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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
芝麻香型白酒是我国传统白酒的创新酒种之
一，以其独特的清浓酱融合的生产工艺特点和优雅
的芝麻香味而闻名，高温制曲是芝麻香型白酒酿造
的特点之一，也是芝麻香型白酒特殊风味形成的关
键环节之一。嗜热细菌是高温大曲中最重要的微生
物类群之一，它们大都具有一定的糖化力、液化力
和较高的蛋白质分解力，能代谢酿酒原料中的蛋
白、淀粉等生成香味物质，研究表明其在单体培养
收稿日期 : 2012-07-02
基金项目 : 国家科技支撑计划课题（2012BAK17B11）, 北京市国际科技合作专项（Z111105054611011）
作者简介 : 刘洋 , 男 , 博士 , 工程师 , 研究方向 : 微生物分子生物学 ; E-mail: ly81150@163.com
通讯作者 : 程池 , 男 , 学士 , 教授级高工 , 研究方向 : 微生物学 ; E-mail: cheng100027@163.com
一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定
刘洋1 赵婷1 姚粟1 葛媛媛1 信春晖2 许玲2 程池1
（1 中国食品发酵工业研究院 中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京 100027 ；2 山东扳倒井股份有限公司，高青 256300）
摘 要： 自芝麻香型白酒高温大曲中分离到一株嗜热放线菌 Zm60，对其进行形态学、生理生化代谢特征鉴定、化学成分分
析以及细胞代谢酶活性测定，并结合 16S rRNA基因序列分子生物学鉴定及系统发育学分析，结果表明，该菌株归属于高温放线菌
属（Thermoactinomyces sp.），并且可鉴定为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）。其最适生长温度为 55℃，细胞壁肽聚糖
及氨基酸分别为 meso-DAP及 Ala、Glu，醌为 MK-7，主要脂肪酸组成分别为 iso-C15 ：0（44.01%）、anteiso-C15 ：0（22.23%）、iso-C17 ：0
（14.16%）、anteiso-C17 ：0（7.56%）和 iso-C16 ：0（6.18%），具有碱性磷酸盐酶、酯酶、类脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶的活性。该
菌株是首次从我国芝麻香型白酒高温大曲中分离并鉴定得到的高温放线菌。
关键词： 芝麻香型白酒 高温大曲 普通高温放线菌 多相分类鉴定
Identification on a Thermoactinomyces sp. Separated from High
Temperature Daqu of Sesame Flavor Liquor
Liu Yang1 Zhao Ting1 Yao Su1 Ge Yuanyuan1 Xin Chunhui2 Xu Ling2 Cheng Chi1
（1China Center of Industrial Culture Collection，China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100027；
2Shandong Bandaojing Shares Co.，Ltd.，Gaoqing 256300）
Abstract: A thermophilic actinomycete Zm60 was isolated from high temperature Daqu of sesame flavor liquor, and identificated by
polyphasic taxonomy basing on morphologic and physiologic methods, chemical composition analysis, enzyme activity test and 16S rRNA gene
phylogenetic analysis. The result showed that the strain was a member of the genus Paenibacillus, and was belong to the known species of
Thermoactinomyces vulgaris. 55℃ was its optimum growth temperature. Cell-wall peptidoglycan and amino acids of the strain contained meso-
diaminopimelic acid, Ala and Glu, respectively. Its predominant respiratory quinone was MK-7. The predominant cellular fatty acids were
iso-C15 ：0 （44.01%）, anteiso-C15 ：0 （22.23%）, iso-C17 ：0 （14.16%）, anteiso-C17 ：0 （7.56%） and iso-C16 ：0 （6.18%）. Zm60 had enzyme
activity of Alkaline phosphatase, Esterase, Lipid esterase and Naphthol-AS-BI-phosphate hydrolase. Thermoactinomyces vulgaris Zm60 was
isolated from high temperature Daqu of sesame flavor liquor for the first time.
