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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
柞蚕核型多角体病毒（Antheraea pernyi Nuclear
Polyhedrosis Virus，ApNPV）属杆状病毒科包涵体杆
状病毒亚科核型多角体病毒［1］，为柞蚕脓病的病原
体，是柞蚕的主要病害之一，可通过口服和体壁穿
收稿日期 ： 2012-12-18
基金项目 ：辽宁省自然科学基金项目（201102098）, 现代农业产业技术体系建设专项资金项目（ARS-22-02A）
作者简介 ：王林美，女，副研究员，研究方向 ：细胞培养与细胞生物学 ；E-mail ：wlm660925@126.com
通讯作者 ：李树英，研究员，研究方向 ：病毒分子生物学 ；E-mail ：shyli2002@yahoo.com.cn
柞蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹卵巢细胞感染性研究
王林美  岳冬梅  李树英  范琦  叶博  赵振军  张波
（辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，大连 116024）
摘 要： 研究柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）与宿主细胞相互作用及形态发生机制，以便更好地开发利用杆状病毒表达系统。
体外培养柞蚕蛹卵巢原代细胞，ApNPV 病毒悬液感染细胞，测定细胞感染率及半数组织培养感染剂量，应用倒置相差显微镜和电子
显微镜观察 ApNPV 感染后细胞的形态学变化。结果显示，ApNPV 感染柞蚕蛹卵巢细胞 5 d，倒置相差显微镜下观察即可发现细胞胀
大，细胞内有多角体病毒出现 ；感染 7 d，细胞内多角体病毒数量增多，细胞感染率为 40.2%，细胞上清液中无包涵体病毒（NOV）
效价滴度为 6.95×105 TCID50/mL。电子显微镜下观察到受病毒感染的细胞早期表现为细胞核膨大，而后核内出现病毒发生基质和
核衣壳，核衣壳获得套膜形成病毒束，发育为成熟的病毒粒子，众多病毒粒子同时封存在一个折光性强，具有蛋白质性质、直径
在 0.7-10 μm 的多角体中。得出结论，ApNPV 对柞蚕蛹卵巢细胞高度敏感，其在柞蚕蛹卵巢细胞内复制为典型的杆状病毒非同步
复制。
关键词 ： 柞蚕 核型多角体病毒 卵巢细胞 病毒感染
Study on Infection of Pupal Ovaries Cells of
Antheraea pernyi with ApNPV
Wang Linmei Yue Dongmei Li Shuying Fan Qi Ye Bo Zhao Zhenjun Zhang Bo
（Dalian Institute of Biotechnology，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Dalian 116024）
Abstract:  Mechamisms of interaction and morphogenesis of Antheraea pernyi somatic cells infected by Antheraea pernyi nuclear
polyhedrosis virus（ApNPV）were studied for the further development of baculovirus expression system. Pupal ovaries cells from Antheraea
pernyi were cultured in vitro followed by infection with Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus. Cells infecting rate and median tissue
culture infective dose were determined. Cellular morphology was observed by an inverted phase contrast microscope and a light microscope.
Results showed that, pupal ovaries cells were found expanding and nuclear polyhedrosis virus occurred in cells under the inverted phase contrast
microscope after 5-days infection. After 7-days infection, the quality of nuclear polyhedrosis virus was found increased, cells infecting rate
reached 40.2% and the titer of budded virus in cell supernatant was 6.95×105 TCID50/mL. An early sign of virus infection was enlargement of
nuclei, then virogenic stroma and nucleocapsids were observed within the nucleus, nucleocapsids were enveloped and formed to virus bundls
from the region between virogenic stroma and nuclear membrane, the well-developed virus were then enveloped into a strongly polarible
proteinaceous polyhedra with a diameter of 0.7-10 μm under the electron microscope. It proved that ApNPV was highly sensitive to pupal ovaries
cells and replicated asynchronously to form typical baculoviruses in the cells.
