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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
大豆可以与土壤固氮细菌 - 根瘤菌建立共生关
系，根瘤菌的固氮作用能够使植物在缺乏氮的土壤
条件下生长［1］。在豆科植物中，固氮过程是植物和
根瘤菌发生复杂相互作用的一个结果，这个过程类
似所有的合成途径能够提高植物新陈代新过程中消
耗的能量，但是此过程所消耗的碳量较高［2］。由于
基因方法和管理方法的进步，大豆的产量在之前的
30 年中有了稳定的增加。为了提高产量，大豆植株
必须维持高光合作用率并在种子中积累大量的氮元
素。而生物固氮可以作为提供氮元素的主要来源使
大豆高产［3］。包括南非在内的一些国家现阶段都在
收稿日期 ：2013-03-12
基金项目 ： 哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（RC2009XK001004），黑龙江省科技攻关项目（GA08B101），黑龙江大学高层次人才（创
新团队）支持计划（Hdtd2010-05）
作者简介 ：李珊珊，女，硕士研究生，研究方向 ：分子生态学 ；E-mail ：446540970@qq.com
通讯作者 ：于冰，女，副教授，研究方向 ：分子生态学 ；E-mail ：ybgirl1234@sina.com
导入 nodD-lba 串联基因的根瘤菌工程菌株的构建
李珊珊 李海英 于冰
（黑龙江大学生命科学学院 黑龙江省普通高等学校分子生物学重点实验室，哈尔滨 150080）
摘 要 ： 旨在利用同源序列克隆法，克隆出结瘤相关基因 nodD 和大豆血红蛋白基因 lba。以串联的方式将 nodD 和 lba 基因
连接到 lac 启动子的下游，通过 DNA 重组技术构建出带有发光酶基因 luxAB 的重组载体 pTR-Plac-nodD-lba。通过三亲本杂交方法构
建转基因费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii），Western blot 试验证明导入基因能够进行表达。将初始菌株和基因工程菌株侵染大
豆幼苗后进行固氮酶活的测定。测定结果表明，转基因工程菌株均能够提高固氮酶效率，导入串联基因的工程菌株在提高固氮酶
活性上比导入 lba 和 nodD 基因的工程菌株高出 4% 和 15.1%。
关键词 ： 结瘤基因 nodD 大豆血红蛋白基因 lba 费氏中华根瘤菌 三亲本杂交
The Construction of Rhizobia Engineering Strain of Introduction a
Tandem Gene nodD-lba into Sinorhizobium fredii
Li Shanshan Li Haiying Yu Bing
（Key Laboratory of Molecular Biology，College of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin 150080）
Abstract: In this study, homology-based cloning was used to clone hemoglobin gene of lba and nodulation gene of nodD. The two genes
were ordered joined into downstream of lac promoter and connected by the DNA recombinant technique to constructed expression vector pTR-
Plac-nodD-lba marked by luxAB gene. The vector was transformed into Sinorhizobium fredii with the method of triparental hybridization to
construct genetic engineering strain. Western blot indicated the genes we used can express normally. Strains were inoculated soybean seedlings
in order to get nitrogenase activity. The result showed engineering strains can improve the nitrogenase activity and the engineering strain with
tandem genes can enhance nitrogenase activity 4% and 15.1%, respectively, by contrast with engineering strain with lba or nodD gene.
