全 文 ：西北农业学报　2007 , 16(3):188～ 191
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
富含多糖葡萄风信子花瓣总 RNA提取方法研究*
郭翠英 ,王跃进 ,刘雅丽* ,贺明阳
(西北农林科技大学园艺学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:在普通 CTAB法与 SDS 法提取 RNA 的基础上 , 从去除多糖和 DNA 污染两个方面进行优化 , 筛选出
适于富含多糖类葡萄风信子花瓣 RNA 提取的方法 , 经检测 OD260 /280值在 1. 8 ～ 2. 0 之间 , 电泳 28S 条带和
18S rRNA 条带都很清亮 ,比值约1. 5。对改进的 CTAB法提取的总 RNA 进行 RT-PCR 能扩增出所需目的条
带。有效去除多糖类物质污染对于富含多糖类花瓣组织 RNA 提取很重要。
关键词:葡萄风信子;多糖;改良 C TAB 法;改良 SDS 法;总 RNA 提取
中图分类号:Q784;S682. 2 +9　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2007)03-0188-04
Research of Total RNA Extraction Methods from Polysaccharide-
riched Petals of Common Grape Hyacinth
GUO Cui-ying , WANG Yue-jin , LIU Ya-li* and HE Ming-yang
(Col lege of Hort icul tu re , Northw es t A &F U niversi ty , Yangling Shaanxi　712100 , China)
Abstract:Ex tracting high-quality RNA from common grape hyacinth f low ers using common methods
is diff icult because of high levels of poly saccharide in f lowe rs. To tal RNA was iso lated f rom common
grape hyacinth w i th modi fied CTAB method and SDS method. UV-Spect roscopic analy sis showed that
A(260) /A(280)=1. 8 ～ 2. 0 ,28S , 18SrRN A we re all clear in elect ropho resis picture. Targe t gene w as
amplif ied f rom isolated to tal RNA by RT-PCR which testified high quali ty could be isolated f rom pet-
als w ith modified methods. In conclusion , i t is pretty impo rtant to reduce poly saccharide fo r obtaining
high quali ty total RN A from polysaccharide-riched f low er petals.
Key words:Common g rape hyacinth;Polysaccharide;Modi fied CTAB method;Modif ied SDS method;
To tal RNA ex tract ion
　　葡萄风信子为百合科多年生球根花卉 ,花瓣
为天蓝色 ,从其花瓣中提取纯度高 、完整性好的总
RNA 是后续 RT-PCR 、Northern 杂交 、cDNA 文
库构建等分子生物学研究的基础。各种植物因其
自身的特点 ,总 RNA 的提取方法也有一定的差
异。普通的 CTAB法和 SDS 法提取葡萄风信子
RNA , LiCl沉淀后亦会有不溶性的多糖物质存
在。本研究主要是在这两种方法的基础上 ,围绕
去除多糖和 DNA 污染两方面进行了步骤方法优
化 ,为深入开展相关研究奠定基础 ,并为提取其他
富含多糖类植物 RNA 提供借鉴 。
1　材料与方法
1. 1　材料
材料为葡萄风信子花蕾期 ,开花初期 ,开花盛
期花瓣的混样 ,从正在生长的植株上剪下立即转
入液氮 , - 80℃冰箱冻存 。
1. 2　方法
1. 2. 1　普通的 CTAB法　未加特异的除多糖步
骤 ,具体步骤参照文献[ 1] 。
1. 2. 2　普通 SDS法　具体步骤参照文献[ 2] 。
1. 2. 3　优化的 CTAB 法　具体步骤:第一次氯
* 收稿日期:2006-11-22　　修回日期:2006-12-05
作者简介:郭翠英(1979 -),女 ,新疆玛纳斯县人,在读硕士 ,研究方向:园林植物与观赏园艺。
*通讯作者:刘雅丽。
仿∶异戊醇抽提后 , 取上清加入 1 /10 体积 5
mol /L KAC (pH4. 8),1 /10体积的无水乙醇 ,等
体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)混匀 ,4℃,12 000 r /
min离心 15 min 。取上清 ,可重复此步骤。移上
清至新离心管 ,加入 1 /3体积的预冷 LiCl , - 20℃
冰浴 2 ～ 3 h。4℃,12 000 r /m in ,离心 15 min ,弃