Key words: Zhima-flavor Chinese Liquor High temperature Daqu Thermoactinomyces vulgaris Polyphasic taxonomy
条件下，大多可产生芝麻香［1］。本课题组姚粟等［2］
曾采用构建 16S rDNA 克隆文库的非培养方法，对
芝麻香型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性
进行研究，发现普通嗜热放线菌（Thermoactinomyc
vulgaris）为大曲细菌群落中的第一优势菌，且该菌
在高温大曲中被发现尚属首次。此外，本课题组葛
媛媛等利用传统的微生物培养方法亦发现高温放线
菌属（Thermoactinomyces sp.）为大曲可培养细菌群
2012年第10期 211刘洋等 ：一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定
落中的优势菌属，其中的 Zm60 菌株能够在 55℃条
件下生长，而不能生长于 37℃，呈现明显的嗜高温
的特性（数据尚未发表）。本研究就其形态特征、培
养特征、生理生化特性及 16S rRNA 基因序列等方面
对此菌株进行多相分类学研究，以期将该菌准确鉴
定至“种”的水平，为进一步探索该菌与芝麻香型
白酒特殊风味的相关性奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 Zm60，分离自山东扳倒井股份有限公
司芝麻香型白酒高温大曲 18# 曲房。
1.1.2 主要试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000
Marker 购自天为时代生物有限公司 ；GoldView 购自
北京塞百盛基因技术有限公司 ；溶菌酶购自 Sigma
公司、蛋白酶 K 购自 Merk 公司 ；API ZYM 试剂条
购自法国梅里埃公司 ；其他化学药品均为进口分析
纯产品。
1.1.3 培养基 R2A 培养基、高氏 1 号琼脂、精麦
芽精琼脂（ISP2）、酵母燕麦粉琼脂（ISP3）、无机
盐淀粉琼脂（ISP4）及甘油天冬素琼脂（ISP5）。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离 在限菌条件下称取10 g 高温大曲，
放入盛有 90 mL 无菌水带玻璃珠的三角瓶中，充分
振荡 20 min，之后静置 5 min。采用梯度稀释法制备
10-2-10-6 的系列稀释液，分别涂布到 R2A 培养基中
在 55℃下培养 48 h。挑单菌落转接到新鲜的 R2A 斜
面上于 4℃保藏。
1.2.2 形态学观察
1.2.2.1 菌体特征观察 插片法培养 3 d 后观察是否
形成气生菌丝和孢子丝以及孢子丝的形态。
1.2.2.2 培养特征观察 将检测菌接种在高氏 1 号
琼脂、精麦芽精琼脂（ISP2）、酵母燕麦粉琼脂（ISP3）、
无机盐淀粉琼脂（ISP4）及甘油天冬素琼脂（ISP5），
于 55℃培养 3 d 后，开始观察各种培养基上的培养
特征。
1.2.3 温度敏感性测定 将检测菌接种在 R2A 培
养基斜面上，分别至于 37℃、45℃、55℃、60℃及
65℃五个温度梯度下培养 48 h 后，观察其生长状况。
1.2.4 生理化特性 生理化特性鉴定选取明胶液化、
淀粉水解、牛奶的凝固与胨化、硝酸盐还原和碳源
利用等方面进行。
1.2.4.1 明胶液化 将菌种接种于明胶培养基中，
于 55℃培养，分别在 3、5、10、20 和 30 d 观察培
养基液化程度。在观察前先将菌种管放入冰箱 30
min，如明胶凝成固体状态，说明不液化，如试管有
液体出现，说明明胶已被液化。
1.2.4.2 淀粉水解 将菌种接种在淀粉琼脂面板上，
于 55℃培养 10 d 后，在菌落周围滴加碘液，如菌落
周围呈现透明圈时，表示菌种产生淀粉酶。若菌落
周围染成蓝色，不出现透明圈者，说明该菌株不产
生淀粉酶。
1.2.4.3 牛奶的凝固与胨化 将菌种接种在脱脂牛
奶管中，于 55℃培养，分别在第 3、6、10、20、30 d
各观察一次，如果牛奶形成凝块，为凝固现象。再
继续培养，如凝块分解，则为胨化现象。
1.2.4.4 硝酸盐还原 将菌种接种在硝酸盐还原培
养液中，55℃培养 7 和 14 d，分别测定硝酸盐还原
的情况。测定时，培养液倒出 1 mL 于干净试管中，
分别加入硝酸盐还原试剂甲液和乙液各 2 滴，如呈
