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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第10期
RNA 是进行分子生物学研究的重要基础性材料
之一。提取完整的、高质量的 RNA，对于进行 RT-
PCR、RACE、Northern 杂交、cDNA 文库构建、基因
芯片探针标定等分子生物学研究具有重要意义。常
见的提取植物 RNA 的方法有异硫氰酸胍法［1］、热
酚法［2］、CTAB-LiCl 法［3］、Trizol 法及各种试剂盒等。
与其他方法相比，Trizol 法具有快速、高效、稳定等
优点［4］。利用酸性条件下 RNA 比 DNA 更易溶于水
的特点，Trizol 法能较完全地除去 DNA，且其所含
RNase 的强抑制剂能保护 RNA 不被降解，所以大多
数植物材料的 RNA 提取均采用这一方法［5］。然而，
使用 Trizol 法提取植物总 RNA 易造成成分残留，导
致 OD260/230 值偏低，若进一步进行复杂的分子生物
收稿日期 ：2013-04-24
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（31070361），中央高校基本科研业务费专项基金（1112KYQN31），中央民族大学“985 工程”项目
（MUC98504-14，MUC98507-08），国家大学生创新训练项目（GCCX2013110015）
作者简介 ：陈静，女，硕士，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：wendybj121@126.com
通讯作者 ：周宜君，女，博士，教授，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：queenzhou@263.net
改良 Trizol 法提取高质量蒙古沙冬青总 RNA
陈静  高飞  周宜君  张孜宸  李章磊  曹玉震  张至玮
（中央民族大学生命与环境科学学院，北京 100081）
摘 要 ： 以木本植物蒙古沙冬青的叶片和根为材料，采用改良 Trizol 法提取总 RNA。结果表明，与传统 Trizol 法相比，改良
Trizol 法能有效去除提取过程中残留的异硫氰酸胍、β-巯基乙醇以及植物本身的糖、酚类物质，获得高质量总 RNA。改良 Trizol 法
提取总 RNA 技术已被成功应用于蒙古沙冬青转录组数据库的建立。该方法可为木本植物提取高质量 RNA 提供借鉴。
关键词 ： 总 RNA 提取 蒙古沙冬青 改良 Trizol 法
Extraction of High Quality Total RNA from Ammopiptanthus
mongolicus with Improved Trizol Method
Chen Jing Gao Fei Zhou Yijun Zhang Zichen Li Zhanglei Cao Yuzhen Zhang Zhiwei
（College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081）
Abstract:  Total RNA was extracted using an improved Trizol method, with the leaves and roots of xylophyta, Ammopiptanthus mongolicus
（Maxim）Cheng f. The result showed that compared to traditional Trizol method, the improved Trizol method can effectively remove residual
guanidinium isothiocyanate, beta-mercaptoethanol in extraction process, as well as the sugar and polyphenols of the plant itself, and high-quality
total RNA was obtained. The improved Trizol method has been successfully applied to transcriptome database constrction of A. mongolicus. It
also provided a reference for xylophyta to extract high-quality RNA.
