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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
miRNA 是一类长度为 19-25 核苷酸大小的内源
小分子非编码 RNA，它在转录水平上调节基因的表
达，在植物中起重要作用，其调控范围包括植物的
生长，发育及形态学等各个方面［1-4］。到目前为止，
miRNA 序列数据库 miRbase 20.0 中收录了来自 206
个物种的 24 521 条 miRNA 前体序列，加工生成 30
424 条成熟的 miRNA［5］。随着 miRNA 发现数量的
增多，对于 miRNA 研究方法的需求越来越迫切［6］。
收稿日期 ： 2014-0-14
基金项目 ：中国农业科学院创新项目（ASTIP） （2014ZX08011-003）
作者简介 ：姜锋，男，硕士研究生，研究方向 ：作物种植资源学 ；E-mail ：jiangfeng880814@163.com
通讯作者 ：张辉，男，研究员，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：zhanghui06@caas.cn
一种新的植物 miRNA 体内下调表达系统
姜锋  许硕  胡正  姜奇彦  张辉
（中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）
摘 要 ： MicroRNA（miRNA）是一种内源性的 21 到 24 个核苷酸长度的小分子 RNA，在植物发育过程中起重要作用。旨
在建立一种新的植物 miRNA 下调表达系统，为 miRNA 的功能研究提供有力的工具。不同于原有 target mimicry 的构建方法，以
miRNA 核心序列为基础，通过设计特定 DNA 引物，利用聚合酶链式反应（PCR）获得多拷贝的靶基因类似序列（Target mimicry or
target mimics），构建 target mimicry 载体，转化拟南芥。通过 qRT-PCR 验证 miRNA 靶基因在转基因植株中的表达。以拟南芥 6 个
保守 miRNA 为基础，获得了各个 miRNA 下调表达转基因株系，在转基因植株中检测 miRNA 靶基因的表达，与野生型相比差异明显，
均发生了明显的上调。我们基于一种新的 target mimicry 的载体构建方法，成功建立了一种在植物中具有普遍适用性的高效 miRNA
低表达系统。
关键词 ： miRNA 低表达 植物 新方法
A Novel Plant miRNA Knockdown System in Vivo
Jiang Feng Xu Shuo Hu Zheng Jiang Qiyan Zhang Hui
（Crop Science Institute，Chinese Academy of Agricultral Science，Beijing 100081）
Abstract: MiRNA is a kind of endogenous small RNA about 21-25 nuleotides in length that plays important roles in plant morphology
and development. The present study was performed to establish a novel system for plant miRNA knockdown in vivo, supply a enegetic tool for
miRNA function analysis. Unlike the original target mimicry vector method, we obtained multi-copyed target mimicry sequences using self-
ligation method with designed specific DNA fragment based on miRNA motif, construct expression vector and transform to Arabidopsis thaliana.
Starting with the conserved miRNA in Arabidopsis, we obtained six transgene lines of miRNA knockdown. We detected the relative expression
of related miRNA targets in transgene plants, resulting obviously up-regulated compared with the relative expression in wild type. Based on
target mimicry vector construction, we obtained MIM stable lines in Arabidopsis, successfully established a general and high effective miRNA
knockdown system in plant species.
