全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第3期
收稿日期 : 2011-07-25
基金项目 : 甘肃省国际科技合作项目（0708WCGA140）, 甘肃省科学院应用技术研究与开发计划项目（2007YS-JK-05）, 甘肃省工业生物过
程工程创新服务平台资助项目（094TTPA002）　
作者简介 : 王沛雅 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 植物分子育种与基因工程 ; E-mail: wpeiya@yahoo.cn
通讯作者 : 杨晖 , 女 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 基因工程、发酵工程及生物工程等 ; E-mail: yanghui43@163.com
农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立
王沛雅1, 2 杨晖1, 2 杨涛1, 2 张军1, 2 郭琪1, 2 强维亚4 周剑平2, 3
（1 甘肃省科学院生物研究所，兰州 730000 ；2 甘肃省工业微生物工程技术研究中心，兰州 730000 ；3 甘肃省科学院，兰州 730000 ；
4 兰州大学生命科学学院，兰州 730000）
摘 要： 以兼具生态和能源植物功能的木本模式植物——杨树（河北杨）为材料，研究了携带促生长基因（35S-DAS5）的
根癌农杆菌载体介导的河北杨遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示，较适宜的转化系统为预培养2-4 d，农杆菌菌液（OD600
值为 0.4）侵染 20 min，共培养 4 d，在含 30 mg/L卡那霉素（Km）的培养基上诱导不定芽，生根培养基中 Km的适宜浓度为 10 mg/L。
关键词： 河北杨 根癌农杆菌 GV3101 35S-DAS5 遗传转化体系
Establishment of System for Genetic Transformation of Agrobacterium
tumefaciens Mediated Transformation of Populus hopeiensis with
Growth-promoting Gene
Wang Peiya1, 2 Yang Hui1, 2 Yang Tao1, 2 Zhang Jun1, 2 Guo Qi1, 2 Qiang Weiya4 Zhou Jianping2, 3
（1Institute of Biology，Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000；2 Industrial Microbiology Engineering Research Center in Gansu，
Lanzhou 730000；3Gansu Academy of Sciences，Lanzhou 730000；4College of Life Science，Lanzhou University，Lanzhou 730000）
Abstract: Several factors affecting transformation of Populus hopeiensis were studied by infecting with Agrobacterium tumefaciens
GV3101, such as pre-culture time, adding AS, Agrobacterium concentration, infection time, co-culture time, concentration of kanamycin used
for selection and adding time, of which the frequency of kanamycin resistance buds was used as measure standard. The superior transformation
system was as following, pre-cultured 2-4 days and then infected 20 minutes in Agrobacterium diluted（OD600=0.4）, co-cultured 4 days,
transgenic tissues and shoots were selected with 30 mg/L Km and rooting stage with 10 mg/L Km.
Key words: Populus hopeiensis Agrobacterium tumefaciens GV3101 35S-DAS5 Genetic transformation
