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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-11-15
基金项目 : 转基因生物新品种培育科技重大专项（2011ZX08009-003）
作者简介 : 张盾 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物抗逆分子生物学 ;E-mail: jordan_dun23@sina.com
通讯作者 : 张凌云 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 植物抗逆分子生物学 ;E-mail: Lyzhang73@sohu.com
青杄均一化 cDNA文库构建及 EST序列分析
张盾 刘亚静 李长江 曹一博 张凌云
（北京林业大学 森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083）
摘 要： 以青杄花粉和针叶为材料，将青杄全长 cDNA 与 Gateway供体载体 pDONR222 重组，构建了其非剪切型全长 cDNA
原始文库，利用基因组 DNA 饱和杂交技术对原始 cDNA 文库进行均一化处理，构建青杄的均一化全长 cDNA文库。文库的总库容
量为 1.1×106 CFU/mL，平均插入片段长度大于 1.0 kb，重组率大于 95%。定量 RT-PCR 检测表明，青杄高丰度表达基因 EF1-α在
均一化 cDNA 文库中的表达量下降了约 41倍。接着对文库中随机的 5 144个克隆进行了测序，获得高质量的有效 EST（expressed
sequence tag）序列为 5 144条，经拼接共获得单一基因（unigene）为 2 717个，其中包括片段重叠群（contig）628个和单一 EST
序列（singlet）2 089个。NCBI同源比对分析表明，其中 1 887个序列 unigenes获得分子功能注释，这些 EST涉及细胞生长、信号
转导、转录、抗逆、能量代谢等功能。这些数据有助于对青杄的相关功能蛋白及分子机制开展进一步的研究。
关键词： 青杄 均一化 cDNA文库 EST序列分析
Construction of Normalized cDNA Library and Analysis of
Corresponding EST Sequences in Picea wilsonii
Zhang Dun Liu Yajing Li Changjiang Cao Yibo Zhang Lingyun
（Key Laboratory o f Forest Silviculture and Conservation of Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083）
Abstract: The primary full-length cDNA library was constructed with the pollen and needles of Picea wilsonii using recombination
of the full-length cDNAs with the Gateway donor vector of pDONR222. The plasmids of the primary cDNA library were normalized through
self-subtraction with the Picea wilsonii a genome DNA, and the normalized full-length cDNA library was constructed using the subtracted
plasmids. The normalized full-length cDNA library had a total CFU of 1.1×106 CFU/mL. The average size of inserted cDNAs was 1.0 kb with
a recombination of about 100%. Quantity RT-PCR results demonstrated that normalization produced about 41 folds average reduction of a high
abundant gene EF1-α. A high-quality normalized full-length cDNA library was successfully constructed, and 5 144 of random clones in this
cDNA library were then sequenced. A total of 5 144 ESTs （expressed sequence tag） were attained, and could be assembled into 2 717 unigenes,
including 628 contigs and 2 089 singlets. These genes were found to be involved in the multiple biological process including cell development,
signal transport, transcription, stress tolerance response and energy metabolism. The ESTs presented here provide a valuable resource for further
investigation on functions and molecular mechanisms of similar proteins in Picea wilsonii.
