全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
收稿日期 : 2012-07-02
基金项目 : 国家科技支撑计划课题（2012BAK17B11）, 北京市国际科技合作专项（Z111105054611011）
作者简介 : 李辉 , 男 , 硕士 , 工程师 , 研究方向 : 微生物分类学 ; E-mail: andylihuilai@sina.com
通讯作者 : 程池 , 男 , 学士 , 教授级高工 , 研究方向 : 微生物学 ; E-mail: cheng100027@163.com
芝麻香型白酒是我国白酒十大香型之一，融合
浓香、酱香、清香型白酒的特点，以其优雅的芝麻
香味而闻名，高温制曲是芝麻香型白酒酿造重要特
点，是影响芝麻香型白酒特殊风味形成的关键环节。
嗜热细菌是高温大曲中最重要的微生物类群之
一，它们大都具有一定的糖化力、液化力和较高的
蛋白质分解力，能代谢酿酒原料中的蛋白、淀粉等
生成香味物质，研究表明其在单体培养条件下，大
多可产生芝麻香［1］。近年来，对高温细菌的研究和
一株芝麻香型白酒高温大曲的施莱格尔氏菌的
分离与鉴定
李辉1 李红1 姚粟1 葛媛媛1 信春晖2 许玲2 程池1
（1 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027 ；2 山东扳倒井股份有限公司，高青 256300）
摘 要 ： 从芝麻香型白酒高温大曲中分离到一株革兰氏阴性高温细菌 Zm91，并对其进行形态学、生理生化代谢特征以及细
胞代谢酶活性和药物敏感性分析，结合 16S rRNA 基因序列分析结果，Zm91 鉴定为水生施莱格尔氏菌（Schlegelella aquatica）。该
菌株是首次从我国芝麻香型白酒高温大曲中分离得到的施莱格尔氏菌，其 G+C mol% 含量为 67.5%，具有碱性磷酸盐酶、酯酶（C4）、
脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、颉氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及 α-葡萄糖苷酶活性，对青霉素、氨苄西林、
链霉素、利福平敏感。
关键词 ： 芝麻香型白酒 高温大曲 施莱格尔氏菌 分离 鉴定
Isolation and Identification of a Schlegelella sp. from High Temperature
Daqu of Sesame Flavor Liquor
Li Hui1 Li Hong1 Yao Su1 Ge Yuanyuan1 Xin Chunhui2 Xu Ling2 Cheng Chi1
（1China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027 ；
2Shandong Bandaojing Shares Co.，Ltd.，Gaoqing 256300）
Abstract: A gram-negative thermophilic bacteria Zm91 was isolated from high temperature Daqu of sesame flavor liquor, and
identificated by polyphasic taxonomy basing on morphologic and physiologic methods, drug susceptibility and enzyme activity test, 16S rRNA
gene analysis.The analysis result showed that Zm91 was belong to the known species of Schlegelella aquatica, which was the first time isolated
from high temperature Daqu of sesame flavor liquor, its G+C content was 67.5%, had enzyme activity of Alkaline phosphatase, C4 esterase, C8
lipase, leucine arylamidas, valine arylamidase, chymotrypsin, naphthol-AS-BI-phosphohydrolase and α-aglucosidase, and sensitive to Penicillin,
Ampicillin, Streptomycin and Rifampicin.