杨树是传统的造林绿化和解决木材短缺最具潜
力的树种，其速生且生物质产量高，又是很好的可
再生生物质能源植物［1］。杨树基因组小，易于基因
工程操作，被认为是林木基因工程中的理想模式树
种［2, 3］。河北杨（P. hopeiensis Hu et Chow），属杨柳
科杨属白杨派，其根系发达，抗逆性强，是广泛分
布于我国华北及西北地区的重要水土保持和造林优
良树种。自 1987 年 Fillatti 等［4］首次获得抗除草剂
转基因杨树植株以来，杨树遗传转化研究和应用取
得了较大进展，包括抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂
及材性改良等方面。
国内外对农杆菌介导的杨树遗传转化多有报道，
但是植物的基因型和农杆菌菌株对遗传转化效率影
响很大，对同一植物插入不同外源基因片段及用不
同菌株载体接种，所需转化条件差异较大。目前尚
未见有关胭脂碱型农杆菌 GV3101 菌株介导的河北
杨的遗传转化报道。本研究选用河北杨组培无菌苗
叶片作为受体材料，将外源促生长基因 35S-DAS5 通
过 GV3101 菌株导入河北杨，通过对一些影响受体
转化关键因素的试验和分析，试图建立高效的促生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期142
长载体侵染河北杨叶盘遗传转化体系，旨在为河北
杨转基因植株的培养、筛选和生长奠定基础，以获
得促进生长的转基因河北杨新品系，适应西北地区
对生态保护和能源植物的需求。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 转化材料 河北杨无菌苗由甘肃农业大学李
毅教授惠赠，本实验室通过继代和扩繁获得转化用
叶片。
1.1.2 载体及菌株 携带 35S-DAS5 基因的质粒（由
美国斯坦福卡内基研究所构建）保存于大肠杆菌（Es-
cherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers）DH5α，
使用时提取并转入土壤根癌农杆菌（Agrobacterium
tumefaciens（Smith et Townsend）Conn）GV3101 菌株，
成为试验用载体菌液。-80℃长期保存。使用前取少
量涂布平板，挑单克隆菌株 PCR 鉴定。阳性菌株在
28℃培养至一定浓度（以 OD600 读数为准）后侵染
受体。图 1 为载体示意图。
侵染过程 ：选取全绿、平展的健康叶片（顶芽
下 3-5 片叶），于垂直主叶脉方向剪成 0.5 cm 宽的长
条状，远轴面向下平铺于分化培养基上，黑暗中预
培养1-8 d。向OD600 值为 0.2-0.9的稀释载体菌液 （2
次摇菌后收集离心沉淀物重悬）中添加 0-200 μmol/L
AS，侵染经过预培养的叶片受体 5-25 min，期间不
断轻摇，使叶盘与菌液充分接触。侵染结束后将叶盘
表面菌液吸干，远轴面向下平铺于分化培养基上，黑
暗中共培养 2-8 d。之后于恢复培养基上培养 0-12 d
后转移至选择培养基，培养到抗性芽高于 1.5 cm 时
将抗性芽转入生根培养基使其长成完整植株。
采用 MS 基本培养基，添加 0.1 g/L 肌醇，6 g/L
琼脂，pH5.8；侵染后受体在光照培养箱中培养，光/暗
为 16 h/8 h，温度 22-25℃。不同培养基中添加的激
素（单位 ：mg/L）如下 ：
分化培养基：1/2MS+0.25 BA+0.25 IAA+0.01 TDZ+
3% 蔗糖。
恢复培养基：1/2MS+0.25 BA+0.25 IAA+0.01 TDZ+
300 羧苄青霉素（Carb）+3% 蔗糖。
选择培养基：1/2MS+0.25 BA+0.25 IAA+0.01 TDZ+
300 Carb+30 卡那霉素（Km）+3% 蔗糖。
生根培养基 ：1/2MS + 0.1 IBA + 150 Carb + 10
Km + 2% 蔗糖。
所有试验均为每个处理检测 40 个叶盘，重复 3
次，取其平均值。采用卡那霉素抗性芽的分化率（%）
和增殖系数作为评价转化效果的指标，其计算方法
如下 ：
分化率（%）= 再生抗性芽的叶片数 / 接种叶片
数 ×100%
增殖系数 = 叶片再生抗性芽总数 / 再生抗性芽
的叶片数
1.2.2 数据分析 利用方差分析软件 DPS 对数据进
行差异显著性分析。
2 结果
2.1 预培养时间对转化的影响
按照前述方法取样，远轴面向下平铺于分化培
养基上。22-25℃，黑暗，分别预培养 1、2、4 和 8 d，
侵染菌液浓度 OD600 值约 0.4，侵染叶盘 10 min，共
培养 4 d，延迟筛选 7 d，统计转化后获得的抗性芽
P-35S 代表 CaMV35S 基因启动子；DAS5 代表插入载体的外源基因片段；