红色反应，即为阳性。
1.2.4.5 碳源利用 将碳源基础培养基融化，并冷
却至 55℃左右，倒入无菌培养皿内，凝固后备用。
将菌种的孢子制成孢子悬液，在上述基础培养基上，
每皿加 0.2 mL 孢子悬液，用无菌涂布棒均匀涂布，
然后在这个培养皿上划分若干小区，并用小刀划沟
为界，分别将各种糖挑加在各小区上，每个培养皿
必须留一无糖对照区。将培养皿置 55℃培养 7-14 d，
分别观察记录生长情况。
1.2.4.6 酶活性检测 采用 API ZYM 试剂条对菌株
19 种酶的活性进行检测，具体步骤按其产品说明书
进行 ：制备菌悬液，使其浑浊度在 McFarland No. 5
和 No. 6 之间，接种 65 μL 菌种于试验条的各个杯孔
中，置于 50℃培养 4 h，之后判读试验条。
1.2.5 化成成分分析
1.2.5.1 脂肪酸的测定
（1）收集菌体 采用三区划线方法，培养 24 h，
用普通接种环获取已培养好的二区菌株约 40 mg 到
10 mL 带聚四氟乙烯塞的试管中。
（2） 脂肪酸的提取
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期212
1）配制溶液 溶液 I，45 g 氢氧化钠溶于 150
mL 甲醇及 150 mL 蒸馏水；溶液 II，190 mL 浓盐酸，
275 mL 甲醇溶于 135 mL 蒸馏水 ；溶液 III，200 mL
正己烷与 200 mL 乙醚混合均匀 ；溶液 IV，10.8 g 氢
氧化钠溶于900 mL蒸馏水；溶液V，饱和氯化钠溶液。
2）皂化 加入 1.0±0.1 mL 的试剂Ⅰ，沸水或
循环水 95-100℃水浴，5 min 之后，从沸腾的水中
移开试管并轻微的冷却。不要打开盖子，每支试管
震荡 5-10 s，再放回水浴中，继续加热 25 min。水
浴约 30 min 后，取出试管冷却至室温。
3）甲基化 甲基化转换脂肪酸成甲基脂肪酸，
以增加脂肪酸的挥发性以供 GC 分析利用。开盖加
入试剂Ⅱ，2.0±0.1 mL 的甲基化试剂，拧紧试管盖
后震荡液体 5-10 s，80℃水浴加 10 min，用自来水
快速冷却至室温。
4）萃取 每个试管中加入 1.25±0.1 mL 试剂
Ⅲ，盖紧盖子在旋转式混合振荡仪上温和振荡 10
min 后，打开盖子，用玻璃吸管取出下层水相并丢弃，
保留上层有机相。
5）基本洗涤 加入 3.0±0.2 mL 试剂Ⅳ，温和
旋转振荡 5 min。2 000 r/min 离心 3 min 出现分层。
若分层效果不明显，可加数滴ACS等级NaCl/水溶液，
使两层液相的分层更清楚。萃取物约 0.5 mL 移至上
样瓶。
（3）分析 使用 HP 6890 气相色谱仪，配备分
流 / 不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及
HP 气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A
5.01）；色谱柱为 Ultra-2 柱，长 25 m，内径 0.2 mm，
液膜厚度 0.33 μm ；炉温为二阶程序升温 ：起始温度
170℃，以 5℃/min 升至 260℃，随后以 40℃/min 升
至 310℃，维持 1.5 min ；进样口温度 250℃，载气
为氢气，流速 0.5 mL/min，分流进样模式，分流比
100 1，进样量 2 μL ；检测器温度 300℃，氢气流速
30 mL/min，空气流速 216 mL/min，补充气（氮气）
流速 30 mL/min。
1.2.5.2 甲基萘醌测定
（1）醌的提取及纯化 取冻干菌体约 150 mg，加
入氯仿∶甲醇 =2 1（V/V）的溶液 40 mL，在黑暗处
磁力搅拌 10 h 左右。用滤纸过滤惧滤液。用减压旋
转蒸发仪 40-45℃减压蒸馏至干燥，弃馏液。用丙酮
溶液 1-2 mL 重新溶解干燥物，长条状点样于 GF254
硅胶板（规格 50×200 mm，青岛海洋化工厂分厂）上。
以甲苯作展层剂展层约 20 min，取出风干。在波长
254 nm 紫外灯下观察，在绿色荧光背景下呈暗褐色
的带即为甲基萘醌的位置（Rf=0.8）。刮下Rf=0.8的带，
置于 5 mL 小烧杯中，用 1 mL 氯仿溶解，然后用细
菌滤器抽滤除去硅胶，收集滤液及洗液，即得甲基
萘醌的氯仿溶液。置于 4℃黑暗处保存。
（2）测定 流动相为甲醇∶异丙醇溶液，比例
为 4 1，流速为 1 mL/min，柱温为 40℃，270 nm 紫