Key words: Sesame flavor liquor High temperature Daqu Schlegelella Isolation Identification
应用呈逐年上升趋势，施晓明等［2］对从堆积酒醅中
分离到 7 株嗜热细菌，并对其进行了鉴定。曹建全
等［3］分离筛选嗜热芽孢杆菌，并研制出高温细菌麸
曲，确定了在芝麻香型白酒中 10% 的最佳使用比例，
提高芝麻香型白酒优级品率 20% 左右，使酒体更加
丰满醇厚，芝麻香更优雅。本课题组姚粟等［4］曾采
用构建 16S rDNA 克隆文库的非培养方法，对芝麻香
型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性进行研
究，发现高温大曲中嗜热细菌为第一优势菌。此外，
2012年第11期 203李辉等 ：一株芝麻香型白酒高温大曲的施莱格尔氏菌的分离与鉴定
本课题组葛媛媛等利用传统的微生物培养方法亦发
现多种嗜热细菌，其中的 Zm91 菌株能够在 55℃条
件下旺盛生长，传代稳定不退化，呈现明显的嗜高
温特性（数据尚未发表）。本研究采用形态、生理生
化特性以及细胞代谢酶活性和药物敏感性分析，结
合 16S rRNA 基因序列分析方法对菌株 Zm91 进行多
相分类学研究，以确定其分类学地位，为进一步探
索该菌与芝麻香型白酒特殊风味的相关性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 Zm91，分离自山东扳倒井股份有限公
司芝麻香型白酒高温大曲 18# 曲房。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000
Marker 购自天为时代生物有限公司 ；GoldView 购自
北京塞百盛基因技术有限公司 ；溶菌酶购自 Sigma
公司、蛋白酶 K 购自 Merk 公司 ；其他化学药品均
为进口分析纯产品。
1.1.3 培养基 营养肉汁琼脂培养基 ：蛋白胨（5
g/L），牛肉膏（3 g/L），氯化钠（5 g/L），琼脂（15 g/L），
pH 值为 7.0。
10% 的 LB 培养基 ：蛋白胨 1.0 g，酵母粉 0.5 g，
NaCl 1.0 g，琼脂 15.0 g，蒸馏水 1.0 L，pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 在无菌条件下称取 10 g 高温大曲，
放入盛有 90 mL 无菌水带玻璃珠的三角瓶中，充分
振荡约 20 min，静置 5 min。采用梯度稀释法制备
10-2-10-6 的系列稀释液，分别涂布到营养肉汁琼脂
培养基中，在 55℃下培养 48 h。挑单菌落转接到新
鲜的营养肉汁琼脂斜面上于 4℃保藏。
1.2.2 形态学观察
1.2.2.1 菌体特征观察 将分离到的菌株 Zm91 在营
养肉汁琼脂培养基上 55℃培养 48 h 后革兰氏染色观
察其菌体形态。
1.2.2.2 培养特征观察 将检测菌划线接种在营养
肉汁琼脂培养基平板上，55℃培养 48 h 后，观察其
在培养基上的培养特征。
1.2.3 生理化特性 利用法国梅里埃公司生产的
API 20NE 试剂条对菌株生理生化指标进行测定，补
充温度生长试验。
1.2.4 药物敏感性测定 依据卫生行业标准 WS/
T125-1999 的方法［5］，检测菌株对青霉素、氨苄西林、
链霉素、利福平等抗生素的敏感性。
1.2.5 酶活性检测 利用法国梅里埃公司生产的
API ZYM 试剂条对菌株 19 种酶的活性进行检测，具
体步骤按其产品说明书进行 ：制备菌悬液，使其浑
浊度在 McFarland No.5 和 No.6 之间，接种 65 μL 菌
种于试验条的各个杯孔中，置于 37℃培养 4 h，之
后判读试验条。
1.2.6 G+C mol% 测定 采用热变性温度法测定菌种
的 G+C mol% 含量，试验参照 Marmur & Doty 的方法
进行［6］。
1.2.7 16S rRNA 基因序列分析
1.2.7.1 菌株基因组 DNA 提取 利用细菌基因组
DNA 提取试剂盒（Tiangen 公司）提取试验菌株基因
组 DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。提取的基因
组 DNA 用 0.8% 的琼脂糖进行检测。
1.2.7.2 16S rRNA 基 因 PCR 扩 增 和 序 列 测 定 以
基 因 组 DNA 为 模 板， 利 用 通 用 引 物 对 16S rRNA
基因进行扩增。引物序列为 ：正向引物 799f（5-
AACAGGATTAGATACCCTG-3），反向引物 1492r（5-
GGTTACCTTGTTACGACTT-3）。50 μL PCR 反 应 体
系 ：50 ng DNA 模板，1×Taq reaction buffer，引物各
20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq 酶（Ferments）。
