV-29-adh2-kivd 能产异丁醇，以葡萄糖为底物的发酵液中异丁醇产量为 4. 1 g·L － 1，以杨木水解液为底物
的发酵液中异丁醇产量为 0. 14 g·L － 1，而重组菌 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2 和 E． coli DH5α-pSTV-29-kivd 的发酵液
中均未检测到异丁醇。结果表明，只有 adh2 和 kivd 在重组菌 E． coli DH5α 体内同时表达时才能利用缬氨酸途径生
物合成异丁醇。【结论】成功构建了产异丁醇大肠杆菌工程菌 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd，实现了异丁醇关键
酶基因在大肠杆菌中的表达及木质纤维发酵产异丁醇，为发酵法生产异丁醇提供了一条新的途径。
关键词: 异丁醇; 重组大肠杆菌; 乙醇脱氢酶基因; 2 －酮基异戊酸脱羧酶; 木质纤维水解液
中图分类号: Q291 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)07 － 0157 － 08
Construction of Engineering Escherichia coli Strains Used for Isobutanol Production
from Poplar Hydrolysate Fermentation
Wang Qiye1 Wang Yiqiang1 ，2，3 Tian Yu1 Peng Mudan1 Chen Zhangjing1 Lu Li1
(1 ． Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology Changsha 410004;
2 ． Key Lab of Non-Wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education Changsha 410004;
3 ． Bio-Ethanol Ｒesearch Center of State Forestry Administration Changsha 410004)
Abstract: 【Objective】Alcohol dehydrogenase and 2- keto acid decarboxylase are two key enzymes for isobutanol
production． To construct a recombinant Escherichia coli strain for isobutanol production，the cDNA sequence of the two
enzymes genes (adh2 and kivd) neede to be cloned from Saccharomyces cerevisiae and Lactobacillus lactis，respectively．
The poplar hydrolysate was further used as a fermentation substrate to produce isobutanol with the recombinant E． coli to
investigate whether the recombinant E． coli strain can utilize lignocellulosic materials to produce isobutanol． This study
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also intends to provide a research basis for the renewable production of isobutanol． 【Method】We amplified the gene of
adh2 by PCＲ with S． cerevisiae genome as a template and amplified the kivd with L． lactis genome as a template． We
constructed the recombinant plasmid pSTV-29-adh2 and pSTV-29-kivd，and then transformed the plasmids into E． coli
DH5α respectively，obtained the recombinant strains E． coli DH5α-pSTV-29-adh2 and E． coli DH5α-pSTV-29-kivd．
Further，the tandem expression plasmid pSTV-29-adh2-kivd was constructed and then integrated into the E． coli DH5α for
