免费文献传递   相关文献

Microbial Diversity of the Crude Oil and Characteristics of a Hydrocarbon-degrading Bacterium

原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
溢油事故发生后,原油中某些相对分子质量小,
沸点低的烃类组分,数日后可挥发进入大气,占绝
大多数的沸点高的烃类组分的化合物随海水运动而
扩散转移。自然条件下,这些物质一部分由悬浮颗
粒吸附沉降于海底或者被浮游生物所摄取、代谢和
分解,而大部分则被微生物降解。目前,处理原油
污染主要有物理法,如用抽吸机吸油,用水栅和撇
沫器刮油、燃烧除油以及用油缆阻挡石油扩散等 ;
化学法,如喷洒化学药剂使石油加速分解等。然而,
当溢油事故发生于近海,漂浮的原油会附着于沙滩,
近海岩礁等,甚至会渗透到表面以下几米的地方,
收稿日期 :2012-09-24
基金项目 :浙江省重大科技攻关项目(2006C13089),宁波市科技局资助项目(2008C50027)
作者简介 :王中华,男,博士研究生,研究方向 :海洋生态环境 ;E-mail: wzhxinxiang76@sina.com
通讯作者 :李太武,教授,博士生导师 ;E-mail: litaiwu@nbu.edu.cn
原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究
王中华1  梁静儿1  杨建强2  周君1  李成华1  李太武1,3
(1. 宁波大学海洋学院,宁波 315211 ;2. 国家海洋局北海分局,青岛 266033 ;3. 宁波城市职业技术学院,宁波 315100)
摘 要 : 为分离得到高效原油降解菌,直接向原油中加入营养物刺激,培养一段时间后原油乳化降解。气相色谱法、红外
光谱法和紫外吸收均表明降解菌体系具有较强的降解原油烃的能力。采用细菌 16S rDNA 通用引物和 PCR 扩增等方法,构建原油
降解菌体系 16S rDNA 克隆文库,并对所构建的文库进行分析。同时,从降解菌体系中分离得到一株降解菌,鉴定结果表明所分离
的细菌为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。采用气相色谱技术对降解过程中的原油烃的变化进行分析,结果显示原油烃类组分会
随着降解时间的变化而发生变化,降解菌表现出其对烷烃类物质的降解能力。
关键词 : 原油 红外光谱 16S rDNA 生物降解 气相色谱
Microbial Diversity of the Crude Oil and Characteristics of a
Hydrocarbon-degrading Bacterium
Wang Zhonghua1 Liang Jinger1 Yang Jianqiang2 Zhou Jun1 Li Chenghua1 Li Taiwu1,3
(1. Faculty of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo 315211 ; 2. North China Sea Branch of The State Oceanic
Administration,Qingdao 266033 ; 3. Ningbo City College of Vocational Technology,Ningbo 315100)
Abstract:  The biodegradation bacterium system was obtained through adding nutrition, and the IR Technology, GC analysis and UV
methond were used. The analyse showed high degradation ability for crude oil. The diversity of bacterial communities in crude oil was researched
using 16S rDNA library approach. A high efficiency bacterium was obtained from the biodegradation bacterium system, which was identified as
Bacillus pumilus by automated cellular fatty acid identification system and phylogenetic analyses based on the 16S rDNA sequence. GC analysis
showed that the low-carbon chain alkanes and high-carbon-chain alkanes as well as aromatic hydrocarbons can be degraded.