Key words: miRNA Knockdown Plant Novel method
目前 miRNA 的功能研究主要还是通过 miRNA 过表
达、miRNA 基因缺失突变体以及 target mimicry 的手
段。Ni 等［7］通过构建人工 miRNA 过表达载体进行
了 gma-miR394a 的 功 能 分 析。Wang［8］ 和 Reyes［9］
利 用 miRNA 缺 失 突 变 体 深 入 开 展 了 miR160 和
miR159 的功能研究。
成熟的 miRNA 与含有 AGO 蛋白的复合体结合
形成 RNA 诱导的沉默复合体（RISC），识别并剪切
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期66
miRNA 的靶基因，从而完成调控作用，在此过程中
miRNA 和靶基因之间几乎完美的配对在一起 ；而与
靶基因互补程度较低的 miRNA 则在蛋白质翻译水平
上抑制其表达［10-12］。研究发现，RISC 总是在 miRNA 5
端第 10 和第 11 碱基的位置发生靶基因的剪切［13］。
2007 年 Franco-Zorrilla 等发现拟南芥长链非编码基
因 IPS1，可以通过与 ath-miR399 结合，抑制其对靶
基因的降解作用，而 IPS1 5 端第 10 和第 11 碱基
之间的 3 个不配对碱基又可以阻止 ath-miR399 将其
降解，Todesco 等通过定向改造 IPS1 基因构建人工
miRNA 靶 基 因 模 拟（Target mimicry） 对 miRNA 多
个家族实现了下调表达［14，15］。
根据前人研究，认为 target mimicry 的主要作用
序列是成熟 miRNA 序列和 3 个不配对碱基构成的
核心序列，而 Todesco 等［15］通过定向改造 IPS1 基
因构建人工 miRNA 靶基因模拟目的同样是为了获
得这一核心序列，步骤略显繁琐。本研究直接从成
熟 miRNA 序列出发，通过设计特异性引物低温退火
发生的自连反应，获得多拷贝的与 miRNA 核心序列
能发生特异性结合的 mimicry 目的序列，成功建立
miRNA 低表达系统，操作简便快捷。本研究为植物
miRNA 的功能研究提供有效的工具，对进一步阐明
miRNA 的调控机制有重要的研究意义。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验中的拟南芥材料为 Columbia-0 型。TA 克
隆试剂盒购自 Promega 公司。各种核酸内切酶及高
保真酶购自 Fermentas 公司。RNA 提取用 TRIzol 购
自 Invitrogen 公司。试验用各种引物由 Invitrogen 公
司合成。荧光定量试剂盒购自 TaKaRa 公司。荧光
定量 PCR 仪为 ABI 7500。
1.2 方法
1.2.1 Target mimicry 表 达 载 体 构 建 根 据 ASRP
（http ：//asrp.cgrb.oregonstate.edu/）中公布的拟南芥
miRNA 序列，在 miRNA 5 端第 10 和第 11 碱基位
点之间添加 ATC 3 个不配对的碱基，然后在其首尾
添加 cccggtctag 序列设计引物 B，在其互补序列首
尾添加 ctagaccggg 序列设计引物 A，DNA 引物序列，
见表 1。
按照设计的引物，通过引物自连反应获得人工
Target mimicry 的目的片段，PCR 反应体系（30 μL）
为 ：ddH2O 23.9 μL，pfu 10×buffer 3 μL，dNTP（10
mmol/L）0.8 μL，A 区 段（2 mmol/L）B 及 区 段（2
mmol/L）各 1 μL，Pfu 酶 0.3 μL。反应条件 ：95℃ 5
min ；94℃ 30 s，42℃ 30 s，72℃ 50 s，28 个循环 ；
72℃ 5 min，16℃终止。
将目的片段连接到 pBI121 上构建具有 Kan 抗性
的真核表达载体。
1.2.2 拟南芥培养方法 用 7% 次氯酸钠将拟南芥
种子杀菌 15 min，无菌水清洗 3 次，点种于 1/2MS