constructing the recombinant strain E． coli DH5α- pSTV-29-adh2-kivd． Isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside ( IPTG)
was used to induce the recombinant strains E． coli DH5α for recombinant protein expression． Alcohol dehydrogenase and
2-Ketoisovalerate decarboxylase activities in E． coli DH5α-pSTV-29-adh2，E． coli DH5α-pSTV-29-kivd and E． coli
DH5α-pSTV-29-adh2-kivd were measured． The amount of protein expression was analyzed with gray gel scan through SDS-
PAGE． The fermentation of recombinant E． coli DH5α strains showed that the proteins encoded by adh2 and kivd were
expressed simultaneously． The fermentation of recombinant E． coli DH5α strains was conducted in flask with glucose and
poplar wood hydrolysate as fermentation substrates to produce isobutanol separately． The isobutanol concentration was
detected by chromatography． 【Ｒesults】The recombinant plasmid pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd and pSTV-29-adh2-kivd
were verified by bacteria liquid PCＲ，enzyme digestion and DNA sequencing． The obtained fragment size was consistent
with the size of target genes (adh2 and kivd) and plasmid vector pSTV-29，the results of adh2 and kivd gene sequencing
were in complete accord with corresponding gene sequences in NCBI． The results indicated that the expression vector
pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd and pSTV-29-adh2-kivd were successfully constructed． Protein content measurement and
SDS-PAGE electrophoresis analysis showed that the proteins encoded by adh2 and kivd were respectively expressed in E．
coli DH5α-pSTV-29-adh2 and E． coli DH5α-pSTV-29-kivd，and simultaneous expressed in E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-
kivd． In gray gel scan，the corresponding position of 40 kD (Adh2 protein molecular weight) and 70 kD (Kivd protein
molecular weight) had obvious characteristics of protein bands，and the expression quantity of adh2 encoding protein
exceeded that of kivd encoding protein，while the blank control strain didn＇t appear any protein characteristic bands． All of
the results showed that the recombinant strains E． coli DH5α-pSTV-29-adh2，E． coli DH5α-pSTV-29-kivd and E． coli