Key words:  Crude oil IR technology 16S rDNA Biodegradation Gas chromatography
普通的物理化学法难以从根本解决问题。而生物法
以其处理成本低、效果好等优点被认为是有机污染
物修复中最有效和可靠的方法[1]。原油在开采和运
输中的附着微生物,适应恶劣生存条件,能够以原
油为碳源进行新陈代谢,这也是原油降解微生物的
重要来源。
国内外学者已从海洋、油污染土壤当中获得了
多株高效高效原油降解微生物[2-5],不同降解微生
物对原油组分的降解能力不同。16S rDNA 技术的研
究,更好地揭示了原油当中微生物群结构及其遗传
的多样性,原油中微生物的组成,并能够为原油降
2013年第1期 179王中华等 :原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究
解菌的筛选提供菌种来源。
烃类物质是石油的主要组分,约占石油总量的
95% 以上,包括正构烷烃、异构烷烃、环烷烃和芳
香烃等[6]。对这些组分的研究能够在一定程度上揭
示原油的降解过程和特性。本研究采用直接向原油
中添加营养物质的方法,在营养物的刺激下活化原
油中原有的微生物,对原油降解菌进行分离纯化,
通过红外光谱以及气相色谱研究原油的降解过程以
及降解菌的降解特性,通过紫外吸收法对其降解率
进行分析。
1 材料与方法
1.1材料
试验用原油取自于宁波港原油运输船金色大地
油轮,采集后放入无菌瓶中。海水培养基 :牛肉膏
3 g,蛋白胨 5 g,陈海水 1 L,自然 pH。原油培养基:
海水培养基加 0.3% 原油,自然 pH。油平板 :海水
培养基加入 2.0% 的琼脂和 0.3% 的原油,自然 pH。
降解培养基 :(NH4)2SO4 0.5 g,NaNO3 0.5 g,CaCl2
0.02 g,MgSO4 0.2 g,KH2PO4 1.0 g,NaH2PO4·H2O 1.0 g,
原油 1.0 g,蒸馏水 1 000 mL,pH 值 7.0。
1.2 方法
1.2.1 原油的微生物降解 海水培养基灭菌后加入
0.3% 原油,37℃、170 r/min 条件下摇床培养,得到
原油乳化物和细菌的混合体系后,立即进行红外光
谱扫描和气相色谱分析。
降解菌体系群转接 3 次,使其中能够降解石油
的微生物得到富集并成为优势菌。将所获得的石油
降解菌体系按不同的浓度梯度涂布于含有 0.3% 的石
油的固体平板上,37℃培养 24 h,挑取生长在油斑
上的菌落,划线法进行纯化。纯化后的单菌落接种
到原油培养基,原油降解后立即进行红外光谱扫描
和气相色谱分析。
1.2.2 红外光谱法检测原油的降解 以环己烷为萃
取剂,近红外谱图测定范围 4 000-1 -10 000 cm-1,中
红外谱图测定范围 400-1-4 000 cm-1,扫描次数 40
次,分辨率 8 cm-1,扫描扣除 H2O 和 CO2 的干扰,
每个样品谱图取 5 次测量的平均值。调用 OPUS 软
件(Bruker 公司,Germany)进行谱图处理。
1.2.3 气相色谱法检测原油的降解
1.2.3.1 气相色谱条件的确定 GC-2010 气相色谱
仪(岛津公司,日本),配用 FID 检测器,HP-5 石
英毛细管柱(30 m ×0. 32 mm ×0. 25 μm)。根据有
关资料并结合本仪器的具体情况,经反复比较试验,
确定以下试验条件所得结果较理想 :进样口温度 :
280℃,分流比 :1/ 1.5,检测器温度 :300℃,载气 :
高纯 N2,氢气压力 :100 kP,空气压力 :156 kP,
柱流速 :2.75 mL/min。升温程序 :初温 60℃(保持
1 min),从 60℃升至 100℃(升温速度 20℃ / min,
保持 2 min),从 100℃升至 280℃(升温速度 8℃ /
min,保持 12 min)。采用 GC-2010 自动进样器,进
样量为 1 μL,无分流进样。
1.2.3.2 烷烃标准曲线的确定 准确称取烷烃标准
物,用石油醚定容,配成终浓度分别为 2、4、6、8、
10 mg/mL 的烷烃标准液,进行气相色谱分析,确定
烷烃标准物保留时间出峰位置,并绘制浓度与峰面
积的标准曲线。
1.2.4 原油降解率的测定 将原油溶于石油醚绘制
原油标准曲线,采用紫外分光光度法结合公式通过
残油浓度[10]来计算原油降解率。计算公式 :
降解率(%)=(初始原油浓度 - 残余原油浓
度)/(初始原油度)×100%
1.2.5 降解菌体系微生物多样性分析 提取细菌总
DNA 具体步骤参考文献[7]。以所提 DNA 为模板,
采用细菌 16S rDNA 扩增通用引物 16s F :(5-AGAG-
TTTGATCCTGGCTCAG-3)和 16s R :(5-CCGTCAA-