上清 ,用 75%乙醇洗涤沉淀两次 ,室温干燥。沉
淀溶于 100 μL DEPC 水中 ,再加入 100 μL 经
65℃水浴 10 m in的 PS Eraso l(天泽基因的除多
糖试剂)。振荡器上充分振荡 1 min。加入 100
μL 氯仿∶异戊醇(24∶1),振荡器上充分振荡 1
min。4℃,12 000 r /min状态下 ,离心 5 min ,移上
清至新离心管 ,加入 1 /10体积的 3 mol /LNaAC
(pH5. 2),2倍体积的无水乙醇沉淀。4℃, 12 000
r /min状态下 ,离心 10 min ,收集沉淀 ,用 75%乙
醇洗涤两次 ,室温干燥。沉淀溶于 30 μL DEPC
水中 。
1. 2. 4　优化的 SDS 法　具体步骤:第一次氯仿:
异戊醇抽提后 ,取上清至离心管 ,加入 1 /3体积的
5 mol /L KAC(pH4. 8),充分震荡混匀 ,冰浴 10
min。12 000 r /min离心 15 min ,弃沉淀 。氯仿∶
异戊醇(24∶1)再抽提一次。之后步骤与优化后
的 CTAB法相同 。
1. 3　总 RNA 中 DNA的去除
总 RNA 中 DNA 的去除参照 Promega公司
RNase f ree的 DNase I 使用说明略有改动 ,具体
为:建立 120 μL的酶解体系(3 μg 总 RNA , 6 μL
的 RQase , 10μL 的 10×buffer , 4 μL 的 RNasin
用 DEPC 水补齐至 120 μL),混匀 , 37℃水浴 20
min;水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和氯
仿∶异戊醇(24∶1)各抽提一次 ,移上清至离心管
加 1 /10体积 3 mol L NaAC(pH5. 2)和 2. 5倍
体积无水乙醇 , - 20℃放置 2 h;4℃, 12 000 r /
min离心15 min ,弃上清液 ,75%乙醇清洗沉淀2
次 ,室温下干燥;沉淀溶于 30 μL DEPC 水中 ,
- 40℃冻存。
1. 4　总 RNA的检测
1. 4. 1　琼脂糖凝胶电泳法　取 5 μL 总 RNA 溶
液在 1. 0%琼脂糖凝胶上电泳后 , EB 染色 ,紫外
灯下观察照相。
1. 4. 2　测 OD 值　参照奥斯伯等的方法 ,取经
DNA 酶解的总 RNA 溶液 2 μL ,采用 Beckman
公司的DU800型紫外分光光度仪测在 260 nm 和
280 nm处的光吸收值。
1. 4. 3　反转录及 PCR扩增　反转录反应参照
MMLV 反转录酶(Promega , M1701)使用说明进
行。PCR扩增引物根据 Genebank上登录的目的
基因的保守区设计。
PrimerF 5′ATCCGCCAAGTGGTCGTCG
CCTC 3′
PrimerR 5′CTCGCCCGA TGGCCCA TA T
G TTGAC 3′
反应程序为:94℃预变性 5 min , 94℃变性 1
min , 60℃退火 1 min , 72℃延伸 1 min , 35 个循
环 ,72℃延伸 10 min 。4℃保存 。
1.普通的 CTAB法 , Common CT AB method;
2.普通的 SDS法 , Common SDS m ethod
图 1　普通 CTAB法和 SDS法提取总 RNA电泳结果
Fig. 1　Result of total RNA integrity using common
CTAB method and SDS method
1 , 2优化的 CTAB法 , Modified CTAB meth od;
3 , 4优化的 SDS 法 , Modif ied SDS method
图 2　优化的 CTAB法和 SDS法提取总 RNA电泳结果
Fig. 2　Result of total RNA integrity using modif ied
CTAB method and SDS method
2　结果与分析
2. 1　总 RNA的电泳检测
普通的未加除多糖的提取 RNA 的方法用
DEPC 水溶解时会发现有不容性的黏性物质存
189 3 期　　　　　　　　　　郭翠英等:富含多糖葡萄风信子花瓣总 RNA 提取方法研究
在 ,电泳加样时有飘样现象 ,经 1. 0%的琼脂糖凝
胶电泳 ,E tBr染色 ,紫外光检测结果显示电泳结
果见图 1 ,点样孔不清亮 ,且提取的 RNA 条带不
够整齐 ,呈现弥散状 。
优化的 CTAB 法和优化的 SDS 法提取的
RNA 电泳结果见图 2 ,图 2 中 2为在普通 CTAB
法基础上仅加了 1 /10体积 KAC(5 mol /L)和 1 /
10体积无水乙醇除多糖的电泳图片 ,3 为在普通
SDS法基础上加了1 /3体积的 KAC(5 mol /L)除
多糖的电泳图片 。2 、3电泳条带有拖尾。1 、4为
优化的 CTAB法和 SDS 法(加了除多糖试剂)提
取的 RNA 电泳图片 。条带很清晰 ,28S 亮度基本
是 18S 的两倍 , 说明优化的 CTAB 法和优化的
SDS法提取的 RNA 完整性较好 ,但是有 DNA污
染。去除 DNA 污染后的电泳图片见图 3。
1.优化的 SDS法 , Modified SDS method;
2.优化的 CT AB法, Modif ied CT AB method
图 3　去除 DNA后总 RNA 完整性的电泳检测结果
Fig. 3　Result of total RNA integrity after reduce DNA
2. 2　总 RNA纯度 、浓度检测