Key words:  Antheraea pernyi Nuclear polyhedrosis virus Ovaries cells Virus infection
刺两种途径传染，严重影响柞蚕生产［2］。ApNPV 的
宿主范围十分狭窄，具有高度的特异性［3］。目前，
对 ApNPV 的研究已达到基因水平，1992 年已经建
成柞蚕核型多角体病毒表达载体［4］，并利用 ApNPV
2013年第6期 173王林美等 ：柞蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹卵巢细胞感染性研究
表达载体在柞蚕蛹中成功地表达了绿色荧光蛋白［5］。
利用 ApNPV 宿主载体表达系统表达有用外源基因，
具有较大的研究价值和应用开发价值。本文对柞蚕
蛹卵巢细胞进行体外培养，利用 ApNPV 对该培养细
胞进行侵染研究，在细胞水平上阐明病毒—宿主间
特异性发病机制，为柞蚕脓病的防治和 ApNPV 载体
表达系统的应用奠定理论研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
柞蚕蛹品种为二化性青六号，母种级，购自
吉林省蚕业科学研究院。解除滞育后有效积温在
1-80℃ .d 阶段。
相差倒置荧光显微镜（Leica，德国）、超净工
作台（苏州苏净集团）、低速离心机（上海安亭科学
仪器厂）、细胞培养瓶及吸管（江苏江阴科学器材
公司）。MLM-45 培养基配方中所有组分均购自美国
Sigma 公司，胎牛血清（Fetal calf serum，FBS）购自
美国 Hyclone 公司，青链霉素混合液（青霉素、链
霉素各 10 000 单位 /mL）购自北京索莱宝科技有限
公司。
MLM-45 培养基配方组成见参考文献［6］ 。柞
蚕核型多角体病毒（以下简称 ApNPV）为本研究室
制备。
1.2 方法
1.2.1 柞蚕蛹卵巢细胞培养 柞蚕蛹经 75％的乙醇
体表消毒 15-20 min，用无菌蒸馏水洗涤 3 次，置于
无菌纱布或滤纸上吸干体表水分，用消毒眼科剪刀
和镊子取出卵巢于无菌的盛有 Corlson 缓冲液［7］的小
平皿中，剔除卵巢上粘连的脂肪组织和被膜等，采
用物理法将卵巢组织剪成 0.5-1 mm3 大小的组织块，
用灭菌吸管温和抽吸后，再用 200 目灭菌不锈钢
筛网过滤，800 r/min 离心 5 min，加 MLM-45 培养基，
并按体积比分别添加 20% 胎牛血清和 1% 青链霉素
混合液，按 1×106 mL-1 细胞密度接种于 25 mL 细胞
培养瓶（底面积为 17.5 cm2）中，置于 27℃生化培
养箱中静置培养，利用倒置相差显微镜每天观察细
胞生长情况，每隔 7 d 更换 1/2 培养液，当新生细胞
生长数量铺满细胞瓶单层时轻轻吹打细胞，按 1∶1
进行分瓶传代，以后根据生长情况做换液及传代
处理。
1.2.2 病毒悬液的制备 取解除滞育的柞蚕蛹体壁
穿刺接种 ApNPV 游离态病毒，置 18-20℃条件下孵
育，待发病后收集病蛹血淋巴，5 000 r/min 离心 10
min，收集上清液，以无血清 MLM-45 培养基进行 10
倍稀释，经孔径为 0.45 μm 微孔滤膜过滤除菌，所
得滤液即为病毒源。
1.2.3 ApNPV 对柞蚕蛹卵巢细胞感染率的测定 选
择生长贴壁良好的 F2 代柞蚕蛹卵巢细胞，接种 6
孔细胞培养板（底面积为 9.6 cm2），密度为 1×106
个 /mL，培养 24 h 完全贴壁后除去旧培养液，经无
血清 MLM-45 培养液洗 2 次。每孔加上述病毒悬液
0.1 mL，吸附 1 h 后除去病毒悬液，加 MLM-45 细胞
培养基，并按 20% 和 1% 体积比加入 FBS 和青链霉
素混合液，于 27℃静置培养，倒置相差显微镜下逐
日观察细胞变化，以细胞中出现多角体为阳性指标，
用血球计数板计数感染细胞数目，计算不同感染时
间细胞感染率。细胞感染率（%）= 感染细胞数 / 细
胞总数 ×100%。
1.2.4 半数组织培养感染剂量（50% Tissue Culture
Infection Dose，TCID50）的测定 收集生长良好的 F2
代柞蚕蛹卵巢细胞，按 5×105 个 /mL 密度接种于 96
孔细胞培养板，每孔细胞接种 0.2 mL，培养 24 h 后，
将新鲜待测的病毒悬液按 10 倍梯度稀释成 10-1、
10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 和 10-8 的 8 个 浓