TTCCTTTGAGTTT-3)为引物,进行 PCR 扩增。反应
体系 :10×buffer 2.5 μL,25 mmol/L MgCl2 2.5 μL,模
板 DNA 稀释 100 倍 1 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10
μmol/L 引物各 1 μL,1.0 U/反应 Taq DNAase,ddH2O
补 足 至 25 μL。PCR 扩 增 条 件 为 :95℃ 预 变 性
5 min ;94 ℃ 变 性 45 s,55℃ 退 火 45 s,72℃ 延 伸
1 min,35 个循环 ;72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物
用试剂盒回收纯化后与 PMD18- Tvecter 载体连接,
转化大肠杆菌转化大肠杆菌 DH5α,构建构建 16S
rDNA 文库。
1.2.6 降解菌的鉴定 (1)降解菌的分子生物学鉴
定 :将原油降解混合体系梯度稀释后涂布于油平板,
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期180
挑取生长在油上的单菌落,多次划线进行纯化后
通过 16S rDNA 鉴定,PCR 方法同 1.2.5。结果输入
GenBank 数据库,与数据库中序列进行比较分析。(2)
细菌自动鉴定系统鉴定 :根据皂化作用提取降解率
最高的 2 株细菌细胞脂肪酸甲酯,利用细菌自动鉴
定系统软件,将细胞脂肪酸甲酯的峰形图与各微生
物的模式图进行比较分析以鉴定细菌的分类地位。
2 结果
2.1 原油的降解分析
对原油富集培养产物进行观察后发现,细菌大
量生长使培养基浑浊,第 7 天原油产生乳化现象,
部分原油乳化后进入培养基。到第 21 天,原油几乎
原油中红外光光谱扫描结果,见图 2,中红外
原油特征谱峰主要有 3 簇,第一簇峰 3 000 cm-1 谱
带 归 属 为 芳 烃 化 合 物 环 的 C-H 键, 降 解 后 消 失,
2855 cm-1 谱带为烷烃甲基伸缩振动,降解后振动减
弱 ;第 2 簇峰,1 377 cm-1 处直链烷烃甲基和亚甲特
征吸收峰,1 470 cm-1 处烷烃亚碳基变形振动,降解
后显著减小,进一步证实了烷烃 C-H 的氧化分解 ;
第 3 簇峰 800 cm-1、870 cm-1 的谱带为芳香族 C-H 键,
降解后几乎消失,723 cm-1 为链烯烃以及碳数≥ 7
的直链烷烃亚甲基,细菌作用后也几乎消失。
A B
A :对照 ;B :降解组
a: 对照组 ; b: 降解组
图 1 原油 wle-菌群
图 2 原油降解的中红外光谱图
a
500100015002000250030003500
Wavenumber cm1
20
40
60
80
10
0
Tr
an
sm
itt
an
ce
%
b
图 3 烷烃标准物气相色谱图
图 4 烷烃标准曲线
y = 0.0791x - 0.0986
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4 6 8 10 12
LA⎃ᓖ˄mg/mL˅
ጠ䶒

R2 = 0.9985
全部乳化成絮状物,此时培养基由澄清淡、黄色、
不透明变为深褐色,浑浊、不透明(图 1)。
对原油进行全波长扫描分析后,可见被测石油
在波长 225 nm 处有明显的吸收,故试验采用 225 nm
作为测定波长。根据公式利用 UV 法测得这些细菌
对原油的降解率为 58%。
表 1 GC 法标准曲线测定结果
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
0 50 100 200 300 350250150
0.51.0
1.5
0.5
1.5
2.5
3.5
4.5
C11
C12
C13
C14
C16
C18 C19
C20
C21 C24
C22
C23
C25
C26
Pr
Ph
0
Ѡᓖ
浓度(mg/mL) 峰面积
2 0.055 49
4 0.227 638
6 0.376 712
8 0.519 99
10 0.700 298
2013年第1期 181王中华等 :原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究
a :对照组 ;b :降解组
图 5 原油降解的气相色谱图
图 6 菌群电镜照片(8 000×)
烷烃标准物的气相色谱图如图 3 所示,各个组
分分离较好,nC10-nC25 清晰谱峰,通过保留时间
可知各沸点烷烃的出峰位置。5 个不同浓度的烷烃
标准物和气相色谱峰面积得到标准曲线(表 1,图
4)。样品和峰面积存在一定联系,随着样品浓度增加,
峰面积也相应变大,呈线性关系。