Key words:  Total RNA extraction A. mongolicus Improved Trizol method
学试验会增加试验失败的风险。因此，如何有效使
用 Trizol 法，成为快速获取高质量植物总 RNA 及进
行后续分子生物学研究的关键。
蒙古沙冬青［Ammopiptanthus mongolicus（Max-
im）Cheng f.］系豆科蝶形花亚科沙冬青属（Ammo-
piptanthus）超旱生常绿灌木，主要分布于蒙古、俄罗
斯、东亚地区及中国内蒙、宁夏、甘肃等地，通常
生长于戈壁、干旱山坡及山前地［6］。沙冬青具有很
强的抗旱、抗寒及耐盐特性［7-12］，也具有药用价值［13］。
对于沙冬青的抗逆分子机制研究成为近年来的研究
热点。由于沙冬青为超旱生灌木，细胞内特别是根
中细胞所含单宁、萜烯、多糖、酚类、醌类等次级
代谢产物较多［14］，难以提取 RNA 或所得 RNA 质量
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期88
不高。对蒙古沙冬青总 RNA 提取的研究表明，使用
Trizol 法难以保证总 RNA 的高质量和得率［15］。
为了快速、高效获得高质量的蒙古沙冬青总
RNA，消除传统 Trizol 法对试验体系的不利影响，
本研究以实验室培养 8 周的蒙古沙冬青幼苗的叶和
根为材料，采用改良 Trizol 法提取总 RNA，通过分
析传统 Trizol 法和改良 Trizol 法所提取的总 RNA 的
各类质量参数，对改良方法进行评价，旨在获得高
质量蒙古沙冬青总 RNA，为进行蒙古沙冬青抗逆分
子机制研究建立基础方法。
1 材料与方法
1.1 材料
蒙古沙冬青（A. mongolicus）种子采自宁夏自
治区中卫县。Trizol 试剂为 Ambion 公司产品，购自
Life Technologies 公司。
1.2 方法
种子经播种、萌发培养 8 周后，用加有 20%
PEG6000 的 1/2 Hoagland 营养液浇灌，干旱胁迫 72
h 后，分别取植物叶片和根组织。取未经胁迫的植
物叶片和根组织作为对照。所有材料迅速冻于液氮
中，用于总 RNA 提取。
1.2.1 总 RNA 的提取
1.2.1.1 传统 Trizol 法提取蒙古沙冬青总 RNA RNA
提取方法参照说明书进行，具体方法如下 ：①分别
称取 0.3 g 沙冬青根及叶，在液氮中研磨成细粉末状。
加入 1 mL Trizol 试剂，迅速混匀，震荡 5-10 min。
②加入 200 μL 氯仿，颠倒混匀并震荡 2-3 min，4℃，
12 000 r/min 离心 12 min。③转移约 600 μL 上清液至
一新的无 RNase 离心管中。④加入 500 μL 异丙醇，
混匀，冰上静置 10 min，4℃，12 000 r/min 离心 12
min，弃上清。⑤用 1 mL 冰冷的 75% 的乙醇（DEPC
水配制）洗涤沉淀，4℃，12 000 r/min 离心 3 min，
弃去乙醇。⑥干燥沉淀，加入 40-100 μL DEPC 水溶
解。⑦ 60℃孵育 10 min 充分溶解。⑧配制 1% 的琼
脂糖凝胶（1×TAE），电泳初步检测 RNA 的完整性。
1.2.1.2 改良 Trizol 法提取蒙古沙冬青总 RNA 针对
1.2.1.1 中的传统 Trizol 法提取植物总 RNA 进行如
下改进 ：（1）将传统方法第③步中“600 μL”改为
“500 μL”；（2）将传统方法第④步中“加入 500 μL
异丙醇”改为“加入 250 μL 异丙醇后再加入等体积
的高盐溶液（DEPC 水配制的 0.8 mol/L 柠檬酸钠和 1.2
mol/L NaCl）”。（3）将传统方法第⑤步中“弃去乙醇”
采用枪头小心吸干，尽量减少乙醇残留。（4）将传
统方法第⑥步中的“干燥沉淀”改为“干燥沉淀适度，
不宜过干”。（5）将传统方法第⑦步的“孵育”改为
“用枪头反复吹吸充分溶解”。
1.2.2 总 RNA 质量测定 利用 1% 的琼脂糖凝胶
电 泳 检 测 提 取 的 RNA 质 量。 取 1 μL RNA 样 品 稀
释一定倍数（传统方法稀释 4 倍，改良方法稀释 3
倍），采用 Agilent 2100 检测 RNA 浓度、RNA 完整
度（RNA integrity number，RIN）、OD260/280、OD260/230
和 28S∶18S 等指标。
2 结果
2.1 传统Trizol法提取RNA结果及质量检测
2.1.1 提取结果 对传统 Trizol 方法提取的沙冬青