DH5α-pSTV-29-adh2-kivd were successfully constructed． In the fermentation experiments，only the E． coli DH5α-pSTV-
29-adh2 could produce isobutanol with glucose and poplar wood hydrolysate as fermentation substrates，and the yields were
4. 1 g·L － 1 and 0. 14 g·L － 1，respectively． The strains E． coli DH5α-pSTV-29-adh2 and E． coli DH5α-pSTV-29-kivd
didn’t produce isobutanol． Thus，isobutanol could produce only with the adh2 and kivd expressed simultaneously in E．
coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd． 【Conclusion】The key genes of isobutanol synthetic pathway were expressed in E． coli and
the recombinant strain E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd would utilize lignocellulose to produce isobutanol． This study
offered an alternative strategy for isobutanol biosynthesis．
Key words: isobutanol; recombinant Escherichia coli; alcoholdehy drogenase; 2-ketoisovalerate decarboxylase;
lignocellulose hydrolysate
随着全球环境问题及能源危机的不断加剧，生
物燃料引起了人们的广泛关注，开发可替代生物燃
料已成为世界各国提高能源安全、减排温室气体排
放及应对气候变化的重要措施。利用木质纤维类生
物质转化为生物燃料是一种非常有潜力的可持续能
源发展战略。然而，近年来的研究重点主要集中在
以工程酵母菌发酵木质纤维水解液生产燃料乙醇方
面(Ho et al．，1998); 其他微生物，如运动发酵单胞
菌(Zhang et al．，1995)、大肠杆菌(Escherichia coli)
(Ohta et al．，1991)也被用于燃料乙醇的生产。尽管
通过生物发酵生产乙醇已有相当长一段时间，且在
生物燃料方面起着重要的作用，但由于其热值低、吸
湿性强、不易管道输送等不足限制了其发展。相比
之下，高级醇具有热值高、不易吸水、挥发性低等特
点，将成为新一代生物燃料替代物。近年来，代谢工
程及合成生物学被应用于生物能源的生产，通过构
建重组微生物发酵来生产丁醇、1 － 丙醇、异丁醇、2
－甲基 － 1 －丁醇、3 －甲基 － 1 －丁醇等高级醇在大
肠杆菌中得以成功实现 ( Atsumi et al．，2008a;
2008b; 2008c; Shen et al．，2008; Cann et al．，2008;
Connor et al．，2008)。与其他高级醇相比，异丁醇拥
有更高的辛烷值，还能用于除燃料工业以外的其他
行业;且生物异丁醇的生产工艺与生物乙醇的生产
工艺极为相似，现有的燃料乙醇生产设备只需稍加
改造便可转而生产生物异丁醇。因此，异丁醇被认
为是一种极具发展潜力的生物燃料替代物(Atsumi
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第 7 期 王启业等: 基于杨木发酵产异丁醇大肠杆菌工程菌构建
et al．，2008a; 2008b; 2008c; Dellomonaco et al．，
2010)，通过生物技术途径生产异丁醇，符合绿色、
可持续能源生产的要求(Fava et al．，2012)。Atsumi
等(2008c)通过基因工程和代谢工程手段对大肠杆
菌进行了改造，使其能够利用氨基酸的生物合成途
径合成长链醇类如异丁醇(图 1)。近来，通过该途
径生物合成异丁醇的其他宿主工程菌，如酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)、枯草芽孢杆菌 ( Bacillus
subtilis)、谷氨酸棒状芽胞杆菌 ( Corynebacterium
glutamicum )、 解 纤 维 素 梭 菌 ( Clostridium
celluldyticum)等也取得了较好的进展 ( Blombach et
al．，2011; Smith et al．， 2010; Li et al．， 2011;
Higashide et al．，2011; Chen et al．，2011)。但遗憾