由原油降解的气相色谱图(图 5)可知,原油经
W-菌群降解处理后气相色谱图中各个组分的色谱峰
几乎消失,只有 C16-C19 还有较弱吸收峰,其余大部
分烷烃都已降解。菌群降解原油 7 d 后,保留时间在
8 min 之前的低沸点饱和烷烃几乎全部降解,说明从
原油中培养得到的微生物群落有很强的降解能力。
2.2 降解菌体系的微生物多样性组成
原油中培养出的细菌种类繁多,通过菌的扫描
电镜照片(图 6),可见细菌呈现不同形状,有短杆
阳性克隆子进行测序分析,结果输入 NCBI 数据库
进行比对和归类分析,结果(表 2)显示序列相似
性最高为 99%,最低为 89%,其中有 94% 分别属于
Proteobacteria 类群(α-Proteobacteria 和 β-Proteobacte-
ria 变形菌门)和 Firmicutes 类群,而 6% 的克隆子
与已知类群相似性较低,在 GenBank 数据库中未找
到与其相似的已知细菌序列,属于未知类群,与未
获培养细菌 marine bacterium(EU741662)和 Uncul-
tured bacterium(EU741663) 的 同 源 性 分 别 为 90%
和 89%。其中,Proteobacteria 类群是文库中第一大
类群,而苍白杆菌属又是其中数量最多的一类 ;在
Firmicutes 类群中,所占百分比最多的是芽孢杆菌属
细菌。根据测得的 16S rDNA 序列构建降解菌体系系
统发育树(图 7)。
2.3 降解菌的鉴定
对所分离的降解菌中降解率超过 50% 的 5 号菌
株命名为 Wle-5,经多次分离纯化后进行分子鉴定,
结果显示,Wle-5 菌株的 16S rRNA 序列与短小芽孢
杆菌(Bacillus pumilus)的 16S rRNA 序列相似性为
100% ;测序列已提交到 GenBank 数据库中,登录号
为 EU789571。同时对所筛选得的细菌通过微生物自
状,长杆状,八叠体等,这些细菌构成一个微小生
态群落,使得原油的外观状态发生改变,说明其中
一定含有高效降解菌。
为进一步研究降解菌体系中的微生物群落结构
的组成,构建了降解菌体系的克隆文库,随机挑取
4.0
Ѡᓖ
Ѡᓖ
3.0
2.0
1.0
0.0
50 10 20 302515 5 15 252010
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
C10
C11
C12
C13
C14
C15
C16
C17
C18
C19C20
C21
C22
C23C24
C25
C27
C28 C29 C19
C18C17C16
a b
؍⮉ᰦ䰤 min ؍⮉ᰦ䰤 min
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期182
编号 相近物种(NCBI 登录号) 相似性(%) 系统类群
Wle1 Brevundimonas diminnta EU741653 99 α-Proteobacteria
Wle2 Nitratireductor aquibiodomus EU74164 97 α-Proteobacteria
Wle3 Mesorhizobium sp. EU741655 99 α-Proteobacteria
Wle4 Ochrobactrum sp. EU741656 99 α-Proteobacteria
Wle5 Ochrobactrum sp. EU741657 99 α-Proteobacteria
Wle6 Achromobacterinsolitus EU741658 99 β-Proteobacteria
Wle7 Sporosarcina sp. EU741661 89 Firmicutes
Wle8 Bacillus sp. B3 EU741660 96 Firmicutes
Wle9 Marine bacterium EU741662 90 未知类群
Wle10 Uncultured bacterium EU741663 89 未知类群
788
Wle3
1000
1000
840
Wle4
681
Wle5
629
1000
Wle10
Sporosarcin sp.
743
951
995
Wle1
Brevundimonas diminnta
884
425
415
1000
Wle9
Sinorhizobium sp.
Rhizobium sp.
994
988
Wle2
Pseudaminobacte sp.
Nitratireductor aquibiodomus
Mesorhizobium sp.999
908
594
1000
768
633
1000
1000
999
797
Pseudomonas diminuta
Aminobacter sp.