T-rbcs 代表 rbcs 终止子 ；Spec 为细菌选择标记壮观霉素抗性基因 ；Km
为植物选择标记卡那霉素抗性基因
图 1 CHF3-DAS5 载体质粒图谱
1.2 方法
1.2.1 转化体系参数优化 农杆菌介导的植物遗传
转化中，影响农杆菌侵染效果的因素有很多，而且
各因素之间可能存在交互作用。为了消除交互作用
对试验结果的影响，降低分析的难度，分别在保持
其他因素相同的条件下进行单因素试验，评价各因
素对农杆菌 GV3101 菌株侵染河北杨叶盘的影响效
果，以确定最佳的侵染条件。
2012年第3期 143王沛雅等 ：农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立
百分率及增殖系数见表 1。
试验结果（表 1）表明，适当的预培养可以提
高叶盘的再生分化率。预培养 1 d 时的再生分化率
较低（48.3%），再生芽生长细弱，不利于卡那霉素
抗性苗的获得 ；预培养 2-8 d 的叶盘再生分化率较
高（80% 左右），之间差异不显著，再生芽生长健壮。
由于预培养 2-4 d 获得的高于 2 cm 的抗性再生芽较
预培养 8 d 的多，有利于抗性苗的获得，所以选择 2-4
d 作为预培养的时间。
2.2 乙酰丁香酮（AS）对转化的影响
分别向渗透培养基（1/2MS）中添加 0、50、
100 和 200 μmol/L 的 AS 重悬稀释菌体，侵染菌液
浓度 OD600 值约 0.4，侵染预培养 2 d 的叶盘 10 min，
共培养 4 d，延迟筛选 7 d，以转化后获得的抗性芽
百分率及增殖系数作为评价指标（表 2）。
表 1 预培养时间对河北杨转化影响
预培养时间（d） 开始分化芽时间（d） 分化率（%） 增殖系数 再生状态
1 25 48.3 bB 3.2 部分叶片褐化死亡，再生芽较细弱
2 14 78.3 aA 5 叶片较厚 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 30%
4 14 81.7 aA 6.1 叶片较厚 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 30%
8 18 80.8 aA 5.6 叶片较厚 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 20%
在本研究中，向侵染菌液中添加 AS，对于河
北杨卡那霉素抗性芽的获得并无促进作用，随着
浓度的增大反而会抑制被侵染叶盘的生长，使部
分叶盘褐化死亡（表 2）。在不添加 AS 时的再生
分化率较高（79.2%），与其他添加 AS 的效果有
显著差异，可能是由于河北杨叶片在受到损伤时
会产生较多酚类物质，再额外加入 AS 等酚类物质
后，反而会对植物材料产生毒害作用，使其褐化
死亡。因此在该试验条件下不需向侵染菌液中添
加 AS。
2.3 菌液侵染浓度对转化的影响
用渗透培养基分别将离心后菌体的浓度 OD600
稀释至 0.2、0.4、0.6 和 0.9，侵染预培养 2 d 的叶盘
10 min，共培养 4 d，延迟筛选 7 d，以转化后获得
的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表 3）。
遗传转化中，侵染细菌的浓度对转化率的影响
很大。浓度过低时，农杆菌与外植体接触的几率减少，
不足以附着于外植体切口处，导致转化率降低 ；如
果菌液浓度过高，菌体本身易相互聚结，影响其在
外植体上的附着，同时会使外植体产生过敏性反应，
丧失分化不定芽的能力，而且再生阶段农杆菌也不
能被有效抑制。根据所选受体材料的不同，菌液侵
染浓度差别也较大。
本研究中不同的菌液侵染浓度对侵染效果的影
响极显著（表 3）。菌液侵染浓度 OD600 在 0.2 时分
化率只有 28.3%，浓度为 0.4 时的分化率达 80%，之
后随着浓度的增高分化率降低，当浓度达到 0.9 时
叶盘全部死亡。本试验中，菌液侵染浓度 OD600 为 0.4
时有利于获得较多生长健壮的卡那霉素抗性芽，故
将农杆菌菌液离心收集物重悬稀释至 0.4 进行侵染。
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）
表 2 AS对河北杨转化影响
AS 浓度（μmol/L） 开始分化芽时间（d） 分化率（%） 增殖系数 再生状态
0 15 79.2 aA 5.2 叶片较厚 ；再生芽较强壮
50 16 70.8 bAB 4.8 叶片较厚 ；再生芽生长良好
100 15 69.2 bBC 3.9 叶片微增厚，部分叶片褐化死亡 ；再生芽生长良好
200 17 61.7 cC 3.1 叶片微增厚，部分叶片褐化死亡 ；再生芽生长良好
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期144