Key words: Picea wilsonii Normalized cDNA library Expressed sequenced tags analysis
青杄云杉（Picea wilsonii Mast.）别名青杄，是
云杉属中分布较为广泛的树种之一，为我国特有树
种，在园林绿化上具有较高的推广价值。在我国最
先开展的是青杄育苗栽培上的研究［1, 2］，随着近些
年细胞生物学和分子生物学的高速发展，对于青杄
的研究也有了质的飞跃。体细胞胚胎的培养填补了
青杄无性繁殖的空白［3, 4］。在生殖生长方面，也逐
渐形成了蛋白酶泛素途径［5-7］、细胞骨架［8, 9］以及
钙离子梯度［10, 11］调控花粉管发育的机制。但相比
较被子植物而言，裸子植物花粉管发育调控的机制
仍处于基础阶段，且在青扦抗逆、生长发育机制、
信号转导等方面分子生物学研究甚少。如今，构建
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期72
cDNA 文库并进行大规模测序（EST）是发现新基因
和研究基因表达的有效方法［12］。
本研究在构建青杄花粉和针叶混合 cDNA 文库
的基础上，进行 cDNA 克隆 5端单向测序，而后对
所获得的 EST 序列进行生物信息学分析，并与蛋白
数据库和核酸数据库中序列信息进行比对分析，从
总体上了解青杄基因的表达情况，旨在为进一步的
青杄花粉管生长和抗逆功能基因筛选提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料及处理 供试材料为青杄（Picea wilsonii）
成熟花粉和针叶，于 2010 年采自于中科院植物所北
京植物园。将花粉在室温下自然晾干，贮藏于 -20℃
冰箱。针叶采集后迅速置于液氮中速冻，然后转移
至 -80℃超低温冰箱保存备用。
青杄花粉体外萌发 ：将贮存于 -20℃冰箱的花
粉转移至 4℃复苏 12 h，再转移到室温继续复苏 2 h。
将复苏后的花粉置于液体培养基中，室温（25±1）℃
萌发。培养基成分：12% 蔗糖，0.03% 硝酸钙，0.01%
硼酸，5 mmol/L 柠檬酸－磷酸缓冲液，pH5.8。分别
在青杄花粉培养 0、6、12、18 和 24 h 取样。
1.1.2 主要试剂 Trizol RNA 抽提试剂、FastTrack
2.0 Kit、GeneRacer Kit、CloneMiner II cDNA Library
Construction Kit、SuperScript III 逆转录酶、T4 DNA
连接酶、Platinum Taq DNA 聚合酶、pDONR222 载
体及 1 kb DNA ladder 均为美国 Invitrogen 公司产品。
其他化学试剂均为进口试剂或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取及 mRNA 分离 分别将不同时
期的青杄花粉和幼嫩针叶在液氮中研磨成粉，而后
采用美国 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取总 RNA，
用测定仪测定总 RNA 在 260 和 280 nm 处的吸光值，
并用 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的纯度和完整
性。等量混合不同时期花粉和针叶总 RNA 后，按照
FastTrack 2.0 Kit说明书中的方法进行mRNA的分离。
1.2.2 青杄全长 cDNA 文库的构建 根据 Invitrogen
公 司“CloneMiner cDNA Library Construction Kit” 试
剂盒构建 cDNA 文库。将 SuperScript III 等试剂加
入 mRNA 反转录合成一链，再将 E. coli DNA Ligase、
E. coli DNA Polymerase I、E. coli RNaseH 等 试 剂 加
入合成第二链 ；之后将 attB1 接头连接到双链 cDNA
上。按照说明书操作，利用试剂盒提供的含有 1 mL
Sephacryl S-500 HR 树脂的色谱柱将 cDNA 分级。
将 BP Clonase Enzyme Mix 和 pDONR222 载体加
入 150 ng 分级后合适大小片段的 cDNA 中进行 BP
重组反应。再产物电击转化入大肠杆菌 DH10B 感受
态细胞。37℃ 250 r/min 培养 1 h，加入冷冻培养基
（含 40% 甘油的 SOC 培养基），液氮速冻，-80℃保存，
即为构建的青杄花粉和针叶的 cDNA 初级文库。
1.2.3 文库均一化 提取青杄基因组 DNA 180 g，分
成两份分别对其用 Hind III 和 EcoR I 酶切，纯化回
