全 文 ：福建农林大学学报( 自然科学版) 第 41 卷 第 1 期
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition) 2012 年 1 月
收稿日期: 2011 － 08 － 15 修回日期: 2011 － 10 － 20
基金项目:福建省科技厅资助项目( 2009N0006、2011N5002) ．
作者简介:吴幼容( 1974 － ) ，女，博士研究生．研究方向:园林植物与观赏园艺．通讯作者郑郁善( 1960 － ) ，男，教授，博士生导师．研究方向:
园林植物与观赏园艺．
观音竹盐胁迫均一化全长 cDNA文库
的构建与 EST测序分析
吴幼容，潘 瑞，郑郁善
( 福建农林大学竹类研究所，福建 福州 350002)
摘要: 将 DSN ( duplex-specific nuclease) 均一化技术与 SMART ( switching mechanism at 5end of RNA transcript) 建库技术相
结合，构建观音竹( Bambusa multiplex var． riviereorum)盐胁迫幼叶的均一化 cDNA文库．经检测该原始文库滴度为 1．7 ×106 cfu·
mL －1，文库重组率达 97%，插入片段的平均长度为1．5 kb．同时对文库中随机的600个单克隆进行测序，获得543个非重复序列，包
括 30个片段重叠群和 513个单基因;文库冗余率为 5．4% ．表明观音竹盐胁迫幼叶均一化全长 cDNA文库构建成功．
关键词: 观音竹; 均一化; 全长 cDNA文库; 盐胁迫; EST
中图分类号: S795．9 文献标识码: A 文章编号: 1671-5470( 2012) 01-0063-05
Construction and EST analysis of normalized full-length cDNA
library of Bambusa multiplex var． riviereorum
WU You-rong，PAN Rui，ZHENG Yu-shan
( Institute of Bamboo Research，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002，China)
Abstract: A normalized full-length cDNA library of the young leaf of Bambusa multiplex var． riviereorum was established by the
method of DSN ( duplex specific nuclease) normalization and SMART ( switching mechanism at 5end of RNA transcript) ． The titer
of unamplified cDNA library was about 1．7 × 106 cfu·mL －1 ． The average size of cDNA inserts was 1500 bp with the recombination
rate of 97% ． Meanwhile a total of 543 unigenes were attained，including 30 contigs and 513 singltons by sequencing and analyzing
600 cDNA clones of normalized cDNA library． These results indicated that the normalized full-length cDNA library was established
successfully．
Key words: Bambusa multiplex var． riviereorum; normalization; full-length cDNA library; salt stress; EST
竹子是属于禾本科( Gramineas) 竹亚科 ( Bambusadea) 植物． 全世界竹类植物有 107 个属，1300 多个
种［1］，其中观赏竹就有 150 余种［2］．观赏竹形态优美，四季常青，生长周期短，生态适应性强，发达的鞭根
系统具有很强的水土保持功能，净化空气效果良好．因此，观赏竹成为园林绿化中不可缺少的组成部分．观
音竹( Bambusa multiplex var． riviereorum) 是观赏竹种之一．