外检测。
（3）分析 根据标准菌株甲基萘醌组分与洗脱
时间的关系（参考标准菌株），分析未知菌株。
1.2.5.3 细胞壁化学组分测定
（1）菌体培养与收集 将供试菌株接种到 5 mL
ISP2 液体培养基中，50℃、220 r/min 培养 5 d。摇
好的菌体转移至 2 个 50 mL 离心管中（或分批次转
入 2 个 1 mL 离心管中），经离心机 12 000 r/min 离心
2 min，弃上清液，加入 500 μL 蒸馏水，再次离心，
弃上清液，开盖倒置风干过夜备用，获得 2 份约 30
mg 的干菌体。
（2）细胞水解 取两支干净的试管，各装
30 mg（约 3 mm3）菌体。一支用作全细胞水解液糖
组分分析，一支用作全细胞氨基酸分析。前者加入
0.2 mL 0.5 mol/L HCl，火焰封口 ；后者加入 0.2 mL
6 mol/L HCl 封口。放入 120℃烘箱水解 30 min，取
出冷却备用。
（3）糖分测定 取 2 μL 水解液和 1% 的标准糖液
（半乳糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核
糖等。糖液要用 HCl 酸化，大体接近水解样品的酸
度），分别点在距层析薄板下缘 1 cm 处。使用乙酸
乙酯 吡啶 冰醋酸 水（8 5 1 1.5，V/V）的溶媒系
统，上行推展 3-4 h，移动相推至距上边缘约 1 cm 处。
风干后用苯胺邻苯二甲酸试剂（0.93 mL 苯胺和 1.66
g 苯二甲酸溶于 100 mL 的水饱和正丁醇里）喷洒，
70-80℃下烘烤约 5 min 显迹。
（4）氨基酸测定 取氨基酸水解液 1 μL 和 0.2
μL 标准氨基酸混合液［含 DAP（LL-DAP、meso-
DAP、DD-DAP 混合品）、甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、
谷氨酸、鸟氨酸、亮氨酸］，分别点在距层析薄板下
2012年第10期 213刘洋等 ：一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定
缘 1 cm 处。使用甲醇∶吡啶∶冰醋酸 ：水（5 0.5
0.125 2.5，V/V）的溶媒系统，上行推展 3-4 h，移
动相推至距上边缘约 1 cm 处。取出风干，用 0.4%
茚三酮水饱和正丁醇试剂喷洒，室温下自动显迹，
约 20 min。
（5）分析 显迹后在白色背景上出现棕褐色斑
点（六碳糖）和粉褐色斑点（五碳糖），根据标准
糖的位置，分析判断未知样品的糖分 ；显迹后在白
色背景上显示出黄绿色的 DAP 斑点，LL-DAP 在前，
meso-DAP 在后，DD-LAP 在最后，其他氨基酸显蓝
紫色，根据标准品的位置，判断未知样品中的 DAP
及其他氨基酸成分。
1.2.6 16S rRNA 基因序列分析
1.2.6.1 菌株基因组 DNA 提取 利用细菌基因组
DNA 提取试剂盒（Tiangen 公司）提取试验菌株基因
组 DNA，具体步骤参见试剂盒说明书。提取的基因
组 DNA 用 0.8% 的琼脂糖进行检测。
1.2.6.2 16S rRNA 基因 PCR 扩增和序列测定 以
基因组 DNA 为模板，利用通用引物对 16S rRNA
基 因 进 行 扩 增。 引 物 序 列 为 ：正 向 引 物 799f
（5-AACAGGATTAGATACCCTG-3）， 反 向 引 物
1492r （5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）［3］。50 μL
PCR 反 应 体 系 ：50 ng DNA 模 板，1×Taq reaction
buffer，引物各 20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq酶
（Ferments）。反应程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃
变性 1 min，52℃复性 1 min，72℃延伸 1 min，30
个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用 1% 的
琼脂糖进行检测。纯化后的 PCR 产物用 ABI3700 基
因测序仪测序。测序由北京诺赛基因组研究中心有
限公司完成。测序结果用 Chromas 软件参照正反序