收并用 Klenow Fragment 补平，并加入 d-UTP-Biotin
作为标记 ；之后将 Hind III 酶切过的产物用 EcoR I
继续酶切，之后产物用 Hind III 继续酶切；接着将处
理好的基因组 DNA 与 Dynal 磁珠（Dynabeads® M-280
Streptavidin）进行亲和体系构建。将用 PureLinkTM
HQ Mini Plasmid DNA Purification Kit 抽提的 cDNA 文
库混合质粒加入上述步骤中构建的亲和体系中进行
杂交和洗脱，得到均一化后的质粒。取 2 μL 质粒
电转化感受态细胞 DH10B，获得转化细菌液，得到
青杄均一化全长 cDNA 文库，加入甘油至终浓度为
20%。经液氮速冻后，于 -80℃冰箱中保存。
1.2.4 均一化 cDNA 文库的质量鉴定 取转化后细
菌原液 10 μL 稀释 1 000 倍，再取 50 μL 均匀涂布
在含 Kan 60 μg/mL 的 LB 固体平板上，37℃过夜培
养后统计克隆子数量，计算文库库容。平均滴度计
算方法为 ：（每皿克隆数 × 稀释倍数）/ 涂皿量 ；
库容计算方法为 ：平均滴度 × 文库总体积。随机
挑取 32 个克隆进行菌落 PCR 扩增。根据载体设计
引 物 ：上 游 5-TCCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-
ACGGCCAGTCTT-3，下游 5-AGAGCTGCCAGGAAA-
CAGCTATGACCATGTAATACGACTC-3。PCR扩增程序
为 ：94℃ 4 min ；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，
28 个循环 ；72℃ 10 min。PCR 扩增产物经 1% 琼脂
糖凝胶电泳，检测重组克隆插入片段大小及重组率。
文库重组率为有 cDNA 插入片段的克隆数与随机所
选克隆数的比值。
1.2.5 青杄 cDNA 文库的均一化效果分析 通过
定量 RT-PCR 的方法，分别以均一化前后的文库混
2012年第6期 73张盾等 ：青杄均一化 cDNA 文库构建及 EST 序列分析
合质粒作模板，对青杄中 2 个已知高丰度表达基
因 EF1-α 进行分析，比较均一化前后 cDNA 文库
中 EF1-α 拷贝数的变化，检测文库的均一化效果。
EF1-α 基因的扩增引物为：上游 P1：5-AACTGGAGA-
AGGAACCCAAG-3，下游 P2 ：5-AACGACCCAATG-
GAGGATAC-3。
1.2.6 cDNA 文库 EST 序列分析及基因功能注释
将文库菌液涂布直径 15 cm 平板，37℃过夜培养，
将单克隆挑取入 96 孔板培养 8 h，用质粒抽提试剂
盒提取质粒，然后送北京英潍捷基公司测序，使用
ABI3730XL 测序仪。采用 cDNA 克隆 5端测序，测
序引物 ：pdonr222F ：5-TCCCAGTCACGACGTTGTA-
AAACGACGGCCAGTCTT-3。通过 phred 程序读取峰
图文件，使用 phd2fasta 程序获得 FASTA 格式序列
文件，去除载体或重复序列，采用 Cross_match 程序；
聚类采用 BLASTclust 程序、拼接采用 Phrap 程序。
利用 BLASTX 程序与 NCBI 蛋白质 NR 数据库比对
（E-value cut-off = 1e-5），了解所获得序列的大致功能。
通过 Goanna（2006）获得 Gene Ontology 注释，从生
物学过程（Biological Processes）、分子功能（Molecular
Function）和细胞组分（Cellular Components）3 个本
体上获得基因功能概貌。
2 结果
2.1 总RNA的提取
从青杄花粉和针叶提取的总 RNA 经分光光度计
测定，OD260/OD280 分别为 1.86 和 1.98，1% 琼脂糖凝
胶电泳检测显示，28S 和 18S rRNA 条带清晰（图 1），
说明总 RNA 结构完整性良好，可满足 cDNA 文库构
建需要。反转录后 cDNA 双链（图 2）表明，整个
cDNA 呈弥散状，分子量主要集中在 0.4-5.0 kb。由
此看出，反转录后的 cDNA 能保证青杄基因的完整
性，可用于构建青杄花粉与针叶的全长 cDNA 文库。
2.2 均一化cDNA文库的构建和质量鉴定
经滴度检测，青杄花粉均一化文库容量为
1.1×106 PFU/mL。随机挑选 32 个克隆进行 PCR 扩
增，重组率为 100%，电泳检测结果（图 3）表明，
文库插入片段大小为 800-2 000 bp 左右。
2.3 青 全长cDNA 文库的均一化效果检测
通过定量 PCR 方法，分别提取均一化前后的文