Key words: Nodulation gene nodD Glycine max leghemoglobin gene lba Sinorhizobium fredii Triparental hybridization
投身于研究如何提高固氮效率和怎样维持根瘤的固
氮作用［4］。生物圈中的总氮量在减少，豆科植物的
固氮作用可以缓解这一情况，并在可持续生产系统
中发挥至关重要的作用［5］。
在固氮过程中，大豆血红蛋白能够调节类菌体
的氧浓度，还可以保护并维持固氮酶的活性。大豆
中铁的缺乏会导致豆血红蛋白的含量降低［6］。大豆
血红蛋白由一类在根瘤中特异表达的隐性基因编码，
包括 lba、lbc1、lbc2 和 lbc3 四个主要基因［7］。本实
验室的前期研究中发现，转入 lba 基因的根瘤菌工
程菌株与原始菌株和导入空载体的对照菌株以及导
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期120
入 lbc1、lbc2 和 lbc3 基因的工程菌株相比，其固氮
活性最好［8］。nodD 基因是共生结瘤过程中重要的调
节基因，它编码的蛋白能够调节其它 nod 结构基因
的表达，合成结瘤因子，如果这类基因失活则会导
致不结瘤或结瘤过程推迟［9，10］。
为了研究结瘤基因与固氮基因的相互作用及影
响，本试验选取参与结瘤过程的重要基因 nodD 和与
固氮作用密切相关的基因 lba 以串联的方式转入费
氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）中。主要构建
了原核表达载体 pTR-Plac-nodD-lba，通过三亲本杂交
法转入菌体中，成功获得转基因工程菌株 SF（pTR-
Plac-nodD-lba）。将转导入串联基因的工程菌株和导入
单个基因的工程菌株（实验室前期工作获得）分别
培养后接种大豆，旨在提高转基因工程菌株大豆根
瘤固氮酶活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 大豆（黑农 43），购于黑龙江省
农业科学院。
1.1.2 菌株与质粒 费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium
fredii），购自中国农业微生物菌种保藏管理中心
（ACCC），菌株保藏编号 ：15067。含有质粒 pET-Plac
的 E.coli DH5α 菌株，由本实验室构建并保藏。SF
（pTR-Plac-nodD），SF（pTR-Plac-lba），均为本实验室
前期已构建成功的工程菌株，其中 SF 为费氏中华根
瘤菌的缩写。带有质粒 pTR102（含有 luxAB 发光酶
基因，具有氨苄青霉素抗性）及 pRK2073 的 E.coli
DH5α 菌株，由华中农业大学周俊初教授惠赠。
1.2 方法
1.2.1 nodD 基因及 lba 基因的克隆 根据 NCBI 上
提供的 nodD 及 lba 基因的同源序列信息，设计特异
性引物如下 ：P1 ：5-GCGCCATGGGTTTTAAGGG-3 ；
P2 ：5-CGCGTCGACTCAATGATGATGATGATGATG-
TTAGAGGCA-3 ；P3 ：5-GCGGTCGACGGAGAAAA-
TATATGGTTGCTTTCA-3 ；P4 ：5-GCGCTCGAGTG-
CCTTCTTAATAGCT-3。
其中 P1，P2 用来扩增 nodD 基因 ；P3，P4 用
来扩增 lba 基因，下划线部分为酶切位点，阴影部
分为 His-tag 标鉴。以本实验室前期构建成功的费氏
中华根瘤菌工程菌株 DNA 为模板，通过 PCR 反应
扩增目的基因 nodD 和 lba。
1.2.2 原核表达载体的构建
1.2.2.1 表 达 载 体 pET-Plac-nodD-lba 的 构 建 利
用 Nco I 和 Sal I 两种限制性内切酶分别将从 E.coli
DH5α 中提取的质粒（pET-Plac）和 nodD 基因双酶
切处理后进行过夜连接，连接产物（pET-Plac-nodD）
转化 E.coli DH5α 感受态细胞后进行阳性克隆子筛选
（菌液 PCR）和双酶切验证。利用 Sal I 和 Xho I 两种
限制性内切酶将质粒（pET-Plac-nodD）和 lba 基因进
行双酶切后过夜连接，连接产物（pET-Plac-nodD-lba）
转化 E.coli DH5α 感受态细胞后进行阳性克隆子筛选
（菌液 PCR）和双酶切验证。
1.2.2.2 表 达 载 体 pTR-Plac-nodD-lba 的 构 建 质 粒
pTR102 能够在根瘤菌中稳定存在，但质粒 pTR102
上缺少 lac 启动子，所以需要从表达载体 pET-Plac-
nodD-lba 中将 lac 启动子及串联基因克隆下来再连入
质粒 pTR102 中。利用特异性引物（P5：5-CGCGGT-
ACCAGATCTAAACGCCTGG-3，P6 ：5-CGCGGTAC-