列图谱人工校对。
1.2.6.3 系统发育树的构建 将测序得到的结果在
EzTaxon server 2.1 进行比对［4］，确定与已知序列的
同源关系。采用 CLUSTAL W 进行多序列比对［5］，
并利用 N-J 法通过 MEGA 4 软件进行系统发育及分
子进化分析［6］。
2 结果
2.1 形态学观察
放线菌菌株 Zm60 在 ISP2 培养基上 55℃插片培
养 3 d，基丝长，具分支，直径约 0.5 μm，孢子单个，
圆形，表面光滑，无柄（图 1）。其培养特征结果见表 1。
表 1 放线菌菌株 Zm60的培养特征
图 1 线菌菌株 Zm60培养特征观察
培养基 气生菌丝 基质菌丝体 孢子堆
高氏 1 号 弱，少，污白色 无色 —
精麦芽精琼脂（ISP2） 弱，少，白色 无色 灰白色
酵母燕麦粉琼脂（ISP3） 弱，少，白色 黄褐色 灰白色
无机盐淀粉琼脂（ISP4） 弱，少，白色 淡褐色 灰白色
甘油天冬素琼脂（ISP5） 弱，少，白色 淡黄色 灰白色
2.2 温度敏感性测定
菌株 Zm60 在 37℃及 65℃条件下不生长，在
45-60℃温度范围内生长，且最适生长温度为 55℃，
结果见表 2。
表 2 放线菌菌株 Zm60温度敏感性特征
温度 37℃ 45℃ 55℃ 60℃ 65℃
生长状况 - ++ +++ + -
2.3 生理生化特征鉴定
菌株 Zm60 能够使牛奶凝固，且胨化 ；能还原
硝酸盐为亚硝酸盐 ；具有酪氨酸酶活性 ；能利用葡
萄糖、棉子糖和肌醇。具体结果见表 3。API ZYM
鉴定结果表明，菌株 Zm60 具有碱性磷酸盐酶、酯酶、
类脂酯酶及萘酚 -AS-BI-磷酸水解酶的活力，具体结
果见表 4。
2.4 化学成分分析
菌株 Zm60 细胞壁肽聚糖中含有 meso-diaminopi-
melic acid（meso-DAP），糖型为 C 型（无特征性糖）。
细胞壁氨基酸为 Ala 及 Glu。经测定，Zm60 的醌主
要为 MK-7（图 2）。根据 MIDI 微生物鉴定系统分析
结果，主要脂肪酸组成分别为 iso-C15 ：0（44.01%）、
+++ 表示正常生成 ; ++,+ 表示生长缓慢 ; -表示没有菌落长出
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期214
anteiso-C15 ：0（22.23%）、iso-C17 ：0（14.16%）、
anteiso-C17 ：0（7.56%）和 iso-C16 ：0（6.18%）等，具
体结果见图 3 及表 5。
2.5 16S rRNA基因系统发育分析
菌株 Zm60 的基因组 DNA 提取结果见图 4，所
提取的 DNA 片段约为 23 kb，利用引物 799f 和 1492r
扩增得到 16S rRNA 基因片段，结果（图 5）显示，
PCR 产物仅有一条带，大小约为 750 bp。以 U. ther-
mosphaericus DSM10633T（AB101594）为外群，构建
表 4 放线菌菌株 Zm60的酶活性检测
测定的酶 活性 测定的酶 活性
碱性磷酸盐酶 + 萘酚 -AS-BI-磷酸水解酶 +
酯酶 + α-半乳糖苷酶 -
类脂酯酶 + β-半乳糖苷酶 -
类脂酶 - β-糖醛酸苷酶 -
白氨酸芳胺酶 - α-葡萄糖苷酶 -
颉氨酸芳胺酶 - β-葡萄糖苷酶 -
胱氨酸芳胺酶 - N-乙酰 -葡萄糖胺酶 -
胰蛋白酶 - α-甘露糖苷酶 -
胰凝乳蛋白酶 - β-岩藻糖苷酶 -
酸性磷酸酶 -
表 3 放线菌菌株 Zm60生理生化特征
测定项目 结果 测定项目 结果
淀粉水解 - L-阿拉伯糖 -
牛奶凝固 + 鼠李糖 -
牛奶冻化 + D-果糖 -
硝酸盐还原 + D-葡萄糖 +
明胶液化 - 棉籽糖 +
H2S 产生 - D-木糖 -
酪氨酸酶 + 肌醇 +
纤维素水解 - 蔗糖 -
D-甘露醇 -
图 3 菌株 Zm60脂肪酸测定气相色谱图
表 5 菌株 Zm60脂肪酸组分分析
图 2 菌株 Zm60甲基萘醌 270 nm紫外检测结果
脂肪酸组分 丰度（%）
9 ：0 3OH 0.51
11 ：0 1.10
14 ：0 iso 0.98
15 ：0 iso 44.01
15 ：0 anteiso 22.23
16 ：0 iso 6.18
16 ：0 1.66
17 ：1 iso w10c 0.64
17 ：0 iso 14.16
17 ：0 anteiso 7.56
17 ：1 anteiso B/iso I 0.97