周明兵等［3］构建了小佛肚竹正常杆笋和畸形杆笋 cDNA 文库，探究小佛肚竹杆形变异的分子机理;
Lin et al［4］成功构建了绿竹的花芽及笋的 cDNA文库并对测序的 EST进行分析，从而断定竹子可能有自己
独特的开花基因; Kuo et al［5］利用绿竹笋的悬浮培养细胞 cDNA文库克隆到了 1 个 classⅢ几丁质酶; Chiu
et al［6］从黄化的绿竹笋 cDNA文库中筛选到了 BoSus1、BoSus2、BoSus3、BoSus4 四个蔗糖合成酶基因．这些
常规 cDNA文库的不足之处在于高丰度表达基因转录本的存在极大地影响了细胞中低水平表达基因或稀
有基因转录本的检测．而构建均一化 cDNA文库( normalized cDNA library) 是克服基因转录水平差异的有
效措施．高质量的均一化 cDNA文库中高、低丰度基因出现的频率基本一致，这为文库筛选及大规模测序
带来便利［7 － 13］．迄今仅 Gao et al［14］构建了麻竹幼叶的均一化 cDNA文库，并对其进行测序分析．其他竹种
尚无相关研究报道．笔者拟以经 NaCl处理的观音竹幼叶为材料，通过 DSN 均一化技术与 SMART 建库技
术构建均一化全长 cDNA文库，并对文库进行 EST测序及分析，为耐盐相关基因的全长 cDNA及功能基因
DOI:10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2012.01.020
组研究奠定基础．
1 材料与方法
1．1 供试材料
试验材料为福建华安竹种园的 1 年生观音竹幼苗，移植于塑料钵( 沙子与黄泥土各占 1 /2) 中，每盆栽
2 株，温室培养; 8 周后，选择长势相近、生长旺盛、无病虫害的竹苗进行不同浓度 NaCl( 质量分数分别为
0．1%、0．3%、0．5%、0．8% ) 胁迫;分别在不同胁迫时间( 第 5、9、13、17、21、25 天) 摘取竹叶进行各项生理
指标的测定和分析，以确定观音竹耐受的临界盐浓度与胁迫时间．用 0．5% NaCl 胁迫观音竹苗 11 d 后采
幼叶，并将其迅速投入液氮中，存于 － 80 ℃超低温冰箱备用．
1．2 总 RNA的提取
采用改良的 Trizol法提取总 RNA，经 1% ( 质量分数) 琼脂糖凝胶电泳后采用紫外分光光度法测定总
RNA的浓度与纯度．
1．3 全长 cDNA的合成
采用 Creator SMART cDNA Library Constrution Kit ( Clontech) ，逆转录产物采用半透膜回收后，采用
AdvantageTM PCR Kit扩增全长 cDNA，全长 cDNA采用半透膜回收，用于均一化处理．
1．4 全长 cDNA的均一化处理
采用 Trimmer Direct cDNA normalization Kit ( Evrogen) 和 0、1 /4、1 /2 U 的 DSN( Duplex-specific Nucle-
ase) 处理全长 cDNA; 采用 AdvantageTM PCR Kit 扩增均一化全长 cDNA，确定最佳的 DSN 处理浓度和 LD-
PCR的最佳循环数．采用 AdvantageTM PCR Kit大量扩增均一化全长 cDNA．
1．5 均一化全长 cDNA原始文库的构建
采用 Creator SMART cDNA Library Constrution Kit ( Clontech) 方法进行 PCR 产物的处理和克隆，克隆
载体为含 Sfi1 位点的定向克隆载体 pBlueScriptⅡ( 由加拿大 Bio S ＆ T公司俞长河博士赠送) ，感受态细胞
为 DH10B ( invitrogen) ;转化方法为电转化，转化产物经 37 ℃、200 r·min －1培养 1 h 后，加入高压过的甘
油至终浓度为 25%，即为均一化全长 cDNA原始文库;菌液用液氮速冻后，置于 － 80 ℃保存．
1．6 均一化全长 cDNA文库质量的检测
将 10 μL初级文库菌液稀释 1000 倍，取其中 50 μL涂布于 Amp + X-gal LB固体培养基上，37 ℃过夜，
计算蓝白菌落数量、文库的滴度与重组率．文库重组率 = ( 菌落总数 －蓝斑数) /菌落总数．从平板中随机
挑取 18 个单克隆进行菌落 PCR 验证，以确定文库插入片段大小．随机挑取 600 个含插入片段的克隆子，
以 M13R为测序引物，送上海 MAP生物技术有限公司测序．对获得的序列( EST) 采用 Blast( http: / /blast．