1. 花粉 ；2. 针叶
图 1 青杄总 RNA琼脂糖凝胶电泳检测图
M. 12 kb DNA 分子量标准 ；1. 青杄双链 cDNA
图 2 双链 cDNA琼脂糖凝胶电泳
M. 12 kb DNA 分子量标准 ；1-32. 插入 cDNA 片段的 RT-PCR 扩增产物
图 3 青杄全长 cDNA文库克隆插入 cDNA
片段的 PCR检测
库混合质粒作扩增模板，检测青杄中已知高丰度表
达基因 EF1-α 转录本拷贝数比例的变化。定量 PCR
反应组成及结果，如表 1 所示。相对于均一化前后
同一质粒模板浓度，EF1-α 的拷贝数在均一化处理
后的青杄全长 cDNA 文库中下降了 41 倍左右。青杄
全长 cDNA 文库的均一化处理，将文库中 EF1-α 的
cDNA 所占的比例降低。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期74
表 1 青杄均一化前后 cDNA文库中 EF1-α的拷贝数分析
基因 均一化前文库
质粒（CT）
均一化后文库
质粒（CT）
ΔCT 降低倍数
EF1-α 18.09 23.45 5.36 41
2.4 EST测序及序列分析
cDNA 文库中随机挑取克隆进行测序。通过初
步的诸如去载体序列、重复序列等处理后，共获得
5 144 条有效的 EST 序列。对所测得的 EST 序列进
行聚类分析及拼接后，共获得 2 717 个非重复序列
（unigene），其中包括 628 个重叠群（contig），2 089
个单条序列（singlet），低丰度基因约占 unigene 总
数的 76.9%，文库的冗余度较低。Unigene 序列的
长度主要集中在 500-1 000 bp（图 4），碱基最长的
EST 序列的长度为 2 586 bp。
2.5 EST序列功能注释和分类
2.5.1 EST 序列与蛋白质 NR 库比对结果 2 717 图 4 EST序列长度分布图
个 unigene 中共有 1 887 条序列获得注释，占总
unigene 的 69.5%，部分基因同源比对结果，见
表 2 ；其余 830 个没有明显的同源性被鉴定为未
知基因，即为新发现的基因，约占 unigene 总数的
30.5%。这说明青杄功能基因的研究有待进一步的
开展。
表 2 部分与已知功能基因同源的青杄文库 ESTs
克隆号 长度（bp） 推测蛋白 同源物种 分值 相似性（%）
Contig 23 450 热激蛋白 芜青（Brassica rapa） 1 157 73
Contig 83 861 NF-YC 转录因子 青杄（Picea wilsonii） 1 094 100
Contig 183 185 晚期胚胎发育蛋白 白云杉（Picea glauca） 469 99
Contig 221 241 NADH 脱氢酶 蓖麻（Ricinus communis） 614 76
Contig 273 218 MtN19-like 蛋白 豌豆（Pisum sativum） 555 62
Contig 326 393 热激蛋白 大豆（Glycine max） 1 010 95
Contig 394 284 SCF 泛素连接酶 挪威云杉（Picea abies） 726 98
Contig 417 189 细胞色素 C 合成蛋白 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 480 52
Contig 501 838 α- 微管蛋白 蓖麻（Ricinus communis） 2 164 96
Contig 596 364 短链脱氢酶 蓖麻（Ricinus communis） 935 75
S 806 270 钙调蛋白 日本柳杉（Cryptomeria japonica） 690 89
S 3808 232 Mg 离子螯合酶 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 591 60
S 137 202 MYB12 转录因子 非洲菊（Gerbera hybrid cultivar） 513 57
S 234 303 氧化还原酶 蓖麻（Ricinus communis） 775 72
S 625 171 ATP 结合蛋白 蓖麻（Ricinus communis） 434 45
S 1990 787 过氧化物还原蛋白 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 428 61
S 1960 261 己糖激酶 甜橙（Citrus sinensis） 667 69
S 1093 802 AP2 ERF 转录因子 拟南芥（Arabidopsis thaliana） 170 81