培养基上，4℃黑暗条件下冷积 2 d 后移至 23℃环境
中，当幼苗生长至真叶期转移到蛭石和营养土 2∶1
混合基质中，长日照（16 h 光照 /8 h 黑暗）培养。
1.2.3 转基因植株的获得 将人工构建的含有干扰
目的片段 Kan 抗性重组 pBI121 低表达载体利用农杆
菌 EHA105 介导转化拟南芥，T0 代经过含 50 mg/mL
的 Kan 抗性 MS 培养基筛选 11 d，获得转基因植株。
经过三代培养，获得纯系稳定转基因株系。观察表
型变化。
1.2.4 miRNA 靶基因 qRT 分析 选取生长 3 周的拟
南芥转基因植株叶片和对照组野生型叶片，TRIzol
法提取叶片总 RNA。使用 cDNA 第一链合成试剂盒
得到 cDNA，对 miRNA 相应靶基因进行 qRT-PCR，
引物设计，见表 2，检测转基因植株中靶基因的表达。
反应条件 ：95℃ 30 s 变性 ；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40
个循环 ；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。
表 1 DNA 引物设计
区段名称 序列信息（5-3）
mimic156-A ctagaccggg GTGCTCACTCGATTCTTCTGTCActagaccggg
mimic156-B cccggtctag TGACAGAAGAATCGAGTGAGCAC cccggtctag
mimic157-A ctagaccggg GTGCTCTCTATGATCTTCTGTCAActagaccggg
mimic157-B cccggtctag TTGACAGAAGATCATAGAGAGCAC cccggtctag
mimic164-A ctagaccggg TGCACGTGCCCGATTGCTTCTCCActagaccggg
mimic164-B cccggtctag TGGAGAAGCAATCGGGCACGTGCA cccggtctag
mimic167a-A ctagaccggg TAGATCATGCTGATGGCAGCTTCActagaccggg
mimic167a-B cccggtctag TGAAGCTGCCATCAGCATGATCTA cccggtctag
mimic319-A ctagaccggg AGGGATCTCCCGATTTCAGTCCAA ctagaccggg
mimic319-B cccggtctag TTGGACTGAAATCGGGAGATCCCT cccggtctag
mimic172-A ctagaccggg ATGCAGCATCAGATTCAAGATTCGctagaccggg
mimic172-B cccggtctag CGAATCTTGAATCTGATGCTGCAT cccggtctag
2014年第9期 67姜锋等：一种新的植物miRNA 体内下调表达系统
2 结果
2.1 Target mimicry表达载体
我们利用 CaMV35S 启动子对拟南芥 6 个保守
型 miRNA——miR156、miR157、miR164、miR167、
miR319 和 miR172 构 建 人 工 低 表 达 载 体。 研 究 表
明，AGO 蛋白总是在小 RNA 序列的第 10 和第 11
碱基的位置发生靶基因的切割［13］。我们依据 ASRP
（http ：//asrp.cgrb.oregonstate.edu/）中公布的拟南芥
miRNA 序列为基础，设计自连引物。在 miRNA 5
端第 10 和第 11 碱基位点之间添加 ATC 3 个不配对
的碱基，然后在其首尾添加 cccggtctag 序列设计引物
B，在其互补序列首尾添加 ctagaccggg 序列设计引物
表 2 RT 引物设计
基因名称 编号 引物序列（5-3） 对应 miRNA
Tubulin
R-001 GAG CCT TAC AAC GCT ACT CTG TCT GTC
内参基因
R-002 ACA CCA GAC ATA GTA GCA GAA ATC AAG
TOE1
R-003 CGG CAG ACA TCA GAC AAC TCC
miR172