ncbi． nlm． nih． gov /Blast) 与水稻、玉米、高梁 3 个作物的基因库进行库内同源性比对，并用 WEGO( http: / /
wego． genomics． org． cn /cgi-bin /wego) 进行功能分类．
2 结果与分析
2．1 总 RNA的提取
采用紫外分光光度法检测观音竹幼叶总 RNA，结果( 图 1A) 表明，D260 nm与 D280 nm的比值为 1．9，D260 nm
与 D230 nm的比值为 1．89，说明所提的总 RNA纯度好;另经 1% ( 质量分数) 琼脂糖凝胶电泳检测显示 2 条清
晰条带( 28SrRNA与 18SrRNA) ，且亮度比约为 2∶ 1，进一步说明所提总 RNA 基本无降解，质量较好，满足
后续建库要求．
2．2 双链 cDNA的合成
反转录的 cDNA经 LD-PCR 扩增，其产物电泳检测( 图 1B) 显示扩增片段为 500 － 3000 bp，呈均匀弥
散带;有 4 条大小约 800、1000、1800 和 2000 bp的主带，这些主带代表 cDNA文库中的高丰度基因．表明不
同大小与丰度的 mRNA都获得了有效的反转录与扩增．
2．3 均一化效果检测
双链 cDNA经 0、1 /4、1 /2 U DSN酶均一化及 2 次 PCR扩增后的电泳图( 图 1C) 显示:以 1 /2 U的 DSN
·46· 福建农林大学学报( 自然科学版) 第 41 卷
酶均一化处理后高丰度基因的亮带消失，呈均匀弥散条带，大小为 1 － 3 kb．表明高丰度基因的丰度明显下
降，且 cDNA大小无明显变化，dscDNA均一化效果良好．
A．观音竹幼叶总 RNA; B．均一化前 dscDNA，M为 DL15000 bp Marker ( Takara) ; C．均一化后的 dscDNA，
M为 DL12216 bp Marker ( invitrogen) ，1 － 3 泳道分别为 0、1 /4、1 /2 U DSN酶处理后扩增的 dscDNA．
图 1 观音竹幼叶总 RNA及均一化前后 cDNA电泳结果
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from Bambusa multiplex var． riviereorum young leaf and normalization
2．4 库容及插入片段的检测
滴度检测结果表明文库滴度为 1．7 × 106 cfu·mL －1 ．蓝白斑筛选和 PCR 验证结果显示文库重组率为
97% ．插入片段大小为 1 － 2．5 kb，平均值约为 1．5 kb( 图 2) ．
1 － 18 表示插入片段 PCR扩增; M为 DL12，216 bp Marker ( invitrogen) ．
图 2 均一化全长 cDNA文库插入片段大小
Fig． 2 Average size of inserts of normalized cDNA library
2．5 EST测序
对文库随机的 600 个阳性克隆进行测序后，经去除载体及拼接共获得 574 条有效而高质量的 EST 序
列，最短 EST长度为 403 bp，平均长度为 975 bp．用 Phrap软件对 EST序列进行片段重叠群分析，共获得单
一序列( unigene) 543 条，包括 30 个片段重叠群( contig) ( 5．5% ) 与 513 个单基因( singleton) ( 94．5% ) ，文库
冗余率仅为 5．4% ． Blast同源比对结果显示:单一序列中有 125 条( 23% ) 序列无同源性，属于新序列; 94 条
( 17．3% ) 序列分子功能未知; 324条( 59．7% ) 序列有显著同源性．比对结果显示，文库中单一序列与水稻基因
库同源性高的序列的数量最多( 77% ) ，高粱其次( 69．3% ) ，玉米最少( 59．4% ) ．同源性比对结果表明，获得的
EST编码的氨基酸序列与过氧化物酶、蛋白激酶、热激蛋白、锌指蛋白、脱水响应相关蛋白、GTP结合蛋白、转录
因子等防御反应相关蛋白有较高同源性．
将 324 个比对上已知的功能蛋白的单一序列进行 WEGO功能分类，结果显示，324 个单一序列共获得
1442 个 GO注释．这些注释归为 3 大类，即生物过程、细胞成分、分子功能，主要涉及细胞( 176条) 、细胞部分
( 176条) 、细胞器( 140条) 、结合( 136条) 、催化活性( 164 条) 、细胞过程( 146 条) 、代谢过程( 140 条) 等方面
功能，参与对外界刺激反应的基因有 80个，占 24．7% ( 表 1) ．