CCAAAAAACCCCTCAAGA-3）以重组质粒（pET-Plac-
nodD-lba）DNA 为模板扩增目的片段 Plac-nodD-lba，
目的片段中两个基因的末端均含有 His-tag。利用限
制性内切酶 Kpn I（下划线部分）分别对目的片段
Plac-nodD-lba 及质粒 pTR102 进行酶切反应后过夜连
接，连接产物（pTR-Plac-nodD-lba）转化 E.coli DH5α
感受态细胞后进行阳性克隆子筛选和双酶切鉴定。
1.2.3 构建转基因工程菌株 利用三亲本杂交的方
法构建工程菌株，其中供体菌为带有质粒 pTR102
和 pTR-Plac-nodD-lba 的 E.coli DH5α 菌株，辅助菌为
带有质粒 pRK2073 的 E.coli DH5α 菌株，受体菌为
费氏中华根瘤菌。辅助菌可以将供体菌质粒转移到
受体菌中，可得到转基因工程菌 SF（pTR102）和
SF（pTR-Plac-nodD-lba）。质粒 pTR102 中带有发光酶
基因 luxAB，并具有氨苄青霉素抗性（AmpR），所以
通过抗生素抗性筛选和发光酶活性检测可以筛选出
阳性的转基因工程菌株。
1.2.4 质粒遗传稳定性检测 挑取转基因工程菌株
的单菌落若干，分别接种于 YMA（AmpR）液体培养
基中 28℃培养 36 h，连续转接 10 次。每次转接前
取适量菌液涂于 YMA（AmpR）平板培养基上，对每
2013年第8期 121李珊珊等 ：导入 nodD-lba 串联基因的根瘤菌工程菌株的构建
次培养的菌落进行发光性检测。此试验是为了检测
自生条件下导入的质粒能否稳定存在并遗传。
将筛选出来的根瘤菌工程菌株进行液体培养基
扩培，扩培后的菌液接种大豆幼苗，光照培养 3-4
周后，取植株根瘤并用灭菌的刀片将根瘤切开，放
置于平皿中，向平皿中加入 1% 的癸醛溶液 50 μL，
观察根瘤发光结果。此试验目的是为了检测根瘤菌
与大豆植株共生条件下其质粒能否稳定存在并遗传。
1.2.5 根瘤菌工程菌株的 Western blot 鉴定 转基
因工程菌株中在导入的基因后端均含有 His-tag，所
以可利用组氨酸单克隆抗体对工程菌株的表达蛋
白进行 Western blot 鉴定。提取转基因工程菌株 SF
（pTR102），SF（pTR-Plac-nodD-lba） 的 总 蛋 白 进 行
Western blot 反应。
1.2.6 固氮酶活性检测 将大豆种子进行表面灭菌，
无菌水漂洗后浸泡，室温萌发 36 h。萌发后的幼芽
接种灭菌基质中培养，分别定期加入无氮营养液和
原始菌株及转基因工程菌株培养液。45 d 后取植株
根部根瘤，通过乙炔还原法测定根瘤固氮酶活性。
2 结果
2.1 nodD基因与lba基因的克隆
利用特异性引物，以本实验室构建成功的费氏
中华根瘤菌质粒 DNA 为模板，通过 PCR 扩增得到
目的基因 nodD 和 lba 编码区全长，琼脂糖凝胶电泳
检测结果如图 1 所示。
pTR-Plac-nodD-lba 经酶切后，可见两条特异性条带，
其大小与载体 pTR102 及目的片段 Plac-nodD-lba 的大
小一致。
1000
bp
M 1
5000
bp
M 2
M ：DL2000 DNA Marker ；1 ：nodD 基因的 PCR 产物 ；2 ：lba 基因的 PCR 产物
图 1 nodD 基因和 lba 基因 PCR 产物
琼脂糖凝胶电泳结果得到约 1 000 bp 和 500 bp
的两个条带，大小与目的片段 nodD 和 lba 相一致。
2.2 原核表达载体的构建
利用限制性内切酶 Kpn I 对原核表达载体 pTR-
Plac-nodD-lba 进行酶切验证，结果如图 2 所示。载体
15000
bp M1 M21
2000
bp
M1 ：DL15000 DNA Marker ；M2 ：DL2000 DNA Marker ；1 ：重 组 载 体 pTR-
Plac-nodD-lba 的酶切产物
图 2 重组载体 pTR-Plac-nodD-lba 的酶切鉴定
2.3 转基因菌株菌落发光酶活性的检测
由于转基因根瘤菌质粒 DNA 中含有 luxAB 发光
酶基因，可利用癸醛溶液对转基因工程菌株进行发
光性检测（图 3）。
A B
A ：SF（pTR102）菌落发光性检测结果 ；B ：SF（pTR-Plac-nodD-lba）菌落发
光性检测结果
图 3 转基因菌株菌落发光性检测结果
2.4 质粒稳定性检测结果
对转基因工程菌株 SF（pTR102），SF（pTR-Plac-
nodD-lba）连续转接 10 代，进行自生和共生条件下
质粒稳定性检测。表 1 结果显示，自生条件下，连
续转接 10 代的工程菌株的菌落发光性保持率均为
100%。可证明在自生条件下质粒能够稳定遗传。表
2 结果显示，共生条件下，接种转基因工程菌株的
大豆根瘤的发光率为 100%。可证明在共生条件下质
粒能稳定遗传。
2.5 转基因工程菌株的Western blot鉴定结果
提取菌株 SF（pTR102），SF（pTR-Plac-nodD-lba）