从表 1中可以看出 ,优化的 CTAB 法和优化
的 SDS 法总 RNA 的 OD260 / OD280值均介于
1. 8 ～ 2. 0之间 ,OD260 / OD230值大于 2. 0 ,说明
优化方法提取的 RNA 纯度较高 。优化的 CTAB
法提取的 RNA 产率明显高于优化的 SDS法提取
的 RNA 。
表 1　蓝色葡萄风信子花蕾总 RNA
不同提取方法纯度及产率
Table1　Comparison of total RNA purity and quantity of
common grape hyacinth by different methods
方法
M ethods
总 RNA 产率
/(ng μL - 1)
RNA Produ ct
纯度
A260 /
A280
A260 /
A230
优化的 CTAB法
M odif ied C TAB m ethod
310. 43 1. 86 2. 03
优化的 SDS法
M odif ied SDS meth od
139. 2 1. 96 2. 11
2. 3　PCR扩增目标基因
对优化的 CTAB法提取的总 RNA 反转录 ,
PCR扩增获得大约 600 bp的特异条带(图 4),与
所需目标片断大小一致 ,条带清晰 ,说明提取的
RNA 能用于后期的分子试验 。
　　1. M ark er;2. PCR扩增产物 , RT-PCR products
图 4　葡萄风信子总 RNA的 RT-PCR反应
产物琼脂糖凝胶电泳结果
Fig. 4　1% Agrose gel electrophoresis result of common
grape hyacinth RNA RT-PCR production
3　讨论
从文献报道上看 ,许多植物就是由于未能有
效地分离纯化其组织中的 RNA ,而阻碍了其分子
生物学方面研究的进展。认为在这些植物组织
中 ,或富含酚类化合物 ,或富含多糖 ,或含有某些
尚无法确定的次级代谢产物 ,或 RNase 的活性较
高[ 10 ～ 12] 。用常规的 CTAB 法 , SDS 法不能够从
葡萄风信子中提取到高质量的 RNA ,主要是因为
葡萄风信子花蕾富含多糖类物质 ,这一点可从常
规方法提取到的 RNA 呈现难溶的粘稠状看出 ,
而且电泳点样时有飘样现象 ,点样孔不亮 。多糖
的许多理化性质与 RNA 很相似 ,因此很难将它
们分开[ 3] 。在去除多糖的同时 RNA 也被裹携走
了 ,造成 RNA 产量的减少;而在沉淀 RNA时 ,也
产生多糖的凝胶状沉淀 ,这种含有多糖的 RNA
沉淀难溶于水 ,或溶解后产生粘稠状的溶液[ 4] 。
在常规的 RNA 提取方法中 ,通过 SDS-盐酸
胍处理可以去除部分多糖;在高浓度 Na+或 K+
离子存在条件下 ,通过苯酚 、氯仿抽提可以除去一
些多糖[ 5] ;通过 LiCl沉淀 RNA 也可以将部分多
糖留在上清液中[ 6] 。但即使通过这些步骤仍会发
现有相当多的多糖与 RNA 混杂在一起 ,所以还
需要用更有效的方法来解决植物 RNA 分离纯化
时多糖污染的问题。用低浓度乙醇沉淀多糖是一
个去除多糖效果较好的方法[ 9] 。在 RNA 提取液
190 西　北　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　16 卷
或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度 10%～
30%,可以使多糖沉淀下来 ,而 RNA 仍保留于溶
液中 。另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖
法[ 7] 。
本试验在普通的 CTAB 法和 SDS 法基础上
着重添加了除多糖步骤:优化的 CTAB法中加 1 /
10体积的 5 mol /LKAC (pH4. 8)和 1 /10体积的
无水乙醇 。优化的 SDS 法中加 1 /3 体积的 5
mol /L KAC(pH4. 8)。结果表明在匀浆上清液
中加入一定体积的 5 mol /L KAC (pH4. 8),去除
多糖 ,效果较明显。另外 ,在优化的 CTAB 法和
优化的 SDS法中还加入了天泽基因的除多糖试
剂 PS Eraso l进一步除去残留多糖。PS Eraso l
其原理是从 RNA 样品中将粘性多糖沉淀 ,而部
分 RNA 还留在溶液中 ,通过盐 /醇沉淀回收。本
研究结果表明 CTAB 裂解细胞的能力明显强于
SDS ,与刘志等[ 8] 研究报道过的资料相一致从图 1
和图 2可以看出 ,提取的 RNA 中有 DNA 污染 ,
本试验主要用了天泽基因的除 DNA 试剂和
Promege公司的 DNase ,具体过程均参照说明书
进行 。结果发现天泽基因公司的除 DNA 试剂能
有效去除 DNA , 但是却给 RNA 带来了其他杂
质 , 电泳后的 RAN 照片不清晰 , 呈弥散状。
Promege公司的 DNA酶能有效去除 DNA ,但是
RNA 损失很严重 , LiCl 沉淀后 ,四管 RNA 合一
管 ,才能有足够的 RNA 浓度 。说明除去 DNA 的
步骤还需要进一步的摸索 。
本试验还进一步证实了前期研磨材料一定要
细致 ,这是 RNA 提取产率提高的关键步骤。氯
仿∶异戊醇抽提时反复涡旋 ,让其与材料充分反
应 ,有利于去除蛋白污染 。
总之对于富含多糖类物质植物材料的 RNA
提取 ,无论基于哪种方法 ,若能有效去除多糖污
染 ,便可得到较高质量的 RNA 。
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