度梯度，分别取不同浓度下的病毒悬液 0.1 mL 于
96 孔板培养的细胞中。所用细胞培养液为 MLM-45，
并加入 20% 和 1% 体积比的 FBS 和青链霉素混合液，
27℃静置培养，倒置相差显微镜下观察记录细胞感
染 7d 病变情况。以产生多角体为感染特征，记录感
染的细胞孔数，按 Reed-Muench［8］计算方法计算病
毒液的 TCID50。
1.2.5 透射电镜下病毒感染的观察 选择生长良好
的 F2 代柞蚕蛹卵巢细胞，按 1×10
6 个 /mL 密度接
种于 25 cm2 细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后，弃
去旧培养液。取上述制备的病毒悬液 1 mL 吸附细胞
1 h，弃感染病毒悬液，加每瓶加 2 mL MLM-45 培养
基，并按 20% 和 1% 体积比加入 FBS 和青链霉素混
合液，于 27℃静置培养。设 6 个时间组，每组 3 瓶
细胞，并设正常细胞对照，24 、48、72、96 、120
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期174
以及 144 h 后 800 r/min 离心 5 min 收集细胞，沉淀
用 2.5％戊二醛固定，置 4℃冰箱过夜。次日加 1％
锇酸再固定，按常规超薄切片法［9］，经梯度酒精脱水、
包埋、切片、染色，于 JEM-2000EX 透射电镜下观察。
电镜制片拍照由大连医科大学电镜室协同完成。
2 结果
2.1 细胞生长形态特征
在倒置显微镜下观察柞蚕蛹卵巢细胞，培养 24
h 可见大多数细胞呈悬浮状态，少数细胞贴壁，以
圆形和椭圆形为多，细胞内有较多颗粒；培养 3 d 后，
多数细胞贴壁，形成良好的细胞单层 ；培养 10 d 后，
细胞内颗粒基本消失，细胞变透明 ；培养 20 d 后，
细胞透明度增强，个别视野有新生细胞出现，形态
多为椭圆形和圆形，少数为梭形（图 1-A）。随着培
养时间的增加，新生细胞逐渐增多，40 d 开始第一
次传代，间隔 6 d 进行第二次传代（图 1-B），前 4
代细胞生长较快，细胞透明，大小均一，多数细胞
呈贴壁生长。
头所示），病毒感染率达 50% 以上（图 2-B），同时
出现感染细胞聚集成团的现象。倒置显微镜下观察
发现细胞密度大的地方病毒感染率也高。核内多角
体的数量以及形成多角体细胞的比率随培养时间的
递增而增加（图 3）。
100 μm A B
100 μm
A ：培养 20 d ；B ：培养 46 d（第 2 代）
图 1 用 MLM-45 培养基培养的柞蚕卵巢细胞生长状态
2.2 ApNPV感染柞蚕蛹卵巢细胞的病变观察
用上述制备的病毒悬液感染柞蚕蛹卵巢细胞，
呈现出典型的 NPV 感染的细胞病理变化。在倒置相
差显微镜下观察，细胞感染 48 h 内细胞无明显病变
症状，细胞形态、生长速度与正常细胞相当，接毒
后 72 h，可见细胞膜颜色变深，胞核略暗，细胞胀大。
此后，细胞增长停滞，感染 5 d 后，可观察到细胞
内有典型的多角体出现（图 2-A 箭头所示），细胞聚
集，核膜膨大，病毒感染率为 12.6%（图 2-A）。感
染 7 d 后细胞内多角体数目明显增多，逐渐充满整
个细胞，感染率为 40.2% ；感染 10 d 部分被感染的
细胞胞膜破裂，多角体释放于培养液中（图 2-B 箭
100 μm A B100 μm
A ：ApNPV 感染柞蚕蛹卵巢细胞 5 d ；B ：ApNPV 感染柞蚕蛹卵巢细胞 10 d
图 2 ApVPV 感染柞蚕蛹卵巢细胞形态变化
24
0
10
20
30
40
50
60
48 72 96 120 144 168 192 216 240ᝏḃᰦ䰤h
ᝏḃ
⦷%

图 3 不同作用时间 ApNPV 对柞蚕卵巢细胞的感染率
2.3 ApNPV的感染滴度测定结果
当接种 ApNPV 之后，柞蚕蛹卵巢细胞被感染，
感染 7 d 在显微镜下可观察到被感染的细胞核内充
满多角体，用血球计数板分别对不同感染梯度的阳
性细胞进行计数，结果表明，细胞上清液中无包涵
体病毒（NOV）效价滴度为 6.95×105 TCID50/mL。
2.4 电镜下观察ApNPV在柞蚕蛹卵巢细胞中的病
变情况
ApNPV 可在同源寄主——柞蚕蛹卵巢细胞内复
制，电子显微镜观察正常卵巢细胞，可见细胞质分布
均匀，核膜边缘光滑整齐，细胞核呈圆形或椭圆形，
核内染色质分布较均匀，核仁形状正常（图 4-A）。
ApNPV 感染 24 h，可见细胞核膨胀，染色质出现边