的是，大多数生产菌株需要在厌氧或是氧限制条件
下通过其固有的氧化还原平衡代谢途径来生产相应
代谢产物，故易导致这些工程菌的底物利用范围有
限、原料利用率低和生产效率不高。本文以能代谢
C6 /C5 糖的模式工业微生物大肠杆菌作为宿主菌
种，通过构建产异丁醇大肠杆菌工程菌，实现氨基酸
途径生物合成异丁醇关键酶基因 adh2 和 kivd 在大
肠杆菌中的活性表达及杨木水解液发酵产异丁醇，
以期为能利用木质纤维类生物质(水解液含 C6，C5
糖)发酵生产异丁醇提供一条新的途径。
图 1 氨基酸途径生物合成异丁醇
Fig． 1 Amino acid pathway of isobutanol biosynthesis
①乙酰羟基酸合成酶 Acetohydroxyacid synthase ( AHAS ) ; ②乙酰羟基酸异构还原酶 Acetohydroxy isomeroreductase
(AHAIＲ) ; ③二羟酸脱水酶 Dihydroxyacid dehydratase ( DHAD) ; ④脱氨基酶 Transaminase B ( TA) ;⑤酮酸脱羧酶 2-
ketoacid decarboxylase(KIVD) ; ⑥醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase(ADH) ．
1 材料与方法
1. 1 材料 1) 质粒和菌株 酿酒酵母、大肠杆菌
DH5α 由中南林业科技大学国家林业局生物乙醇研
究中心实验室提供; 乳酸乳球菌(Lactobacillus lactis)
购于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC); 亚
克隆 T 载体 pMD18-T 载体、pSTV-29 表达载体购于宝
生物工程(大连)有限公司。
2) 主要仪器和试剂 主要仪器有 PCＲ 仪(Bio-
rad，美国)、小型垂直电泳槽(Bio-rad，美国)、气相色
谱仪(日本岛津)、凝胶成像系统(SYNGENE)和核酸
蛋白测定仪(Eppendorf)。主要试剂有 DNA 限制性
内切酶(NEB)、DNA 聚合酶(Taqplus)、T4 连接酶等
(Takara)，DNA marker、蛋白 marker、X-gal、寡核苷酸
(dNTP)、DNA 提取试剂盒、PCＲ 产物纯化试剂盒、琼
脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒提取试剂盒等(天根
生化科技有限公司)，其他试剂均为分析纯。基因测
序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
3) 培养基和培养条件 大肠杆菌培养和转化子
筛选采用 LB 培养基，转化子筛选培养基添加氯霉素;
发酵培养基为添加 10%杨木水解液(内含总还原糖为
42 g·L － 1)的 LB培养基，同时以含 42 g·L － 1葡萄糖的
LB培养基作为对照。培养条件为 37 ℃、220 r·min － 1。
1. 2 目的基因片段的 PCＲ 扩增 1) 目的基因组
DNA 提取 用 DNA 提取试剂盒提取酿酒酵母和乳
酸乳球菌的基因组 DNA。
2) 引物 根据 NCBI 中酿酒酵母的 adh2 基因
序列和乳酸乳球菌的 kivd 基因序列设计 PCＲ 引物
(表 1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
3) PCＲ 扩增 以酿酒酵母菌株总 DNA 和乳酸
乳球菌菌株总 DNA 为模板，分别扩增异丁醇生物合
成途径关键酶基因 adh2 和 kivd。采用 50 μL 扩增
体系，扩增条件: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s，Tm 30 s，
72 ℃1. 5 min，30 个循环; 72 ℃10 min。
表 1 引物序列①
Tab． 1 Primer sequences
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence( 5→3) 限制性酶切位点 Ｒestriction enzyme cutting site
adh2-F CGCGGATCCAAGGGGTGGTCCACATGTCTATTCCAGAAACT Bam H I
adh2-Ｒ TCCCCCGGGTTATTTAGAAGTGTCA Sma I
kivd-F TCCCCCGGGTTATTTAGAAGTGTCA Sma I
kivd-Ｒ TCCCCCGGGTTATTTAGAAGTGTCA SmaI
①黑体部分为酶切位点 ． The bold font represent enzyme cutting site．
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1. 3 重组质粒 pSTV-29-adh2 / pSTV-29-kivd / pSTV-
29-adh2-kivd 的构建 胶回收纯化的 adh2 基因经双