S 2455 218 果胶酯酶 蓖麻（Ricinus communis） 554 55
2.5.2 EST 序列的 GO 注释及分类 通过 Goanna 注
释后，我们构建了该文库的 GOslim，并用图形表示
其相对分布比例。从生物学途径看（图 5），新陈代
谢（45%）和细胞进程（37%）占绝大部分 ；从分
2012年第6期 75张盾等 ：青杄均一化 cDNA 文库构建及 EST 序列分析
明其纯度和完整性高，完全符合建库的要求。
如今构建 cDNA 文库的方法较多，前人也做了
大量的研究。相比之下，Gateway 技术无需限制酶切、
连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何 Gateway
化的表达载体间，并保证正确的方向和阅读框，特
别适合研究基因在不同表达系统中的表达。且成功
重组的载体由于仍然具有致死基因 ccd B 而使得普
通大肠杆菌无法生长［13］，从而降低了假阳性的菌株，
为后期的筛选工作节省了时间。基于接下来的研究，
我们选用 Gateway 技术构建 cDNA 文库。
3.2 cDNA文库均一化
均一化 cDNA 文库是克服基因转录水平上巨大
差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利
于研究基因的表达和序列分析。当今构建均一化的
cDNA 文库中至少有两种主要观点 ：一种是基于复
兴动力学的原理，高丰度的 cDNA 在退火条件下复
性的速度快，而低丰度的 cDNA 复性时间要长，可
以通过控制复性时间来降低丰度 ；另一种是通过基
因组 DNA 饱和杂交的原理将 cDNA 文库进行均一化
的理论［14, 15］。本研究采用第二种方法，因其易于掌
握且适于大规模基因的发掘。对于极低表达丰度的
基因而言，虽然相对于固定的基因组 DNA 亲和体系
仍不足以饱和杂交，但从本研究大规模测序的结果
可以看出，单一序列已经占了 76.9%，且高丰度基
因 EF1-α 拷贝数下降了 41 倍，满足均一化的要求，
所构建的混合文库适合大规模的测序。
3.3 ESTs的获得和分析
EST 技术被认为是一种从基因文库中快速获
得基因组中的未知特征基因表达和编码序列的方
法［16， 17］。通过对青杄文库 EST 序列的功能注释及分
类，得到了大量参与青杄生长发育的功能基因。其
中包括 α-微管蛋白、钙调蛋白、果胶酯酶等与花粉
发育密切相关的蛋白。 α-微管蛋白参与青杄花粉管
发育。在信号传递途径中，Ca2+ 是重要的第二信使，
钙调素相关蛋白是细胞内主要的 Ca2+ 受体，在 Ca2+
介导的各种细胞反应过程中充当中间媒介，通过与
细胞内多种酶或蛋白质结合从而调节细胞生理生化
过程［18］。我们也发现了热激蛋白、晚期胚胎发育蛋
白等功能蛋白，这些基因在青杄生长的高海拔、低
子功能上说（图 6），催化活性（44%）和结合活性
（45%）占绝大部分 ；从细胞定位看（图 7），集中在
质膜上（27%）、细胞器（28%）以及核（14%）内。
图 7 功能注释基因的 GO分类中细胞分布分类
图 6 功能注释基因的 GO分类中分子功能分类
图 5 功能注释基因的 GO分类中生物途径分类
3 讨论
3.1 cDNA 文库的构建
本试验采用 Trizol 方法提取的总 RNA 无蛋白和
其他杂质污染，琼脂糖凝胶电泳显示 28S rRNA 和
18S rRNA 的条带清晰，且亮度比值为 2 1 以上，说
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期76
温湿润的环境中起着重要作用，也是青杄适应其环
境的重要蛋白。研究表明，热激蛋白对植物抗冻性
起到了极其关键的作用［19］。LEA 基因也在植物受
到干旱、低温和盐渍等环境胁迫后造成脱水的营养
组织中有所表达［20］。此外，也有 MYB、zine finger、
ERF 等一些转录因子，它们能够在胁迫下强烈诱导，
并诱发其调控的下游功能基因表达，进而使植物增
强抵御外界逆境的能力［21］。
4 结论
通过 Gateway 方法构建青杄针叶和花粉的均一
化 cDNA 文库，建立其基因资源，通过 ESTs 测序和
与已知功能基因蛋白同源性分析，对青杄的花粉管
发育基因特性及与适应环境相关的功能蛋白进行了
初步探讨。青杄 cDNA 文库共获得 1 887 个 unigene
注释结果，但仍有大量基因产物的功能不清楚，即
使功能已知的蛋白质，对于其作用方式、作用机制
及与其他蛋白或基因的关系还都有待进一步的研究。
参 考 文 献
［1］ 庄道德 . 云杉喷灌全光育苗试验 . 四川林业科技 , 1981（4）:
29-30.
［2］ 许家春 , 邵海燕 , 李殿波 , 等 . 优良绿化树种青扦云杉引种栽培
技术 . 中国林副特产 , 2004（3）: 24-25.