2.4 侵染时间对转化的影响
分别侵染预培养 2 d 的叶盘 5、10、15、20 和
25 min ，菌液浓度 OD600 约 0.4，共培养 4 d，延迟
筛选 7 d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数
作为评价指标（表 4）。
若农杆菌侵染外植体时间过短，不能让足够的
农杆菌附着于外植体切口处，会使转化频率大大降
低；侵染时间过长，会使过多农杆菌附着在外植体上，
对植物组织产生毒害，使外植体褐化死亡。本研究中，
侵染叶盘 5-25 min 都可以达到较高的分化率，随着
侵染时间的增长，获得的抗性芽也随之增加。经 5
min 侵染后的分化率与侵染 10-25 min 有显著差异，
侵染 10-25 min 之间的差异不显著，侵染 20-25 min
的再生分化率达 81.7%，而侵染 20 min 的增殖系数
较高（5.8），又由于侵染 20 min 可获得较多高于 2
cm 的再生抗性芽，有利于后期成苗需要，故将侵染
时间选择在 20 min 左右即可（表 4）。
表 3 农杆菌菌液浓度对河北杨转化影响
菌液浓度（OD600） 开始分化芽时间（d） 分化率（%） 增殖系数 再生状态
0.2 20 28.3 cC 2.5 叶片较薄 ；再生芽较弱
0.4 15 80.8 aA 5.1 叶片较厚 ；再生芽较强壮
0.6 20 39.2 bB 3.3 叶片较薄，有近半数叶片褐化死亡 ；再生芽较细弱
0.9 — 0 dD 0 叶片均褐化死亡
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）
2.5 共培养时间对转化的影响
用 OD600 值约 0.4 的菌液侵染预培养 2 d 的叶盘
20 min，分别于黑暗中共培养 2、4、6 和 8 d，延迟
筛选 7 d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数
作为评价指标（表 5）。
在共培养阶段，携带有目的基因的 T-DNA 在根
癌土壤杆菌体内完成加工，向植物细胞转移，从而
整合进植物基因组。农杆菌和植物共培养是整个转
化过程中最重要的环节，因为农杆菌的附着、T-DNA
的转移及整合都在共培养期间完成。因此，共培养
时间的长短，直接影响到目的基因的整合及转化细
胞的数量，从而影响转化频率。本研究中，不同共
培养时间对侵染结果的影响差异较大（表 5），2 d
时分化率较低（62.5%），经 4 d 共培养后分化率可
达 80%，但是共培养 8 d 后的分化率又降到 17.5%。
表 4 侵染时间对河北杨转化影响
侵染时间（min） 开始分化芽时间（d） 分化率（%） 增殖系数 再生状态
5 15 70.8 bB 4.1 叶片较厚，卷曲 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 15%
10 14 78.3 aA 4.5 叶片较厚，卷曲 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 15%
15 15 80.0 aA 4.7 叶片较厚，卷曲 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 20%
20 16 81.7 aA 5.8 叶片较厚，卷曲 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 30%
25 15 81.7 aA 5 叶片较厚，卷曲 ；再生芽较强壮，高于 2 cm 的芽约占 20%
随着共培养时间的增加，叶盘上附着的农杆菌不断
繁殖增多，继而抑制了叶盘的分化再生，并对叶盘
造成损害使之死亡。本试验条件下选择在侵染后共
培养 4 d 较为适宜，有利于农杆菌的侵染和外植体
的健康生长，并可获得较多生长健壮的抗性再生芽。
2.6 卡那霉素（Km）选择压及选择时间的确定
2.6.1 Km 对分化的影响 将未经侵染的无菌组培苗
叶盘分别置于添加 0、15、30、50 和 100 mg/L Km 的
分化培养基上，培养 40 d 后观察叶盘分化情况
（表 6）。
由表 6 可以看出，河北杨叶盘对 Km 很敏感。
在不添加 Km 的分化培养基中培养的叶盘再生分化
率可达 85%，且叶盘与再生芽生长状态佳 ；当 Km
的浓度达到 15 mg/L 时，叶盘组织有轻微分化现象，
但不能分化成芽 ；Km 浓度超过 30 mg/L 时，叶盘无
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）
2012年第3期 145王沛雅等 ：农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立