反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 1 min，
52℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，30 个循环 ；72℃
延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1% 的琼脂糖进行检测。
纯化后的 PCR 产物用 ABI3700 基因测序仪测序。测
序由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。测序
结果用 Chromas 软件参照正反序列图谱人工校对。
1.2.7.3 系统发育树的构建 将测序得到的结果在
EzTaxon server 2.1 进行比对［7］，确定与已知序列的
同源关系。采用 CLUSTAL W 进行多序列比对［8］，
并利用邻接（NJ）法通过 MEGA 4 软件进行系统发
育及分子进化分析［9］。
2 结果
2.1 形态学观察
菌株 Zm91 在营养琼脂培养基上 55℃培养 24 h，
菌落呈乳白色，边缘齐整，表面光滑，大小＜ 1 mm
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期204
（图 1）。菌株为革兰氏阴性细菌，不产生孢子，细
胞呈棒状大小 0.8-2.0 μm×0.4-0.6 μm（图 2）。
2.2 生理生化特征和药物敏感性测定
菌株 Zm91 与水生施莱格尔氏菌 wcf1T、S. therm-
odepolymerans K14T 的生理生化特征、药物敏感试验
结果见表 2。Zm91 与水生施莱格尔氏菌 wcf1T 除硝
酸盐还原和苯乙醇同化试验结果不一致外其他结果
完全一致，与 S. thermodepolymerans K14T 仅在硝酸盐
还原和苯乙醇同化试验结果一样，其他指标均不一
样。水生施莱格尔氏菌 wcf1T 和 S. thermodepolymerans
K14T 理化特征来源于文献［10，11］。
2.3 酶活性检测
API ZYM 鉴定结果表明，菌株 Zm91 具有碱性
磷酸盐酶、酯酶（C4）、脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、
颉氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、萘酚-AS-BI-磷酸水
解酶及 α-葡萄糖苷酶的活力，具体结果见表 2。
2.4 G+C mol%测定结果
菌 株 Zm91 的 G+C mol% 含 量 为 67.5%， 接 近
于 水 生 施 莱 格 尔 氏 菌 wcf1T（G+C mol% 含 量 为
69.2%）和 S. thermodepolymerans K14T（G+C mol% 含
量为 70.0%），详见表 1。
图 1 菌株 Zm91 菌落特征
图 2 菌株 Zm91 细胞形态
1 μm
表 1 菌株 Zm91 生理生化特征
测定项目 Zm91 水生施莱格尔氏菌 wcf1T S.thermodepolymerans K14T
氧化酶 W W +
接触酶 - - +
胱氨酸芳胺酶 - - +
α-葡萄糖苷酶 + + -
硝酸盐还原 - + -
同化试验
L-阿拉伯糖 - - +
麦芽糖 + + -
己二酸 + + -
柠檬酸钠 - - +
苯乙醇 - + -
L-谷氨酸 - - +
抗生素敏感性试验
青霉素 S S R
氨苄西林 S S R
链霉素 S S R
利福平 S S R
最高生长温度（℃） 60 60 65
最适生长温度（℃） 50 50 50-55
分离源 高温大曲 温泉 活性污泥
DNA G+C 含量（mol%） 67.5 69.2 70.0
+. 阳性 ；-. 阴性 ；W. 反应弱 ；R. 抗性 ；S. 敏感
2012年第11期 205李辉等 ：一株芝麻香型白酒高温大曲的施莱格尔氏菌的分离与鉴定
2.5 16S rRNA基因系统发育分析
菌株 Zm91 的基因组 DNA 提取结果（图 3）显
示，所提取的 DNA 片段约为 23 kb，利用引物 799f
和 1492r 扩增得到 16S rRNA 基因片段，电泳结果（图
4）显示，PCR 产物仅有一条带，大小约为 750 bp。
以 Cupriavidus taiwanensis LMG 19424T（AF300324）
为外群，构建 Zm91 与相关模式菌株的系统发育树
（ 图 5）。Zm91 与 Schlegelella aquatica 的 模 式 菌 株
wcf1T 和菌株 Schlegelella sp. KB1a 聚类在一个系统发
育分支，序列同源性均为 99.0%，可确定 Zm91 为
Schlegelella sp.。
采用邻接法，根据菌株 16S rDNA 部分序列构
建的系统发育树。圆括号内为 GenBank 中的收录号。
每个分支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的
支持百分率。标尺代表 1% 的序列差异度。