Aminobacter aminovorans
Chelatobacte sp.
Uncultured bacterium clone
Mesorhizobium sp.G2DM29
Ochrobactrum sp.MedZ1.3
Ochrobactrum sp.ROi15
Clostridium sp.
Uncultured bacterium partial
Bacterium SUR5-3
Caulobacter sp.
Pseudaminobacter sp.W1-14
Burkholderia sp.
Chelatobacte sp.Pht-3B
图 7 石油降解菌系统发育
动鉴定系统进行分析,鉴定结果表明 Wle-5 为短小
芽孢杆菌(Bacillus pumilus)与分子生物学鉴定结果
相吻合,可以确定所分离的株菌为短小芽孢杆菌。
表 2 原油 WLE 内源菌体系 16s rDNA 克隆库结果
2.4 降解菌降解能力的测定
2.4.1 红外光谱吸收的变化 原油在近红外谱区有特
征吸收峰,且不同种类的原油吸收峰形不同,而近红
2013年第1期 183王中华等 :原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究
e c
b
400050006000700080009000
Wavenumber cm1
0.
0
0.
2
0.
4
0.
6
0.
8
A
bs
or
ba
nc
e
U
ni
ts
a
d
图 8 Wle-5 降解原油近红外光谱图
a: 对照组 ; b-e: 降解 5 d、 10d、15 d、20 d
500100015002000250030003500
Wavenumber cm1
20
40
60
80
10
0
Tr
an
sm
itt
an
ce
%
a
b
图 9 Wle-5 降解原油中红外光谱图
a: 对照组 ;b :降解组
图 10 wle-5 菌株降解原油的气相色谱图
a: 降解 7d ;b: 降解 14 d ;c: 降解 21d
样品 ∑ nC21/ ∑ nC22 Pr/nC27 Ph/nC28 Pr/nC17 Ph/nC18
空白油 1.35 0.21 0.39 0.17 0.24
Wle-5 菌株 1.7 0.23 0.48 0.17 0.23
外光谱可检测到原油组分的细微变化。试验所用原
油在 4 000 cm-1-4 500 cm-1 和 5 600 cm-1-6 000 cm-1
的两簇普峰有强烈吸收,其中 4 000-1-4 500 cm-1 谱
区由 2 个主峰和 2 个小峰组成,特征峰最明显,这
是原油的“指纹区”。高效降解菌 Wle-5 对原油的降
解作用通过近红外光谱扫描所得结果,见图 8。随
着原油降解时间变长,原油特征峰信号都逐渐减弱。
降解菌 Wle-5 对原油的降解 20 d 后通过中红外
光谱扫描所得结果,见图 9。光谱图中第三簇峰在
细菌作用 20 d 后都消失,说明原油的烯烃末端甲基
和亚甲基被氧化;第二簇峰信号减弱,但未完全消失,
原油的 C=O 键依旧存在 ;第一簇峰经 Wle-5 菌株
降解后显示,肩峰(2 960 cm-1)消失,主峰不明显
(2 920 cm-1)。
2.4.2 烷烃含量的变化 由原油降解的气相色谱分
析可知,经 Wle-5 降解处理后气相色谱图中各个组
分的色谱峰统一呈整体下降趋势,尤其是低沸点饱
和烃和部分芳香烃降解效果显著,表明其对不同结
构的烃类化合物均具有较强的降解能力。图 10-c 可
见,经过 21 d 的降解处理后,原油的残余量已经很少,
适当延长降解时间后,原油中烃类物质的降解率
增加。
表 3 两株菌作用前后原油饱和烃气相色谱分析结果
؍⮉ᰦ䰤 min
0.0
2.5 7.5 12.510 17.5 22.5 2520155.0 2.5 7.5 12.510 17.5 22.5 2520155.0 2.5 7.5 12.510 17.5 22.5 2520155.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Ѡᓖ
؍⮉ᰦ䰤 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Ѡᓖ
؍⮉ᰦ䰤 min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
Ѡᓖ
C12
C13
C14
C15C16