分化现象，组织不能正常生长。所以，将 30 mg/L
作为河北杨叶盘侵染后的 Km 的临界选择压。
2.6.2 Km 对生根的影响 剪取高 3 cm 左右的无
菌组培苗顶尖部（包含 4-5 片叶片），插于添加 0、
10、15、20 和 25 mg/L Km 的生根培养基中（1/2MS+
0.1 mg/L IBA+0.1 g/L 肌醇 +20 g/L 蔗糖 +6 g/L 琼脂，
pH5.8），培养 40 d 后观察组培苗生根情况（表 7）。
由表7可以看到，河北杨无菌苗对Km十分敏感。
表 5 共培养时间对河北杨叶片转化影响
共培养时间（d） 开始分化芽时间（d） 分化率（%） 增殖系数 再生状态
2 15 62.5 bB 2.8 叶片较厚 ；再生芽较强壮
4 15 80.0 aA 5.3 叶片较厚 ；再生芽较强壮
6 18 37.5 cC 2.3 叶片较薄，农杆菌生长较多，致使近 2/3 叶片褐化死亡
8 20 17.5 dD 1.4 叶片较薄，农杆菌生长多，致叶片几乎都褐化死亡
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异显著（P<0.05）
表 6 不同浓度 Km对河北杨叶片分化影响
Km 浓度（mg/L） 总叶片数（个） 开始分化芽时间（d） 分化叶片数（个） 分化率（%） 再生状态
0 40 18 34 85 叶片较厚，翻卷 ；叶缘浅绿色，较厚 ；分化成芽
15 40 — 0 0 叶片较薄，微微卷曲 ；叶缘色浅，微微增厚
30 40 — 0 0 叶片较薄
50 40 — 0 0 叶片薄，色泽浅，有少数叶片褪绿死亡
100 40 — 0 0 叶片薄，色泽浅，有部分叶片褪绿死亡
无菌组培苗在不添加 Km 的生根培养基中生长良好，
生根率可达 100%，且苗、根生长健壮 ；当 Km 的浓
度达到 10 mg/L 时，组培苗就不能生根，继而死亡。
故采用 10 mg/L Km 作为侵染后的河北杨生根临界选
择压。
2.6.3 筛选时间对转化的影响 用 OD600 值约 0.4 的
菌液，侵染预培养 2 d 的叶盘 20 min，共培养 4 d，
分别在恢复培养基上培养 0、3、7 和 12 d 后置于添
加 30 mg/L Km 的选择培养基上培养，以转化后获得
的抗性芽百分率与抗性苗作为评价指标（表 8）。
由表 8 可看出，随着选择时间的延迟，被侵染
叶盘的再生分化率不断增高，获得的生长健壮的抗
性芽数随之增加。将侵染后的叶盘直接置于附加 Km
的选择培养基上与延迟筛选 7-12 d 相比差异显著，
直接筛选方式下的分化率较低 （63.3%），抗性芽较
少，但二者最终获得的抗性生根苗数相近。这与郝
贵霞等［11］对毛白杨的研究结果相似。可能是由于
表 7 Km对河北杨生根影响
Km 浓度（mg/L） 顶芽数（个） 开始生根时间（d） 生根率（%） 植株状况
0 20 8 100 根健壮 ；经 30 d 培养后，苗增高约 5 cm，植株健康
10 20 — 0 未生根，苗黄化，死亡
15 20 — 0 未生根，苗黄化，死亡
20 20 — 0 未生根，苗黄化，死亡
25 20 — 0 未生根，苗黄化，死亡
表 8 延迟选择时间对河北杨叶片转化影响
延迟筛选时间
（d）
开始分化芽时间
（d）
分化率
（%） 增殖系数
抗性苗
（株）
0 22 63.3 cB 3.3 3
3 18 72.5 bAB 3.8 3
7 15 81.7 aA 5.1 4
12 15 83.3 aA 6.3 4
同列中大写字母不同为差异极显著（P<0.01），小写字母不同为差异
显著（P<0.05）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第3期146
河北杨再生系统分化较快，延迟选择时间可使较多
非转化细胞进入分化状态，即使施加选择压也会有
很多非转化细胞分化成芽。本试验中直接筛选方式
下产生的抗性芽较少，这样可以减少筛选工作量，
而最终获得的抗性苗数与延迟筛选 7-12 d 的相近，
所以可采取直接选择作为筛选方式。
3 讨论
在植物遗传转化中，预培养的主要作用是促进
细胞分裂，因为处于分裂状态的细胞更易整合外源
DNA，提高转化率［5-7］。大量研究发现杨属植物预
培养时间一般较短。Confalonieri 等［3］转化欧洲黑
杨（Populus nigra L.）的试验表明，无预培养或预
培养 1 d，对欧洲黑杨的转化率没有显著影响，而研
究欧美杨（Populus euramericana Neva.）和美洲黑杨
（Populus deltoides Marsh.）的转化，预培养24 h较好［8］，
诸葛强等［5］发现预培养 8 h 有利于新疆杨的转化。
根癌土壤农杆菌只能感染植物的损伤部位，在植物
细胞损伤及修复过程中，植物细胞释放出一些化学
物质（酚类物质、酸性多糖等），这些诱导物可以通
过外膜蛋白将环境中的植物损伤信号传递到农杆菌