酶切后插入到 Sma I /BamH I 酶切位点上得表达质
粒 pSTV-29-adh2; kivd 基因插入到 pSTV-29 的 Sma
I 酶切位点上得表达质粒 pSTV-29-kivd; 最后将酶
切后的 kivd 基因插入 pSTV-29-adh2 质粒中，构建一
个包含异丁醇合成途径关键酶基因的重组质粒
pSTV-29-adh2-kivd (图 2)。酶切采用 37 ℃水浴酶
切 5 h，16 ℃ 过夜。将连接产物转化至大肠杆菌
DH5α 感受态细胞中，菌落经双酶切鉴定后挑取阳
性重组子送样测序。
1. 4 重组菌 E． coli DH5α 的诱导表达 重组菌 E．
coli DH5α 在氯霉素终浓度为 34 μg·mL － 1的 LB 液
体培养基中 37 ℃、220 r·min － 1摇床培养 OD600到
0. 4 ～ 0. 6，添加 IPTG 使其终浓度为1 mmol·L － 1，诱
导表达 12 h，以带有空质粒 pSTV-29 的 E． coli DH5α
作为空白对照。收集菌体提取蛋白，采用 5% 浓缩
胶和 10%分离胶的 SDS-PAGE 分析蛋白表达量;同
时使用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白含量，重复测
定 3 次，结果取平均值。
1. 5 重组菌 E． coli DH5α 发酵生产异丁醇 以重
组菌 E． coli DH5α 作为发酵菌株，添加 10%杨木水
解液的 LB 培养基、添加 42 g·L － 1葡萄糖的 LB 培养
基和未添加任何碳源的 LB 培养基为发酵培养基，
进行摇瓶发酵试验。种子培养基以1∶ 50的比例接种
到 250 mL 的锥形瓶中，220 r·min － 1、37 ℃培养至
OD600为 0. 4 ～ 0. 6 时，加 入 IPTG 至 终 浓 度 为
1 mmol·L － 1，继续培养 24 h，采用气相色谱法测定异
丁醇的产量。
1. 6 目的产物检测方法 采用气相色谱测定发酵
液中异丁醇的含量。气相色谱条件为色谱柱: 安捷
伦 HP-INNOWAX，30 m × 0. 25 mm; 检测器: FID，
N2 为载气，流速为 35 mL·min
－ 1，H2 流速为 35 mL·
min － 1，空气流速为 350 mL·min － 1; 初始柱温 45 ℃，
保留 1 min，然后以 5 ℃·min － 1升至 150 ℃，保留
2 min; 进样口温度为180 ℃，检测器温度为 200 ℃，
进样量为 1 μL，分流比为 1∶ 60，外标法定量测定。
图 2 重组质粒 pSTV-29-adh2 / pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd 构建过程
Fig． 2 The establishment process of recombinant plasmid pSTV-29-adh2 / pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd
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第 7 期 王启业等: 基于杨木发酵产异丁醇大肠杆菌工程菌构建
2 结果与分析
2. 1 重组质粒 pSTV-29-adh2 / pSTV-29-kivd / pSTV-
29-adh2-kivd 的构建 转化成功的阳性重组子
pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd 和 pSTV-29-adh2-kivd
经菌液 PCＲ 和酶切双重验证后，送往南京金斯瑞生
物科技有限公司测序，其结果表明 adh2 和 kivd 基因
序列与 NCBI 中相应基因序列完全一致，可见克隆
的基因片段为正确的目的基因片段。阳性重组子
pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd 和 pSTV-29-adh2-kivd
菌液 PCＲ 和酶切结果如图 3 和图 4 所示。可以看
出，各片段大小与目的基因大小( adh2 基因 1 067
bp、kivd 基因 1 667 bp)和质粒载体大小(2 999 bp)
相符，表明表达载体 pSTV-29-adh2，pSTV-29-kivd 和
pSTV-29-adh2-kivd 构建成功。
图 3 重组质粒 pSTV-29-adh2 /pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd 菌液 PCＲ 检测
Fig． 3 Electropherogram of recombinant plasmid pSTV-29-adh2 /pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd in bacterial liquid culture