综上分析结果表明，观音竹均一化全长 cDNA文库的均一化效果较好，涵盖较全的细胞表达信息，且
能较好反映特殊时期( 盐胁迫) 所表达的信息，即 EST中胁迫的应激蛋白占相当高比例．
·56·第 1 期 吴幼容等:观音竹盐胁迫均一化全长 cDNA文库的构建与 EST测序分析
表 1 324 条 unigenes序列功能分类
Table 1 Classification of function of 324 unigenes
GO注释
基因数
量 /条
所占比
例 /%
细胞组件 胞外区 1 0．3
细胞 176 54．3
膜封闭腔 5 1．5
外膜 2 0．6
大分子复合物 11 3．4
细胞器 140 43．2
细胞器部分 7 2．2
细胞部分 176 54．3
分子功能 催化活性 164 50．6
结构分子活性 11 3．4
转运活性 27 8．3
结合 136 42．0
酶调节活性 4 1．2
转录调节活性 25 7．7
翻译调节活性 4 1．2
分子传感器活性 14 4．3
生物学过程 复制 4 1．2
代谢过程 140 43．2
细胞过程 146 45．1
细胞成分组织 22 6．8
死亡 2 0．6
生殖过程 4 1．2
多细胞机体过程 13 4．0
发育过程 13 4．0
增长 4 1．2
色素形成 28 8．6
对外界刺激的反应 80 24．7
定位 26 8．0
定位建立 26 8．0
生物调节 31 9．6
3 讨论
构建均一化全长 cDNA文库可以降低高丰度基
因的表达丰度，提高或不改变中等丰度基因的表达，
大大提高低丰度基因或稀有基因的表达，即实现了
均一化，这为高通量 EST 测序、新基因的挖掘、基因
功能研究带来了便利，也节约了成本．
目前构建均一化全长 cDNA文库主要有基因组
DNA饱和杂交法和复性式均一化技术．基因组 DNA
饱和杂交法是基于基因组 DNA 在拷贝数上具有相
对一致的特性，通过 cDNA 与基因组 DNA 饱和杂
交，使捕获的 cDNA 丰度与基因组 DNA 一致，从而
达到均一化的目的． 但该方法难以提供足量的极低
表达丰度的 cDNA 与 DNA 饱和杂交，应用性不强．
储昭晖等［7］通过改进基因组 DNA 饱和杂交法构建
了水稻全生育期均一化 cDNA 文库． 复性式均一化
技术是基于复性动力学原理，通过变性 －复性操作，
达到所有 cDNA丰度均一化的目的．该法操作简便，
应用前景好．从 Ko［15］构建了第 1 个均一化 cDNA文
库以来，Patanjali et al［16］、Soares et al［17］、Kohchi et
al［18］均基于复性动力学原理，构建了均一化 cDNA
文库．但自从 Pavel et al 2004 年发现了双链特异性
核酸酶( DSN) 以来［19］，研究者们基于 DSN 的特异
性建立了一种新的 cDNA 均一化方法，即应用 DSN
酶进行 cDNA的均一化． DSN 是一种具有很高热稳
定性和可控性的核酸酶，它能选择性地降解双链 DNA和 DNA-RNA杂交体中的 DNA，而不降解单链 DNA．
He et al证明了采用 DSN法均一化的有效性［14，20］．本研究是基于复性式动力学原理，应用 DSN 酶并结合
SMART建库技术来构建观音竹盐胁迫均一化全长 cDNA文库．另外，SMART 技术是美国 Clontech 公司推
出的构建全长文库的方法，其优点在于使用极少量的 mRNA或总 RNA反转逆就能得到大量的双链 DNA．
本研究使用 Creator SMART cDNA Library Constrution Kit来构建文库，但在技术上作了一些改进，以保
证所构建文库的质量．这些改进的方法有: 采用二步法代替试剂盒中的一步法逆转录，保证长片段的扩增
以及获得较高的基因全长率［21］; 通过琼脂糖凝胶电泳割胶去除了小片段，更加直观地对 cDNA进行分级，
保证 cDNA大小适合; 采用简易的半透膜代替试剂盒中葡聚糖柱，提高了纯化效果; 对回收纯化的产物添
加糖原( 20 mg·mL －1 ) 沉淀，保证其回收效率．
基于上述改进，本研究所构建文库的冗余率仅为 5．4%，库容达到 1．7 × 106 cfu·mL －1，插入片段的克
隆子重组率高达 97%，测序的 EST涵盖的功能较齐全，且能反应特定时期( 盐胁迫) 细胞表达的信息．表明
文库获得成功构建，可用于筛选耐盐相关基因等研究．
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( 责任编辑: 叶济蓉)
·76·第 1 期 吴幼容等:观音竹盐胁迫均一化全长 cDNA文库的构建与 EST测序分析