细胞内，最终引起vir基因的表达和T-DNA的转移［9］。
其中诱导效果最佳的为 AS，它可以使农杆菌质粒上
的 vir 基因活化，提高转化率［10, 11］，也有报道称 AS
对于转化效果没有明显影响［8, 12］。本研究中，预培
养 1 d 与 2 d 的结果有显著差异，而预培养 2-8 d 间
的差异不显著且转化频率较高，可以看出河北杨所
需的预培养时间不是很短 ；AS 对于河北杨的侵染转
化并没有促进效果，随着施加浓度的增加反而还会
产生一定的抑制作用。不同研究获得结果不一致，
可能与所选用菌株的类型、菌液浓度及植物材料有
关系［13］。
Km 能够有效抑制正常植物细胞的分化，因为
Km能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合
成，引起植物绿色器官的黄化，最终导致植物细胞
的死亡。而转基因植物由于含有 Km 抗性基因 （npt
II）而抑制了 Km 的作用，所以 Km 转化体就很容易
从非转化体中筛选出来［14］。选择压对转化效果影响
较大，由于外源基因从转入到表达所用时间不同，
因而选择剂的加入时间及浓度也应有所不同，应有
一段过渡期以使转化细胞来得及恢复生长并充分表
达外源基因。过早施加选择压或加入浓度过高，都
会降低转化频率。De Block［15］在进行杨树遗传转化
研究时发现，Clone 064 在含 Km 的选择培养基上不
分化，故先在选择培养基上筛选抗性愈伤组织，然
后将抗性愈伤组织转移到非选择性培养基上分化成
苗。郝贵霞等［16］转化毛白杨发现共培养后先在含
30 mg/L Km 的选择培养基上诱导分化，当抗性芽分
化后再移至抗生素 50 mg/L 培养基上进行筛选，将
转化频率提高到 5%。不同植物材料对于 Km 的敏感
度不一样，需要试验者进行实际摸索确定。
转化受体通常来自于植物的原生质体和外植体
组织（叶片、叶柄、下胚轴、茎段），转化受体也是
一个重要的影响因素。有研究发现茎段的诱导率高
于叶片［17］，也有研究表明杨树叶片是最好的受体材
料［6, 14］。范源伟等［18］通过 GUS 染色鉴定胡杨叶片
和茎段的转化率，发现叶片的转化率高达 80%，而
茎段的转化率仅有 30%，表明叶片更为适合作为转
基因材料。在对不同植物进行基因转化时，首先要
选择适宜的转化受体，这样才能事半功倍，建立一
个好的受体系统是基因转化的先决条件。
农杆菌载体转化是目前最成功的转化系统，
其缺点是宿主的局限性，在同一植物上的不同菌
株敏感性也不同。Confalonieri 等［19］以胭脂碱型
GV2260、C58、A281 和章鱼碱型 LBA4404 根癌农杆
菌转化黑杨无性系，胭脂碱型高出章鱼碱型载体许
多倍。Ahuja［20］认为一般林木对胭脂碱型菌株的敏
感度高于对章鱼碱型菌株的敏感度。Han 等［21］研究
表明对于一些顽抗的毛白杨杂交种的转化 EHA105
菌株优于 C58 和 LBA4404 菌株。而有的杨树对章鱼
碱型菌株 LBA4404 的敏感度较高，如 84K 杨、缘
毛杨（Populus ciliata Wall）、银腺杨等。本研究选
用的是胭脂碱型 GV3101 菌株作为载体侵染河北杨
叶盘，侵染时间在 5-25 min 之间所获得的抗性芽分
化率均高于 70%，且侵染时间在 10-25 min 之间的
分化率可达 80% 差异不显著，获得的抗性芽长势良
好。而贾小明等［12］用章鱼碱型 LBA4404 菌株侵染
河北杨叶盘，发现侵染时间在 5 min 时转化率较高
（7.4%-35%），超过10 min就会对叶盘产生严重伤害，
15 min 时叶盘全部坏死。由此可以看出，对于河北
2012年第3期 147王沛雅等 ：农杆菌介导的河北杨遗传转化体系的建立
杨叶盘转化来说，胭脂碱型 GV3101 菌株对叶盘的
伤害小，侵染效果佳，要优于章鱼碱型LBA4404菌株。
因此，选择对受体植物适宜的菌株是成功转化的重
要因素。
4 结论
本研究通过对影响河北杨遗传转化因素的研
究分析，可以得出采用根癌农杆菌 GV3101 菌株侵
染河北杨叶盘较适宜的转化系统为 ：预培养 2-4 d，
农杆菌菌液（2 次活化）离心沉淀重悬稀释至
OD600≈0.4 且不需添加 AS，侵染 20 min，共培养 4 d，
可不经恢复培养直接置于添加 30 mg/L Km 的选择培
养基上，待芽长至 1.5 cm 高时剪下移入添加 10 mg/L
Km 的生根培养基中，使其成完整植株。在这些影响
因素中，侵染菌液浓度和侵染后共培养时间对转化
结果影响较大，是遗传转化中的关键因素。
致谢：感谢 Dr. Zhiyong Wang（Carnegie Institution）提
供 35S-DAS5载体！
参 考 文 献
［1］ 尹伟伦 . 中国杨树栽培与利用研究［M］. 北京 : 中国林业出版
社 , 2005: 6.