M:500 bp DNA maker; A(1 － 8) :pSTV-29-adh2; B(1 － 8) :pSTV-29-kivd; C(1 － 14) :pSTV-29-adh2-kivd(1 和 8、2 和 9、…、6 和 13、7 和 14 分别
指同一重组质粒 1 and 8，2 and 9，…，6 and 13，7 and 14 for the same recombinant plasmid，respectively) ．
图 4 重组质粒 pSTV-29-adh2 /pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd 酶切检测
Fig． 4 Electropherogram of the recombinant plasmid pSTV-29-adh2 /pSTV-29-kivd / pSTV-29-adh2-kivd by restriction digestion
M:500bp DNA maker; A(1 － 2) :pSTV-29-adh2; B(1 － 2) :pSTV-29-kivd; C(1-2) :pSTV-29-adh2-kivd．
2. 2 重组菌 E． coli DH5α 的蛋白表达 重组菌
E． coli DH5α 采用 1 mmol·L － 1的 IPTG 37 ℃ 诱导
12 h 后提取粗酶液，经测定，E． coli-adh2，E． coli-
kivd，E． coli-adh2-kivd 菌株粗酶液中蛋白含量分别
是(627 ± 23)，( 518 ± 16 )和 ( 713 ± 19 ) mg·L － 1。
经 SDS-PAGE 电泳后结果如图 5 所示。从图 5 可
以看出，2 号泳在 40 kD 处出现明显的蛋白特征
带，与 adh2 基因编码的乙醇脱氢酶蛋白分子质量
大小相符; 3 号泳道在 70 kD 处出现明显的蛋白特
征条带，与 kivd 基因编码的 2 －酮酸脱羧酶蛋白分
子质量大小相符; 4 号泳道在 40 kD 和 70 kD 2 处
出现明显的蛋白特征条带，而 1 号泳道(空白对照
菌株)未出现任何蛋白特征条带。这表明已构建
的 pSTV-29-adh2-kivd 表 达 载 体 在 大 肠 埃 希 菌
DH5α 中同时表达了 adh2 和 kivd 基因的编码蛋
白，即成功地构建了含有表达载体 pSTV-29-adh2-
kivd 的重组菌株。
2. 3 重组菌 E． coli DH5α 摇瓶发酵产异丁醇 本
试验以添加 10%杨木水解液(内含总还原糖含量约
42 g·L － 1 )的 LB 培养基为发酵培养基，连续培养
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图 5 重组菌的 SDS-PAGE 分析
Fig． 5 SDS-PAGE analysis of the recombinant strains
M: Maker; 1: pSTV-29-adh2 空 载 体 Blank carrier pSTV-29; 2:
pSTV-29-adh2 蛋白表达 pSTV-29-adh2 protein expression;3:pSTV-
29-kivd 蛋白表达 pSTV-29-kivd protein expression; 4: pSTV-29-
adh2-kivd 蛋白表达 pSTV-29-adh2-kivd protein expression．
24 h，气相色谱检测发酵液中异丁醇含量。结果如
图 6 所示，其中第 2 个峰(面积为 7 074)为异丁醇。
通过气相检测发现，只有串联了 adh2 基因和 kivd 基
因的重组菌株 E． coli DH5α-pSTV-29-adh2-kivd 才能
够合成异丁醇，而只导入 pSTV-29-adh2 的 E． coli
DH5α 由于缺乏 2 －酮基脱羧酶的作用，发酵液中没
有异丁醇，同样只导入 pSTV-29-kivd 的 E． coli DH5α
由于缺乏醇脱羧酶的作用无法将异丁醛转化成异丁
醇。这说明只有乙醇脱羧酶和2 －酮基脱羧酶在重
组菌体内同时表达时才能合成异丁醇，最高产量为
0. 14 g·L － 1。同时以添加 42 g·L － 1葡萄糖的 LB 培
养基和未添加任何碳源的 LB 培养基为对照，经检
测，含 42 g·L － 1葡萄糖的 LB 培养基发酵得到异丁
醇的产量为 4. 1 g·L － 1，未添加任何碳源的 LB 培养
基中未检测出异丁醇。
图 6 重组菌 pSTV-29-adh2-kivd 发酵产物的气相色谱分析
Fig． 6 Gas chromatography profiles analysis of fermentation product for recombinant strain pSTV-29-adh2-kivd
3 结论与讨论
本试验通过基因工程手段对大肠杆菌中缬氨酸
途径进行改造，以酿酒酵母总 DNA 和以乳酸乳球菌
总 DNA 为模板，成功构建了异丁醇合成途径关键酶
基因的重组表达载体 pSTV-29-adh2-kivd，并对重组
菌 E． coli DH5α pSTV-29-adh2-kivd 进行了 IPTG 诱