的总蛋白进行 Western blot 反应，结果（图 4）显示，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期122
与转空载体的对照菌株 SF（pTR102）比较，转基因
工程菌株 SF（pTR-Plac-nodD-lba）的蛋白杂交结果分
别在 40 kD 和 19 kD 处出现特异性条带为 NodD 蛋白
和 Lba 蛋白，可确定导入的两个串联基因能够正常
表达。
Lba㳻ⲭ
NodD㳻ⲭ43
kD
M 1 2
17
M ：蛋白 Marker ；1 ：SF（pTR-Plac-nodD-lba）总蛋白 ；2 ：SF（pTR102）总
蛋白
图 4 转基因根瘤菌的 Western blot 鉴定结果
2.6 固氮酶活性检测结果
大豆幼苗接种原始菌株和工程菌株 SF（pTR-
102），SF（pTR-Plac-lba），SF（pTR-Plac-nodD），SF
（pTR-Plac-nodD-lba），培养 45 d 后分别取大豆根瘤，
利用乙炔还原法进行固氮酶活性的测定。将测定结
果进行数据计算与分析，利用 SigmaPlot 软件作图，
结果（图 5）显示，根据乙炔还原法计算得到接种
各类菌株的固氮酶活性值依次为 78.639、80.342、
118.78、109.269 和 121.977。结果显示，接种转基
因工程菌株的大豆根瘤固氮酶活性高于接种原始菌
和转空载体菌株。转串联基因工程菌株大豆根瘤的
固氮酶活性比导入 lba 和 nodD 基因的工程菌株高出
4% 和 15.1%。
3 讨论
在对本研究所得到的基因工程菌株进行固氮酶
䍩∿ѝॾṩⱔ㧼
SF pTR102
SF pTR-Plac-lba
SF pTR-Plac-nodD
SF pTR-Plac-nodD-lba
140
120
100
80
60
40
20
0
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ᙗ n
m
ol
C
2H
4/g
/m
in
图 5 接种不同菌株的大豆根瘤固氮酶活性检测结果
活性测定时，得到的数据结果显示，转基因工程菌
株 SF（pTR-Plac-lba）和 SF（pTR-Plac-nodD-lba）的
固氮酶活性值比较接近。分析其原因可能是由于
nodD 基因属于结瘤相关基因，结瘤基因的主要功能
是共生关系早期过程信号分子的形成与交换，在根
瘤形成之后其表达会有所下降。而进行固氮酶活测
定的对象为根瘤，所以在根瘤形成后起主导作用的
可能是与固氮密切相关的基因 lba。Tajini 等［11］的
研究表明当大豆植株接种根瘤菌后，在缺 P 的环境
中也能提高固氮的效率。Rotaru 等［6］通过研究得出
若向培养环境中添加 P 和 Fe 元素能够提高大豆的固
氮效率并促进其生长，原因可能是由于 P 是能量传
递过程中的必须元素而 Fe 是固氮酶和大豆血红蛋白
的组成成分。本研究是将大豆血红蛋白基因 lba 和
结瘤相关基因 nodD 导入费氏中华根瘤菌中，构建出
高效固氮根瘤菌工程菌株。结合以上研究结果可以
设想本试验所构建出的基因工程菌株可能会在缺 P
和 Fe 元素的环境条件下保持或提高固氮效率，因为
本试验构建的基因工程菌株自身能够合成大豆血红
蛋白，能够弥补缺 Fe 所导致的大豆血红蛋白含量下
降，但其作用和结果有待进一步研究。
4 结论
将扩增出的结瘤基因 nodD 和大豆血红蛋白基
因 lba 以串联的方式连入载体质粒 pTR102 中，成功
构建了表达载体 pTR-Plac-nodD-lba。通过三亲本杂交
的方法将构建的载体导入费氏中华根瘤菌 15067 中，
对构建的工程菌株进行了发光酶活性检测证明载体
成功导入其中，导入的基因可正常表达。转基因工
程菌株 SF（pTR-Plac-lba）、SF（pTR-Plac-nodD）和 SF
（pTR-Plac-nodD-lba）均能够提高大豆根瘤的固氮酶
活性。利用分子手段改造大豆根瘤菌能够提高生物
表 1 自生条件下质粒的保持率
菌株
转接次数与质粒保持率（%）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
SF（pTR102） 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
SF（pTR-Plac-nodD-lba） 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
表 2 共生条件下根瘤的发光性检测结果
菌株 检测根瘤总数 发光根瘤总数 发光根瘤百分比（%）
SF（pTR102） 85 85 100
SF（pTR-Plac-nodD-lba） 93 93 100
2013年第8期 123李珊珊等 ：导入 nodD-lba 串联基因的根瘤菌工程菌株的构建
固氮的效率。
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（责任编辑 马鑫）