R-004 GTC ACC AAT ACG GTC AAA AGA AAG
TOE2
R-005 ATG AAC CGC CCA CAA CCA
miR172
R-006 GCC TTC CAA CTT ATT CCA ACC T
TOE3
R-007 CGG AAA AGC AGC AAT CGG
miR172
R-008 GGT AAG GGG AAG GTT GAG GAG
AP2
R-009 CGG GCA GCA GCA ACA TTG GTA GCG GA
miR172
R-010 AGA GGA GGT TGG AAG CCA TTT GTC TGC
SMZ
R-011 AGG GAG AAG GAG CCA TGA AGT TTG GTG
miR172
R-012 GTC TTC AGA GGT TTC ATG GTT GCC ATG
SPL4
R-013 TCC CAT GGC ATG GAG GGT AAG AGA TCA CAA G
miR156
R-014 TCA GAA TTC CTA TCT AAT CTG TGG TCG CTT G
SPL5
R-015 TCC CAT GGC ATG GAG GGT CAG AGA ACA CAA C
miR156
R-016 TCA GAA TTC TTA TCT GAT CTG TGG TCG CTT G
CUC1
R-017 GAA GAG TTG TTG GGT CAT GC
miR164
R-018 CGA AAT CAA TCT GTC CCG ATG
CUC2
R-019 AGG CCG TAG TAG TAG TAG GG
miR164
R-020 TGA AGG CAA ATT CTC TTA CC
CUC3
R-021 GAG AGA CGA CAG GGT TGA TT
miR164
R-022 TGG CCT CAA GAC TAA GTG G
ARF6
R-023 CAA AGG CAA AGG CAA ATC TCC C
miR167
R-024 GAC AAC ACC TTC TAG TTG CAT AG
ARF8
R-025 CAT CAG GAG ATG CTG AAG CTT CC
miR167
R-026 CGA GAG AGA TGC GAA CGA ATG GC
TCP2
R-027 AAC GGC GGA GCA TTC AAT CTT
miR319
R-028 GCC TTT ACC CTT ATG TTC TGA
TCP3
R-029 CAT CCA GTT TAT AGC CAA A
miR319
R-030 ATG GCG AGA ATC GGA TGA A
TCP4
R-031 CCT TCA ACG ACG TCG TTT CAG CCA G
miR319
R-032 GTG AAC CGG TGG AGG AAG GTG ATG
TCP10
R-033 GTT TCT TGG TGG CCA ACA A
miR319
R-034 GAG GTG TGA GTT TGG AGG A
TCP24
R-035 TTC TTC TTC TGC CAT TAA TGG T
miR319
R-036 TCC TTT CCT TTG CCT TGT CA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期68
A。这样，在适当浓度条件下，A、B 引物两侧的反
向互补序列混合后低温退火，能够发生特异性结合，
在 DNA 聚合酶的参与下形成长的多拷贝靶基因模拟
目的片段。该靶基因模拟片段可以竞争性的与相应
miRNA 结合，而结合后其中的 ATC 3 个碱基阻止了
miRNA 对其进行剪切，从而对 miRNA 的功能进行
抑制。经 TA 克隆，测序验证后，利用 B 引物末端
接头加 A 碱基后形成的 Xba I 酶切位点，和 pBI121
载体上的 Sac I 酶切位点，定向插入到 pBI121 上，
连接后得到人工 target mimicry 表达载体，由农杆菌
EHA105 介导转化拟南芥。将获得的稳定株系命名
为 MIM 株系。
比 MIM 株系中 miRNA 靶基因的表达均发生明显上
调，最高上调幅度达到 61.4 倍。
3 讨论