总 RNA 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳，结果（图 1）
显示，传统 Trizol 法提取的沙冬青总 RNA 有 3 条较
清晰的条带，无 DNA 污染。但是，无法直接看出
28S 条带比 18S 条带更亮，且相对于 28S 与 18S 的
电泳条带，5.8S 条带比较清晰。RNA 是否存在降解
以及该 RNA 质量是否适合要求较高的分子生物学试
验，还需进一步检测其质量。
M ：DNA marker ；1 ：沙冬青叶总 RNA ；2 ：沙冬青根总 RNA ；3 ：
20% PEG6000 处理 72 h 沙冬青叶总 RNA ；4 ：20% PEG6000 处理
72 h 沙冬青根总 RNA
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测传统 Trizol 法提取沙冬青总 RNA
200
500
800
1200
bp
M 1 2 3 4
28S
18S
5.8S
2000
2.1.2 质量检测 估计 RNA 样品浓度，取 1 μL RNA
样品稀释 4 倍，采用 Agilent 2100 对传统 Trizol 方法
提取的总 RNA 进行 RNA 质量检测。检测结果（图
2）显示，（1）用琼脂糖凝胶电泳初步检测的传统
Trizol 方法提取的总 RNA 无降解现象发生 ；（2）用
2013年第10期 89陈静等 ：改良 Trizol 法提取高质量蒙古沙冬青总 RNA
一定量的植物组织样本提取的 RNA 浓度不高、含量
偏低，不同处理体系中所得的 RNA 总量均小于 20
μg ；（3）经过 20% PEG6000 处理的沙冬青叶和根提
取的 RNA，其 RIN 值均小于 8.0，其 28S∶18S 值均
小 于 1.5，OD260/280 值 均 处 于 1.8-2.2 之 间，OD260/230
值却均远小于 1.8。相关数据汇总于表 1。
M ：DNA marker ；1 ：沙冬青叶总 RNA ；2 ：沙冬青根总 RNA ；3 ：
20% PEG6000 处理 72 h 沙冬青叶总 RNA ；4 ：20% PEG6000 处理
72 h 沙冬青根总 RNA
图 3 琼脂糖凝胶电泳检测改良 Trizol 法提取沙冬青总 RNA
[FU]
[nt]
15
10
25
Overall Results for sample: SDQ CK L
200 1000 4000
5
0
28S
18S
A [FU]
[nt]
10
25
Overall Results for sample: SDQ CK R
200 1000 4000
5
0
28S
18S
B
[FU]
[nt]
10
25
Overall Results for sample: SDQ PEG L
200 1000 4000
2
8
6
4
0
28S
18S
C [FU]
[nt]25
Overall Results for sample: SDQ PEG R
200 1000 4000
6
4
2
0
28S
18S
D
Y 轴 为 荧 光 强 度（FU），X 轴 为 RNA 长 度（nt）。A ：沙 冬 青 叶 总 RNA（SDQ CK L）；B ：沙 冬 青 根 总 RNA（SDQ CK R）；C ：20%
PEG6000 处理 72 h 沙冬青叶总 RNA（SDQ PEG L）；D ：20% PEG6000 处理 72 h 沙冬青根总 RNA（SDQ PEG R）；下同
图 2 Agilent 2100 对传统方法提取沙冬青总 RNA 的质量检测
表 1 传统法提取沙冬青总 RNA 质量检测
名称 RNA 面积 测定浓度（ng/μL） 原液浓度 a（ng/μL） 体积（μL） 总量 b（μg） RIN 28S∶18S OD260/280 OD260/230 检测结论
A CK-L 95.2 104 416.0 24 9.984 8.2 1.6 1.96 0.72 D 类
B CK-R 74.1 81 324.0 24 7.776 8.1 1.6 1.92 0.69 D 类
C PEG-L 77.6 85 340.0 28 9.520 7.5 1.4 1.88 0.45 D 类
D PEG-R 54.2 60 240.0 36 8.640 7.1 1.2 2.21 1.18 D 类
a ：原液浓度 = 测定浓度 × 稀释倍数（4 倍）；b ：总量 = 原液浓度 × 体积
2.2 改良Trizol法提取RNA结果及质量检测
2.2.1 提取结果 对改良 Trizol 法提取的沙冬青总