3 讨论
施 莱 格 尔 氏 菌 属（Schlegelella） 是 Elbanna 等
在 2003 年首次分离并描述的，隶属于 β-变形菌纲
表２ 菌株 Zm91 的酶活性检测
测定的酶 活性 测定的酶 活性
碱性磷酸盐酶 + 萘酚-AS-BI-磷酸水解酶 +
酯酶（C4） + α-半乳糖苷酶 -
脂酯酶（C8） + β-半乳糖苷酶 -
脂肪酶（C14） - β-糖醛酸苷酶 -
白氨酸芳胺酶 + α-葡萄糖苷酶 +
颉氨酸芳胺酶 + β-葡萄糖苷酶 -
胱氨酸芳胺酶 - N-乙酰-葡萄糖胺酶 -
胰蛋白酶 - α-甘露糖苷酶 -
胰凝乳蛋白酶 + β-岩藻糖苷酶 -
酸性磷酸酶 w
+. 阳性 ；-. 阴性 ；W. 反应弱
23.1
kb
M 1
M. λDNA/Hind III Marker; 1. Zm91 基因组 DNA
图 3 菌株 Zm91 的基因组 DNA
750
bp
M 1
M. D2000 Marker Ladder; 1. Zm91 的 16S rRNA 基因片段
图 4 菌株 Zm91 的 16S rRNA 基因片段 PCR 扩增产物
72
0.01
54
99
96
99
100
Schlegelella thermodepolymerans K14T NR_025673
Schlegelella thermodepolymerans SA8 AY538708
Schlegelella thermodepolymerans KA1 AY538709
Schlegelella thermodepolymerans SA1 AY538707
ZM91
Schlegelella aquatica wcf1T NR_043802
Schlegelella sp. KB1a AY538706
Caldimonas taiwanensis NBRC 10443T AB682175
Caldimonas manganoxidans JCM 1069T NR_040787
Caldimonas hydrothermale Han-85T AM283038
Cupriavidus taiwanensis LMG 19424T AF300324
图 5 菌株 Zm91 16S rRNA 基因系统发育分析
的红长命菌亚群（Rubrivivax subgroup），为革兰氏
阴性杆菌，具运动性，不产孢子［11］。目前该属包含
S. thermodepolymerans 和 S. aquatica 两个种，属内部
分离菌株，可生成高温聚羟基脂肪酸酯（PHA）解
聚酶，降解 PHA 类化合物材料［11-13］，在环境保护
领域有广阔的应用前景，是近几年发现的一类重要
的嗜热细菌资源。目前国外分离的几株施莱格尔氏
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期206
菌主要来源于活性污泥、堆肥、温泉等生境，在国
内尚未见该属菌株的相关报道。
本研究自芝麻香型白酒高温大曲中分离到一株
嗜热细菌 Zm91，并对其进行形态学、生理生化代
谢特征以及细胞代谢酶活性和药物敏感性分析，同
时利用细菌通用引物对 Zm91 的 16S rRNA 基因进行
序列扩增和测定，并构建系统发育树进行分析比较，
Zm91 与 Schlegelella aquatica wcf1T 和 Schlegelella sp.
KB1a 具有最高的序列相似性为 99.0%，参考 Chou
等［10］的相关报道，最终确定菌株 Zm91 为水生施莱
格尔氏菌（Schlegelella aquatica）。该菌株为我国大
陆地区首次分离到的施莱格尔氏菌菌种，也是首次
从芝麻香型白酒高温大曲中被发现并分离得到。由
于高温细菌生长发育较快，分泌产生的代谢物种类
和性质可能会具有其特殊性，由此可以推测该菌在
芝麻香型白酒特殊性风味的形成过程中可能起到特
殊的作用，对其进行全面、准确的多相分类学鉴定
是研究其在白酒酿造过程中所发挥功能的必要前提。
此外，本研究还对 Zm91 进行相关酶的活性研究，
确定其具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶、白氨
酸芳胺酶、颉氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶
及 α-葡萄糖苷酶的活性，药物敏感性试验还表明，
该菌株对青霉素、氨苄西林、链霉素、利福平均敏感。
这些试验为进一步发挥该菌的生物学功能和实现其
生产利用价值奠定重要的基础。
4 结论
本研究针对自芝麻香型白酒高温大曲中分离得
到的一株革兰氏阴性耐高温细菌 Zm91 进行多相分
类学鉴定，并最终将 Zm91 鉴定为水生施莱格尔氏
菌（Schlegelella aquatica）。该菌株具有一些特殊的
生理生化特征、酶学活性及药物敏感性，且是首次
从我国芝麻香型白酒高温大曲中分离得到的施莱格
尔氏菌，具有重要的理论研究与实践应用价值。
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（责任编辑 马鑫）