导和蛋白表达。同时以该重组菌为发酵菌种，以杨
木水解液为原料进行摇瓶发酵得异丁醇，产量约为
0. 14 g·L － 1，成功构建出了能产异丁醇的大肠杆菌
工程菌，但异丁醇产量有待进一步提高。
Atsumi 等(2008c)在大肠杆菌中对来自酿酒酵
母的 aro10，pdc6，thi3，乳酸乳球菌的 kivd 和丙酮丁
醇梭菌的 pdc 等脱羧酶编码基因进行了比较，结果
表明 aro10 和 kivd 具有最广泛的底物，且在异丁醇
的生物合成过程中，kivd 编码的脱羧酶活性最高，对
缬氨酸代谢过程中的 2 －酮基异戊酸脱羧酶的专一
性很强，故本试验选取 kivd 基因作为目的基因之一
进行研究。但从 SDS-PAGE 电泳结果可以看出，kivd
基因的表达量不高，这可能是导致异丁醇产量低的
一个重要因素，说明编码 2 －酮酸脱羧酶基因( kivd)
可能是生物合成异丁醇途径中的一个关键酶基因，
这与潘超强等(2012)研究结果相似。因为 2 －酮酸
脱羧酶催化缬氨酸途径中 2 －酮基异戊酸生成异丁
醛，改变了缬氨酸原有的代谢途径，kivd 基因新的异
丁醇合成途径中引入的第一个酶基因，其表达量及
催化活性直接影响了异丁醛的合成量，而异丁醛是
异丁醇的合成底物，因此可以认为 kivd 基因是异丁
醇新合成途径中的关键酶之一。如果能够大幅度提
高现有 kivd 基因的表达或采用高酶活菌株的 kivd
261
第 7 期 王启业等: 基于杨木发酵产异丁醇大肠杆菌工程菌构建
基因构建表达质粒，并结合性能优良的大肠杆菌宿
主与优化培养条件等措施，应该可以大幅度提高异
丁醇产量。
郭媛(2010)将酿酒酵母菌株中的 2 －酮酸脱酸
酶基因(aro10)及乙醇脱氢酶基因( adh2)导入工程
菌，同时敲除了 pflB，frdAB 和 fnr 3 个旁路基因以阻
断乙醇和丙酮的生物合成，成功地构建了可以利用
蔗渣 生 产 异 丁 醇 的 工 程 菌 菌 株。 Savrasova 等
(2011)成功将乙酰羟酸合成酶、乙酰羟酸同分异构
体还原酶( ilvC)、二羟酸脱羧酶( ilvD)、2 －酮基异戊
酸脱羧酶( kivd)和乙醇脱氢酶(adh2)等基因引入大
肠杆菌，构建了工程菌，结果表明该工程菌可以利用
葡萄糖产生异丁醇，在有氧条件下异丁醇产量达到
1. 5%。林丽华等(2011a;2011b)将 2 －酮基酸脱羧
酶基因 ( kdcA ) 克隆到大肠杆菌缺失型突变株
BW25113 中，构建表达载体 pSTV-29-alsS-ilvC-ilvD-
kdcA，同时过量表达 alsS，ilvC，ilvD 基因，增加前体
丙酮酸的量，经葡萄糖发酵 24 h 后，产率达到
3 g·L － 1。该研究组进一步将大肠杆菌缺失型突变株
BW25113 中的 pflB，frdAB，fnr 和 AdhE 4 个基因敲
除，工程菌异丁醇产量达到 4. 2 g·L － 1，提高了 40%
(郭媛等，2012)。潘超强等 (2012)通过改造仅将
2 －酮基异酸脱羧酶基因 ( kivd)和醇脱氢酶基因
(adhA)串联克隆到大肠杆菌中，利用葡萄糖发酵
24 h后异丁醇的产量达到 0. 12 g·L － 1。通过缬氨酸
生物合成途径转化异丁醇过程中另一个关键基因是
醛醇脱氢酶基因，编码醇脱氢酶，使异丁醛转化为异
丁醇，因此，本试验同时选择了醇脱氢酶基因 adh2
作为研究对象，构建了基因工程菌 E． coli DH5α-
pSTV-29-adh2-kivd，并利用其以杨木水解液为底物
进行发酵试验。结果显示，该工程菌可以利用木质
纤维水解液中的糖类物质通过非发酵途径产生异丁
醇，同时以与杨木水解液中总还原糖含量相等量的
葡萄糖为碳源进行对照试验，该试验中异丁醇的产
量提高了近 3 倍，工程菌试验比对照实验的异丁醇
产量低，很有可能是因为工程菌并不能完全利用水
解液中的各种还原糖。水解液中的还原糖主要有葡
萄糖、木糖和阿拉伯糖，对照试验已证实，工程菌可
以利用葡萄糖发酵转化异丁醇，因此，极有可能是工
程菌并不能很好地利用木糖和阿拉伯糖。下一步应
对水解液发酵前后各还原糖的含量及利用情况进行
定量测定，以明确具体原因。
在后续的工作中，笔者将对现有基因工程菌进
行发酵过程优化，筛选出发酵的最优温度、时间、
pH、底物最佳浓度等，提高异丁醇的产量，使其能高
效利用木质纤维类生物质原料发酵产异丁醇，降低
生产成本，提高生产效益; 通过基因工程与代谢工
程，利用合成生物学的理念，构建能利用木质纤维水
解液中不同碳源合成异丁醇新途径，提高关键基因
的表达量，同时抑制副产物相关基因的表达，提高丙
酮酸含量，增加 2 －酮异戊醇的生物合成量，使碳源
更多流向异丁醇代谢途径(Atsumi et al．，2010)。进
一步构建 NADH 再生途径，以及添加提供 NADH 的
辅助碳源来缓解 NADH 供应不足的限制，实现异丁
醇产量的提高。
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(责任编辑 朱乾坤)
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