RNA 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳，结果（图 3）显
示，改良 Trizol 提取的沙冬青总 RNA 有 3 个条带，
无 DNA 污染。28S 条带比 18S 条带明亮，且相对于
28S 与 18S 的电泳条带，5.8S 的条带比较模糊，无
明显降解现象。对于该 RNA 是否适合对 RNA 质量
要求较高的分子生物学试验还需进一步的质量检测。
2.2.2 质量检测 对比传统提取方法的质量检测结
果，取 1 μL RNA 样品将其稀释 3 倍，采用 Agilent
2100 对改良 Trizol 方法提取的总 RNA 进行质量检
测，结果（图 4）显示，（1）相同量的组织样本提
取的 RNA 浓度较高、总量高，足够后续试验使用 ；
（2）经过干旱胁迫和未经干旱胁迫的植物组织样本
bp
M 1 2 3 4
28S
18S
5.8S
800
200
500
1200
2000
提取的 RNA 的 RIN 值均大于 8.0，并且其 28S∶18S
值均大于 1.5 ；（3）OD260/280 值均处于 1.8-2.2 之间，
OD260/230 值也均处于 1.8-2.2 之间。相关数据见表 2。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第10期90
3 讨论
沙冬青是豆科常绿阔叶灌木，属古老的第三纪
残遗种，为我国的稀有濒危植物，且其对干旱、高盐、
低温都有很强的耐受性［16］，是研究抗逆分子机制挖
掘抗逆基因的好材料。纯度高、完整性好的 RNA 是
进行分子生物学深入研究的基础［5］，提取高质量的
沙冬青 RNA 是进行分子生物学研究的先决条件。传
统 Trizol 法提取 RNA 高效快速，且其中所含的异硫
氰酸胍、β-巯基乙醇也可以有效去除细胞内所含的
核蛋白［1］、多糖和酚类物质［17］，并抑制 RNA 酶的
活性［18］。然而，林青芳等［15］对蒙古沙冬青进行了
总 RNA 提取与 mRNA 分离方法的研究，其研究结
果指出，传统 Trizol 法不能满足高质量蒙古沙冬青
总 RNA 的提取要求，而采用热酚法提取的 RNA 质
量较好，并利用反转录后进行 RT-PCR 验证质量，
但并未给出直接反映 RNA 完整度等指标。另外，传
统 Trizol 法中的一些成分也易残留于试验体系，造
成所提总 RNA 的 OD260/230 值偏低，影响总 RNA 质量。
在 RNA 质量检测中，RNA 样品的 OD 值通常
作为鉴定 RNA 质量、纯度的重要指标。若样品 OD
值未达到要求，可能影响后续的转录组测序（RNA
sequising，RNA-seq）、数字基因表达谱（Digital Gene
Expression Profiling，DGE）磁珠分离 mRNA 及反转
录效率，造成 DGE 基因定量不准或影响 RNA-seq
文库随机性差，重复序列比例高，甚至建库失败。
RNA-seq 和 DGE 所 需 RNA 样 品 的 OD 值 标 准 为 ：
OD260/280 和 OD260/230 均介于 1.8-2.2 之间。OD 值越接
近标准值风险越小，反之则风险越大。
本研究首先采取传统 Trizol 法进行了蒙古沙冬
青总 RNA 的提取，并进行了 RNA 质量相关指标的
测定。从检测结果可以看出，虽然用琼脂糖凝胶电
泳初步检测的传统 Trizol 方法提取的总 RNA 并无降
解现象发生，但是 RNA 的其他指标并不理想。首先，
用一定量的植物组织样本提取的 RNA 浓度不高、含
量偏低，不同处理体系中所得的 RNA 总量均小于
20 μg ；其次，经过 20% PEG6000 处理的沙冬青叶和
根提取的 RNA，其 RIN 值均小于 8.0，其 28S∶18S
值均小于 1.5，说明所提取 RNA 的完整性较差并伴
图 4 Agilent 2100 对改良 Trizol 法提取沙冬青总 RNA 的质量检测
表 2 改良 Trizol 法提取沙冬青总 RNA 质量检测
名称 RNA 面积 测定浓度（ng/μL） 原液浓度 a（ng/μL） 体积（μL） 总量 b（μg） RIN 28S∶18S OD260/280 OD260/230 检测结论
A CK-L 602.3 239 717.0 73 52.341 8.3 1.6 1.99 2.09 A 类
B CK-R 490.5 195 585.0 73 42.705 8.3 1.6 2.00 1.91 A 类