3.1 MIM下调表达系统的创新性
Todesco［15］通过置换 Franco-Zorrilla［14］在拟南
芥中发现的 IPSI 序列中与 miRNA 序列能发生结合
的部分，构建了一系列拟南芥保守 miRNA 的功能干
扰表达载体，有效干扰 miRNA 的功能。
与前人研究相对比，我们直接从成熟 miRNA
的序列入手，利用特定的引物设计，通过引物低温
退火发生的自连反应形成多拷贝的核心序列，构建
MIM 下调表达载体。本方法只需要知道成熟 miRNA
的序列就可以完成引物设计，然后通过一步 PCR 引
物自连反应即可完成核心片段 mimicry 目的序列的
构建，操作简单快捷，无需像 Todesco 等［15］文献中
提到的 MIM 载体构建那样进行 IPS1 基因的克隆和
定向改造。
本方法中构建的 MIM 下调表达系统可以获得多
拷贝的核心序列，可以增加与 miRNA 结合的概率，
从而增强了 MIM 下调表达系统对 miRNA 功能的下
调能力。从本试验 miRNA 靶基因的 qRT-PCR 结果
中可以看出，在新的 MIM 下调表达系统作用下，检
测的 miRNA 靶基因的表达量很多都能上调 5 倍以上，
甚至 TCP10 上调倍数达到 61.4 倍。
综上所述，不同于原有的基于 IPS1 基因定向改
造构建 MIM 载体的方法，新的 MIM 下调表达系统
的构建方法具有创新性。
3.2 MIM下调表达系统的有效性
我们通过 MIM 表达系统，完成了 6 种 miRNA
基因的 MIM 表达载体的构建，然后利用农杆菌介导
转化拟南芥，从而获得了 MIM 纯系稳定株系。
miR156/157 靶向 SPL 家族，Wang 等［16］发现，
SPL 基因与间隔期（plastochron），即第 1 个叶原基
和第 2 个叶原基形成的间隔时间有关。MIM156 株
系的表型与过表达 SPL 基因相同，表现出间隔期时
间变长，子叶和真叶的形态改变等生理性状。而且
qRT-PCR 结果显示 SPL4、SPL5 基因表达在 MIM 株
系中均发生率显著上调。表明 MIM156/157 下调表达
系统有效的抑制了 miR156/157 的作用。
AǃB४⇥єחⲴ৽ੁӂ㺕ᒿࡇ␧ਸਾਁ⭏⢩ᔲᙗ㔃ਸA B ൘pfu儈؍ⵏDNA㚊ਸ䞦Ⲵ֌⭘лᢙ໎ࠪৼ䬮ⴞⲴ⡷⇥
miRNA
mimicry
miRNA
mimicry
在 A、B 引物的两侧设计添加反向互补序列，即图中黄色区段和蓝色区段
能在 PCR 过程中的退火步骤（42℃）发生特异性结合，形成反向互补 ；在
DNA 聚合酶的作用下能够扩增出多拷贝的双链目的片段，取 500 bp 左右片
段进行 TA 克隆，测序验证后再与载体连接。如此，我们获得的多拷贝的靶
基因模拟（mimicry）能够与 miRNA 核心序列（图中红色区段）发生特异性
结合，由于小环的存在，影响 miRNA 介导的剪切过程
图 1 人工 target mimicry 载体功能区段的形成过程
2.2 MIM株系的形态学分析
构建了 6 个针对不同 miRNA 家族的低表达载体，
每个低表达载体都获得了 15 株以上的转化株，同时
获得了 F2 代纯合的株系。这些 miRNA 都是拟南芥
中的保守型 miRNA，其在拟南芥体内的下调表达多
数能导致显著的形态学和发育相关的表型变化（表
3、图 2）。下表中概括了 MIM 株系的表型特征。
2.3 人工低表达系统对miRNA靶基因的影响
利用人工构建的低表达系统理论上能够抑制
miRNA 对其靶基因的降解，从而使 miRNA 靶基因
表 达（ 图 3） 上 调。 我 们 利 用 qRT-PCR 技 术， 以
Tubulin 为内参基因，对 miRNA 部分靶基因的表达
进行了检测。结果显示，与野生型拟南芥（WT）相
2014年第9期 69姜锋等：一种新的植物miRNA 体内下调表达系统
miR164 靶向 NAC 结构域的转录因子 CUC 家族
成员［17］，研究发现 CUC2 的过表达会导致边缘区域
的扩大［18］，而本试验中发现 MIM164 株系植株较小，
叶片较圆短。qRT-PCR 检测结果显示，MIM164 株
系中 CUC1、CUC2 表现出非常明显的上调表达趋势。
表明 MIM164 下调表达系统有效的抑制了 miR164 的