C17
C18C19
C20
C21 C23C24C25
C14
C15
C16
C17C18
C19C20
C21 C17
C18
C19
C20
C21
a b c
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期184
Wle-5 菌株降解原油 21 d 后,保留时间在 8 min
之前的低沸点饱和烷烃几乎全部降解,保留时间在
20 min 以后的高沸点饱和烷烃和芳香烃含量减少,
部分被降解。气相色谱分析数据显示(表 3),原油
经菌种作用以后,饱和烃碳链分布发生了明显的变
化,高碳链饱和烃的相对含量降低,低碳链饱和烃
的相对含量则相应增加。Wle-5 作用原油后,不同
程度地引起 Pr/nC27 与 Ph/nC28 值分别增加了 9.5%
和 23.1%,进一步从数据是上表明 Wle-5 对原油中
高碳链的饱和烷烃都具有生物降解作用。
3 讨论
原油在储藏和运输过程中所含的细菌可能与原
油具有附生关系,有些细菌在原油恶劣环境中突变,
受外界营养和温度等因素刺激后能利用原油为唯一
碳源。本研究从原油本身的附生细菌出发,经培养
所得 W-菌群,从菌群中分离得到一株降解菌 Wle-5,
并对 W-菌群和 Wle-5 的降解能力进行了研究,从气
相色谱结果可以看出,W-菌群的降解能力要高于单
株降解菌 Wle-5,其原因可能是在同一培养基环境
中细菌形成了稳定的群落,通过它们之间的协同作
用,使得降解能力更强。
传统的富集筛选方法只能培养极少数的微生
物[8,9],同时也破坏了微生物之间的相互作用[10-12],
通过分析环境样品的 16S rDNA 克隆文库的序列可
以实现对样品中细菌多样性的研究[13]。本试验采用
分子生物学方法和传统培养方法相结合,研究了原
油中自有的微生物。构建了原油降解菌的克隆文库,
结果表明,Proteobacteria 类群和 Firmicutes 类群是文
库中两大类群,降解菌体系中存在能够降解原油的
微生物,而通过分离纯化的方法也得到一株原油降
解菌,紫外吸收法对其降解率研究表明其对原油具
有明显的降解效果。气相色谱分析结果显示,Wle-5
对某些低沸点饱和烃和部分芳香烃具有明显降解效
果,特别是不同结构的烃类化合物其结果尤为显著。
有研究表明,苍白杆菌属能有效降解脂肪族和
芳香族烃类[14],脲芽孢八叠球菌的发酵液有很强排
油活性及稳定的乳化能力[15]。从气相色谱和红外图
谱结果可以看出,原油中的烃类物质发生了降解,
从试验所拍摄到的混合菌体系的电镜照片中也可明
显看到类似八叠球菌形状的细菌,表明原油中仍可
能存在新的降解菌。微生物对烷烃的降解主要是在
多种酶的催化下进行的,其方式主要包括,末端氧化、
亚末端氧化和 ω 氧化[16-21]。本研究中所分离的降解
菌的中红外结果表明,烯烃末端甲基和亚甲基被氧
化,表明该菌对原油降解也可能是在单加氧酶作用
下发生的。
4 结论
(1)加入营养物刺激后获得了原油降解菌体系,
该混合菌体系对原油烃类物质具有明显的降解效果。
对降解菌体系进行研究表明,降解菌体系生物多样
性较为丰富,含有多种原油降解菌,共同完成原油
的降解。Proteobacteria 类群和 Firmicutes 类群为降解
菌体系中的主要类群。
(2)从原油中分开得到降解菌 Wle-5,经鉴定
为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
(3)红外光谱显示 3 000 cm-1,2 855 cm-1 1 377
cm-1 等处的原油特征峰,降解后振动减弱或消失,
原油发生降解。
(4)气相色谱和红外光谱结果表明,经 21 d 的
降解处理后,原油烃大幅减少。适当延长降解时间,
原油中烃类物质的降解率增加。
参 考 文 献
[1] Balba MT, Awadhi NA, Daher RA. Bioremediation of oil contami-
nated soil microbiological methods for feasibility assessment and field
evaluation[J]. Journal of Microbiological Methods, 1998, 32 :
155-164.
[2] 丁明宇 , 黄健 , 李永祺 . 海洋微生物降解石油的研究[J]. 环
境科学学报 , 2001, 21(1):84-88.