C PEG-L 362.1 273 819.0 48 39.312 8.0 1.5 1.97 1.98 A 类
D PEG-R 342.6 258 774.0 75 58.050 8.2 1.5 1.99 1.94 A 类
a ：原液浓度 = 测定浓度 × 稀释倍数（3 倍）；b ：总量 = 原液浓度 × 体积
[FU]
[nt]
100
50
25
Overall Results for sample: SDQCK-L
200 1000 4000
0
28S
18S
A [FU]
[nt]
80
60
40
20
25
Overall Results for sample: SDQCK-R
200 1000 4000
0
28S
18S
B
[FU]
[nt]
40
20
25
Overall Results for sample: SDQPEG-L
200 1000 4000
0
28S
18S
C [FU]
[nt]
60
40
20
25
Overall Results for sample: SDQPEG-R
200 1000 4000
0
28S
18S
D
2013年第10期 91陈静等 ：改良 Trizol 法提取高质量蒙古沙冬青总 RNA
有少量的降解，而这种少量降解以及完整程度都无
法仅仅依靠简单的琼脂糖凝胶电泳检测出来。此外，
OD260/280 值均处于 1.8-2.2 之间，可见提取过程中蛋
白质已经被有效去除，但 OD260/230 值却均远小于 1.8，
表明传统 Trizol 法提取过程中存在着异硫氰酸胍、β-
巯基乙醇、乙醇等化学物质的残留。综上所述，传
统 Trizol 法提取的 RNA 质量属于 D 类（分类从高到
低分为 A-D 类），该类别的 RNA 质量不能满足建库、
测序等分子生物学试验要求，不建议使用。
为此针对提取总 RNA 试验中常用的传统 Trizol
法，对部分步骤进行了改良和优化。首先，改良方
法（1）减少上清液转移量避免了吸取离心中间层的
杂质，降低了细胞中 DNA 和蛋白质污染的几率。第
二，改良方法（2）添加配制的高盐溶液可以除去
Trizol 中所残留的异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等化学成
分。第三，改良方法（3）不完全干燥能够减少体
系中乙醇的残留。第四，改良方法（4）和（5）能
够保证 RNA 的完整性及降低其降解风险，既保证了
Trizol 法的高效性，节省试验时间，又消除了 Trizol
试剂本身对试验的不利影响，从而从木本植物蒙古
沙冬青中提取得到高质量的 RNA。从检测结果中可
以看出，与传统 Trizol 方法相比，相同量的组织样
本提取的 RNA 浓度较高、总量高，足够后续试验
使用 ；其次，经过干旱胁迫和未经干旱胁迫的植物
组织样本提取的 RNA 的 RIN 值均大于 8.0，并且其
28S∶18S 值均大于 1.5，说明改良 Trizol 法提取的
RNA 完整性较高，且没有降解 ；第三，OD260/280 值
均处于 1.8-2.2 之间，可见提取过程中蛋白质已经被
有效去除。OD260/230 值也均处于 1.8-2.2 之间，说明
提取过程中 Trizol 残余的异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等
化学成分和乙醇也被有效去除。基于以上检测数据，
用改良 Trizol 法提取的 RNA 各项检测指标都达到要
求，质量等级属于 A 类。该类别的 RNA 质量能满
足建库、测序等要求，且总量可以满足 2 次或者 2
次以上建库需要的样品。因此，采用改良 Trizol 法
可以获得高质量的沙冬青 RNA。
试验结果表明，通过以上改良，可以去除提取
体系中小分子盐及有机物的残留，提高了 OD260/230
值，从而提高 RNA 纯度，得到高纯度、完整性好的
RNA，使其满足后续试验要求。对比两种方法的试
验结果可以看出，传统 Trizol 法无法提取高质量的
蒙古沙冬青 RNA，改良 Trizol 法可以提取得到高质
量的沙冬青 RNA。采用改良 Trizol 法提取蒙古沙冬
青总 RNA 技术已经成功应用于沙冬青转录本数据库
的建立［19］。
4 结论
与传统 Trizol 法相比，采用改良 Trizol 法提取木
本植物蒙古沙冬青的叶片和根的总 RNA，能有效除
去提取过程中残留的异硫氰酸胍、β-巯基乙醇以及
植物本身的糖、酚类物质，获得高质量总 RNA。
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（责任编辑 马鑫）