集，形成高电子密度不规则的染色块（图 4-B）。感
染 48 h，可见胞内染色质凝集成不规则的染色块散
2013年第6期 175王林美等 ：柞蚕核型多角体病毒对柞蚕蛹卵巢细胞感染性研究
在分布，核仁结构消失，核内形成高电子密度的病
毒发生基质（virogenic stroma，Vs）呈网状结构和密
集的颗粒状（图 4-C）。感染 72 h，观察到在电子密
度高的病毒发生基质边缘向周围空间萌发长短不一
杆状核衣壳（long nucleocapsid，LN），部分核衣壳
周围即刻形成套膜（envelope，E），部分则继续完
成套膜装配，核衣壳获得套膜的数量不同 ：一个核
衣壳可获得一个套膜，两个或两个以上核衣壳亦可
获得一个套膜。核衣壳获得套膜形成病毒束（virus
bundle，Vb）（图 4-D）。感染 96 h，病毒束发育成熟
为病毒粒子，形成雪花团状的前多角体（图 4-E）。
感染 120 h，可见成熟的病毒多角体形成，在一个典
型的多角体内，可见数目不等的病毒粒子被一个共
同的外套膜所包被，属于典型的多粒包埋型（multiple
embedded，ME），在多角体形成同时细胞核内仍可
见大量的病毒发生基质、杆状核衣壳及获得套膜的
病毒束存在（图 4-F）。感染 144 h，可见细胞核中充
满了成熟的多角体，多角体的形状呈三角形、四角
形、近圆形和多角形，大小差异较大，直径在 0.7-10
μm 之间，但同一个细胞核内的多角体形状和大小差
异不大（图 4-G）。在较晚的感染时期仍可观察到早
期复制形态，说明病毒复制不是同步的。
0.5 μm
0.5 μm
0.5 μm
a
b
c
d
A B C
0.5 μm
e
D
0.1 μm
i
G
0.05 μm
c
f
g
h
e
0.2 μm
f
E F
A ：正常柞蚕蛹卵巢细胞核，核内染色质分布均匀 ；B ：ApNPV 感染 24 h 染色质聚集于细胞核边缘 ；C ：ApNPV 感染 48 h 染色质聚集成染色块，
周围有病毒发生基质形成 ；D ：ApNPV 感染 72 h 病毒发生基质周围形成大量杆状核衣壳 ；E ：ApNPV 感染 96 h 形成前多角体 ；F ：ApNPV
感染 120 h 核内形成病毒多角体，可见病毒早期复制形态 ；G ：ApNPV 感染 144 h 成熟多角体形成 ；a ：核仁 ；b ：染色质 ；c ：病毒发生基质 ；
d ：染色块 ；e ：杆状核衣壳 ；f ：前多角体 ；g ：多粒包埋的多角体病毒 ；h ：病毒束 ；i ：多角体
图 4 电子显微镜下观察 ApNPV 感染柞蚕蛹卵巢细胞变化
3 讨论
较为典型的昆虫核型多角体病毒形态发生过
程，包括病毒发生基质的形成、核衣壳的形成、核
衣壳获得套膜和成熟的多角体形成 4 个主要阶段［10］。
ApNPV 在柞蚕蛹卵巢细胞内复制过程验证了这一
过程存在，昆虫核型多角体病毒对细胞感染率随培
养时间变化而变化，接种 ApNPV 5 d 在倒置显微镜
下观察细胞核内可见多角体形成，病毒感染 7 d 细
胞内多角体数量明显增多，病毒感染率在接种后
10 d 达最大，同时可见部分多角体释放于细胞培
养液中。这与 ApNPV 对柞蚕蛹卵巢细胞感染变化
与黏虫核型多角体病毒（Mythimna separate nuclear
polyhedrosis virus，MsNPV）［11］ 和蓖麻蚕核型多角
体病毒（Philosamia cynthia civini nuclear polyhedrosis
virus，Pcr NPV）［12］对同源寄主细胞感染情况相同，
随着感毒时间增加病毒感染率逐步提高。
感染病毒后借助于电子显微镜可观察到感染细
胞的核明显膨大，不同细胞的细胞核膨大的程度以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期176
及病毒复制的速度差别很大，感染 5 d 后，在同一
细胞核内同时存在有病毒发生基质、核衣壳、囊膜
材料、病毒束和多角体，即不同发育时期的形态结
构同时并存，这说明病毒的复制过程不是同步的，
而是随时复制随时装配的［13］。本文试验观察，在同
一个细胞的同一切面中，就能看到核型多角体病毒
不同发育时期的形态结构。
4 结论
柞蚕核型多角体病毒（ApNPV）对柞蚕蛹卵巢
细胞感染属同源病毒与宿主细胞间感染，该病毒对
柞蚕蛹卵巢细胞高度敏感。ApNPV 在柞蚕蛹卵巢细
胞内复制为典型的杆状病毒非同步复制。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）