[3] Maneerat S, Bamba T, Harada K, et al. A novel crude oil emulsifier
excreted in the culture supernatant of a marine bacterium, Myroides
sp. strain SM1[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 70 :254-
259.
[4] Mimmi TH, Alexander W, Ellingsen ET, et al Identification of novel
genes involved in long-chain n-Alkane degradation by Acinetobacter
sp. strain DSM 17874[J]. Appled Environmental Microbiology,
2007, 73(10):3327-3332
[5] Kishore D, Ashis KM. Crude petroleum-oil biodegradation eYciency
2013年第1期 185王中华等 :原油微生物群落构成及降解菌降解特性的研究
of Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains isolated from
a petroleum-oil contaminated soil from North-East India[J].Biore-
source Technology, 2007, 98 :1339-1345.
[6] 于晓丽 . 油气田废水中石油类物质测定问题的探讨[J]. 油气
田环境保护 , 1994, 4(2):34-37.
[7] Zhou JL. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in water
and surface sediments from Data Bay[J]. China Environmental
Pollution, 2003, 12(1):269-281.
[8] Rahman MH, Suzuki S, Kawai K. Formation of viable but non-
culturable state(VBNC)of Aeromonas hydrophila and its virulence
in Goldfish, Carassius auratus[J]. Microbiological Research,
2001, 156(1):103-106.
[9] Dianne KN, Jillian FB. Geomicrobiology :howmolecular-scale
interactions underpin biogeochemical systems[J]. Science, 2002,
296(5570):10-71.
[10] Tarasov AL, Borzenkov IA, Milekhina EI. Dynamics of microbial
processes in the stratal waters of the Romashkinskoe oil field[J].
Microbiology, 2002, 71(6):735-742.
[11] Nazina TN, Grigoryan AA, Xue YF, et al. Phylogenetic diversity of
aerobic saprotrophic bacteria isolated from the Daqing oil field[J].
Microbiology, 2002. 71(1):91-97.
[12] Liu JF, Mu BZ. Extreme environment of oil reservoir and associated
microorganisms[J]. Microbiology, 2004, 24(4):31-34.
[13] Darby AC, Birkle LM, Tumer SI, et al. An aphidbome bacterium all-
ied to the secondary symbionts of whitefly[J]. Microbial Ecolo-
gical, 2001, 36 :43-50.
[14] Katsivela E, Edward RB, et al. Biodegradation of aliphatic and aro-
matic hydrocarbons :specificity among bacteria isolated from refi-
nerywaste sludge[J]. Water, Air, and Soil Pollution, 2003, 3 :
103-115.
[15] 王靖 , 刘元琴 , 姜凯 , 等 . 嗜蜡菌 R 的代谢特性及其摄取烷
烃的机理研究[J]. 中国石油大学学报 , 2007, 31(3):143-
147.
[16] Kemp PF, Aller JY. Bacterial diversity in aquatic and other enviro-
nments :what 16S rDNA libraries can tell us[J]. Microbiology
Ecology, 2004, 47 :161-177.
[17] Kotani T, Kawashima Y, Yurimoto H, et al. Gene structure and
regulation of alkane monooxygenases in propane-utilizing Mycoba-
cterium sp. TY-6 and Pseudonocardia sp. TY-7 The Society for
Biotechnology[J]. 2006, 102(3):184-192.
[18] van Beilen JB, Smits THM, Whyte LG, et al. Alkane hydroxylase ho-
mologues in Gram-positive strains[J]. Environmental Micro-
biology, 2002, 4(11):676-682.
[19] Smits TH, Rothlisberger M, Witholt B, van Beilen JB. Molecular sc-
reening for alkane hydroxylase genes in Gram-negative and Gram-
positive strains[J]. Environmental Microbiology, 1999, 1(4):
307-317.
[20] Whyte LG, Smits THM, Labbe D, et al. Gene cloning and characte-
rization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus
strains Q15 and NRRL B-16531[J]. Appled And Environmental
Microbiology, 2002, 68(12)5933-5942.
[21] Kahng HY, Malinverni JC, Majko MM, et al. Genetic and functional
analysis of the tbc operons for catabolism of alkyl and chloroaromatic
compounds in Burkholderia sp. strain JS150[J]. Appl Environ
Microbiol, 2001, 67 :4805-4816.
(责任编辑 李楠)