［3］ 刘春朝 , 王玉春 , 欧阳藩 , 等 . 青杄胚性愈伤组织悬浮培养动力
学及体细胞胚胎发生 . 西北植物学报 , 1998, 18（2）: 155-159.
［4］ 杨映根 , 桂耀林 , 唐巍 , 等 . 青杄愈伤组织在继代培养中的分化
能力及染色体稳定性研究 . 植物学报 , 1994, 36（12）: 934-939.
［5］ Kong L, Wang M, Wang Q, et al. Protein phosphatases 1 and 2A and
the regulation of calcium uptake and pollen tube development in
Picea wilsonii. Tree Physiol, 2006, 26（8）: 1001-1012.
［6］ Sheng X, Hu Z, Lu H, et al. Roles of the ubiquitin/proteasome
pathway in pollen tube growth with emphasis on MG132-induced
alterations in ultrastructure, cytoskeleton, and cell wall components.
Plant Physiol, 2006, 141（4）: 1578-1590.
［7］ Sheng X, Dong X, Zhang S, et al. Mitochondrial dynamics and its
responds to proteasome defection during Picea wilsonii pollen tube
development. Cell Biochem Funct, 2010, 28（5）: 420-425.
［8］ Yu Y, Li Y, Li L, et al. Overexpression of PwTUA1, a pollen-specific
tubulin gene, increases pollen tube elongation by altering the
distribution of alpha-tubulin and promoting vesicle transport. J Exp
Bot, 2009, 60（9）: 2737-2749.
［9］ Zheng M, Wang Q, Teng Y, et al. The speed of mitochondrial
movement is regulated by the cytoskeleton and myosin in Picea
wilsonii pollen tubes. Planta, 2010, 231（4）: 779-791.
［10］ Chen K, Wu G, Wang Y, et al. The block of intracellular calcium
release affects the pollen tube development of Picea wilsonii by
changing the deposition of cell wall components. Protoplasma,
2008, 233（1-2）: 39-49.
［11］ 李玲俐 , 张凌云 . 青杄花粉管生长过程中囊泡运输与 Ca2+ 分
布的细胞学研究 . 电子显微学报 , 2010, 29（2）: 163-166.
［12］ 史成颖 , 宛晓春 , 江昌俊 , 张正竹 . 茶苗嫩根 cDNA 文库的构
建和 EST 分析 . 南京农业大学学报 , 2009, 32（1）: 126-130.
［13］ Bernard P, Couturier M. Cell killing by the F plasmid ccd B protein
involves poisoning of DNA-toppisomerase Ⅱ complexes. Molecular
Biology, 1992, 226（3）: 735-745.
［14］ Weissman SM. Molecular genetic techniques for mapping the
human genome. Mol Biol Med, 1987, 4（3）: 133-143.
［15］ Bonaldo MF, Lennon G, Soares MB. Normalization and subtraction:
Two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res, 1996, 6:
791-806.
［16］ Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, et al. Complementary DNA
sequencing: expressed sequence tags and human genome project.
Science, 1991, 252（5013）: 1651-1656.
［17］ 周祥明 , 张冰玉 , 苏晓华 , 等 . 美洲黑杨雄性花芽 cDNA 克隆
测序及表达序列标签（ESTs ）特性分析 . 林业科学 , 2006, 42
（11）: 37-41.
［18］ Zhu JK. Cell signaling under salt, water and cold stresses. Curr
Opin Plant Biol, 2001, 4（5）: 401-406.
［19］ 郭九峰 , 孙国琴 , 沈传进 , 等 . 沙冬青 cDNA 文库的构建和
EST 分析 . 华北农学报 , 2007, 22（4）: 37-41.
［20］ Dure LⅢ, Greenway SC, Galau GA. Developmental biochemistry
of cotton seed embryo genesis and germination: changing mRNA
population as shown in vitro and in vivo protein synthesis.
Biochemistry, 1981, 20（14）: 4162-4168.
［21］ Kagaya Y, Hobo T, Murata M, et al. Abscisic acid-induced transc-
ript ion is mediated by phosphorylation of an abscisic acid response
element binding factor, TRAB1. Plant Cell, 2002, 14（12）:
3177-3189.
（责任编辑 马鑫）