［2］ 张勇 , 张守攻 , 齐力旺 . 杨树——林木基因组学研究的模式物
种 . 植物学通报 , 2006, 23（3）: 286-293.
［3］ Bruuner AM, Busov B, Strauss SH. Poplar genome sequence:
functional genomics in ecologically dominant plant species. Trends
in Plant Science, 2004, 9（1）: 49-56.
［4］ Fillatti JJ, Brain FL. Agrobacterium mediated transformation and
regeneration of poplar. Mol Gen Genet, 1987, 206（2）: 192-199.
［5］ 诸葛强 , 王婕琛 , 陈英 , 等 . 新疆杨高效遗传转化系统的建立 .
植物资源与环境学报 , 2003, 12（4）: 6-10.
［6］ Confalonieri M, Allegro G, Bisoffi S. Genetic transformation of
Populus nigra by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports,
1994, 13（5）: 256-261.
［7］ 赵世民 , 祖国诚 , 刘根齐 . 通过农杆菌介导法将兔防御 NP21 基
因导入毛白杨 . 遗传学报 , 1999, 26（6）: 711-714.
［8］ Confalonieri M, Balestrazzi A, Cella R. Genetic transformation of
Populus deltoids and P. euramericana clones using Agrobacterium
tumefaciens. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1997, 48（1）:
53-61.
［9］ Gelvin SB. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA
transfer and integration review. Annual Review of Phytopathology,
2000, 51（7）: 223-256.
［10］ Bolton GW, Nester EW, Gordon MP. Plant phenolic compounds
induce expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for
virulence. Science, 1986, 232（4753）:983-985.
［11］ 郝贵霞 , 朱桢 , 朱之悌 . 毛白杨遗传转化系统优化的研究 . 植
物学报 , 1999, 41（9）: 363-940.
［12］ 贾小明 , 樊军锋 . 影响农杆菌介导的河北杨遗传转化的因素 .
西北林学院学报 , 2006, 21（5）: 102-106.
［13］ Godwin I, Gordon T, Brain FL. The effects of acetosyringone and
pH on Agrobacterium mediated transformation vary according to
plant species. Plant Cell Reports, 1990, 9（9）: 671-675.
［14］ 王紫萱 , 易自力 . 卡那霉素在植物转基因中的应用及其抗性基
因的生物安全性评价 . 中国生物工程杂志 , 2003, 6（23）: 9-13.
［15］ De Block M. Factors influencing the tissue culture and the
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of hybrid aspen
and poplar clones. Plant Physiol, 1990, 93: 1110-1116.
［16］ 郝贵霞 , 朱祯 , 朱之悌 . 豇豆蛋白酶抑制剂基因转化毛白杨的
研究 . 植物学报 , 1999, 41（12）: 1276-1282.
［17］ Confalonieri M, Balestrazzi A, Bisoffi S, Cella R. Factors affecting
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in several
black poplar clones. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1995, 43
（3）: 215-222.
［18］ Han KH, Meilan R, Ma C. An Agrobacterium tumefaciens
transformation protocol effective on a variety of cottonwood hybrids
（genus Populus）. Plant Cell Reports, 2000, 19（3）: 315-320.
［19］ Confalonieri M, Belenghi B, Balestrazzi A. Transformation of elite
white poplar（Populus alba L. ）cv. ‘Villafranca’and evaluation
of herbicide resistance. Plant Cell Reports, 2000, 19（10）:
978-982.

（责任编辑 马鑫）