作用。
miR167 靶向 ARF 家族，ARF 家族通过影响生
长素应答调控叶片发育，由图 2-G 可以看出，MIM
株系与野生型相比生长旺盛，且 MIM167 靶基因
ARF6 表达上调量高达 11 倍之多。表明 MIM167 下
调表达系统有效的抑制了 miR167 的作用。
表 3 MIM 株系表型描述
MIM 株系 相关 miRNA 表型描述 miRNA 靶基因
MIM156 miR156 第一个叶原基形成与第二叶原基形成间隔时间长，子叶和真叶的形态
改变（图 2-B）
SPL2、SPL3、SPL4、SPL5
MIM157 miR157 表型与 MIM156 类似（图 2-C） SPL2、SPL3、SPL4、SPL5
MIM164 miR164 植株较小，叶片圆短，叶序发育异常（图 2-D，图 2-J） CUC1、CUC2、CUC3
MIM167 miR167 叶片宽大且厚，生殖生长旺盛，结实多（图 2-E，图 2-G） ARF6、ARF8
MIM319 miR319 叶片从真叶开始表现向上卷曲，到六叶以后真叶表现正常（图 2-I） TCP2、TCP3、TCP4、TCP10、TCP24
MIM172 miR172 过晚开花，比野生型推迟 15 d 左右（图 2-F，图 2-H） TOE1、TOE2、TOE3、AP2、SMZ
A B C G
D E F H
I
J
K
MIM164 WT
MIM319
MIM164 MIM167 MIM172
MIM157MIM156WT
A-E ：野生型和 MIM 株系的 30 d 叶片形态 ；F ：MIM172 株系 45 d 叶片形态 ；H ：MIM172 株系和野生型 45 d 叶片形态对比，MIM 株系表现晚花，比
野生型晚 15 d 左右；G：MIM167 株系与野生型 45 d 叶片形态对比；I：MIM319 和野生型表型比较；J：MIM164 和野生型表型比较；K：MIM319 株系（上
排）和野生型（下排）30 d 叶片形态比较
图 2 MIM 株系表型观察
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期70
前 人 研 究 发 现［16］，miR159 的 下 调 表 达 能 够
导致叶片产生向上卷曲的表型改变。而 miR159 和
miR319 在序列上具有高度相似性，核心序列只相
差 3 个碱基，常被认为是属于同一个家族［19］。qRT-
PCR 结果显示，miR319 的靶基因在低表达株系中具
有明显的上调表达，进一步证实了本研究中低表达
系统的有效性。
miR172 能够调节花的发育［20］，体内低表达导
致晚花［17］。表型观察发现，MIM172 株系约比野生
型晚开花 15 d 左右。有很多基因在植物的成花诱导
过程中发挥作用，我们在对 MIM172 株系进行靶基
因表达量分析时，其靶基因均发生了不同程度的上
调表达。这些结果都表明了 MIM 下调表达系统的有
效性。
4 结论
研究表明，miRNA 在动植物的生长发育中起重
要的调控作用。本研究在 miRNA 靶基因模拟的基础
上，从拟南芥保守 miRNA 入手，通过 DNA 区段自
连，构建靶基因模拟表达载体，建立并验证了一种
高效的 miRNA 低表达系统，为 miRNA 功能研究提
供了有效的工具和极大的支持。深入 miRNA 功能分
析，有利于 miRNA 分子机制的完善，对 miRNA 研
究走向应用领域不无裨益。
26.8
61.4 MIM319
WT
0
5
10
15
TCP2
SPL4
0
2
4
6
8
10
12
SPL5 ARF6 ARF8 CUC1 CUC2 CUC3
TCP3 TCP4 TCP10 TCP24 TOE1 TOE2 TOE3 AP2 SMZ
20
15
10
5
0
⴨ሩ㺘䗮䟿⴨ሩ㺘䗮䟿
0
2
4
6
8
10
12⴨ሩ㺘䗮䟿
0
2
4
6
8
10
12⴨ሩ㺘䗮䟿⴨ሩ㺘䗮䟿 MIM172WT MIM16419.7 WTMIM167WTMIM156WT
图 3 miRNA 靶基因的定量 PCR
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（责任编辑 狄艳红）