图 5 菌株 Zm60 16S rRNA基因片段 PCR扩增产物
图 4 菌株 Zm60基因组 DNA
M. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 1. Zm60 基因组 DNA
M. λDNA/Hind Ⅲ Marker; 1. Zm60 16S rRNA 基因片段
+. 阳性 ; -. 阴性 , 下同。
2012年第10期 215刘洋等 ：一株芝麻香型白酒高温大曲嗜热放线菌的分离与鉴定
Zm60 与相关模式菌株的系统发育树（图 6）。Zm60
与 Thermoactinomyces vulgaris的模式菌株 KCTC 9076
聚类在一个系统发育分支，序列同源性为100%以上，
可确定 Zm60 为 Thermoactinomyces sp.。
3 讨论
高温放线菌属（Thermoactinomyces）于 1899 年
由 Tsilinsky［7］首次描述。它是 20 世纪前人类所发
现的为数不多的几个放线菌属之一。该属的特征是
在高温下生长快，在气丝和基丝上均有单个孢子形
成，存在内生孢子，常见于自然界的高温场所，如
堆肥、稻草、蔗渣等。高温放线菌属因其能够形成
良好的菌丝体而被归入放线菌目中，但最近有不少
学者对该属分类地位提出质疑，这不仅是因为其基
于 16S rDNA 序列分析证明该属的系统进化更接近于
芽孢杆菌属，它们还产生具有类似芽孢杆菌属的内
生孢子，而且它们的 G+C mol% 仅为 50% 左右，远
远低于其他放线菌属的 65%-75%。根据分子分类研
究结果，有学者将该属并入枯草杆菌菌群。但根据
其形态学特征，高温放线菌属明显应归为放线菌类
群。现今，国内外许多有关学者均暂时将其定位在
放线菌类群中的未定单元里［8］。高温放线菌属从其
建立至今已有 100 多年的历史，其存在数量多，分
布非常广泛，但到目前为止，仅有为数不多的几个
种被发现并生效描述，这说明发现新的高温放线菌
的潜力还是非常大的。Williams 等［9］最近报道，他
们曾从两份酸性土壤中分离到数株中度嗜酸的高温
放线菌属菌株。
本研究利用细菌通用引物对 Zm60 16S rRNA 基
因序列扩增和序列测定，并通过 GenBank 数据库
进行分析比较和利用 MEGA 4 进行系统进化分析，
Zm60 被鉴定为高温放线菌属（Thermoactinomyces
sp.）。以基因系统发育分析为基础，结合生理生化
试验、化学成分分析、形态及培养特征结果，并参
考 Yoon 等［10］的相关报道，最终确定放线菌 Zm60
为普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）。该
菌最早由 Tsilinsky 于 1899 年首次分离得到并命名和
描述，但自芝麻香型白酒高温大曲中被发现并分离
得到本研究尚属首次，由于高温放线菌生长发育较
快，分泌产生的代谢物种类和性质可能会具有其特
殊性［8］，由此可以推测该菌作为优势菌种在芝麻香
型白酒特殊性风味的形成过程中具有不可忽视的作
用。对其进行全面、准确的多相分类学鉴定是研究
其在白酒酿造过程中所发挥功能的必要前提。此外，
本研究还首次对普通高温放线菌（T. vulgaris）进行
图 6 菌株 Zm60 16S rRNA基因系统发育分析
采用邻接法，根据菌株 16S rDNA 部分序列构建的系统发育树。圆括号内为 GenBank 中的收录号。每个分支点处的数字为 Bootstrap
（1 000 次抽样）的支持百分率。标尺代表 1% 的序列差异度。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期216
相关酶的活性研究，确定其具有碱性磷酸盐酶、酯酶、
类脂酯酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶的活性，为进一
步发挥该菌的生物学功能和实现其生产利用价值奠
定重要的基础。
菌种的形态特征是由遗传物质和生存环境等因
素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分子
生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用于
微生物分类学研究领域［8，11］。因此在高温放线菌鉴
定和分类时，利用多相分类学技术的综合使用，是
保证分析和鉴定更加准确的必要前提。多相分类
（polyphasic taxonomy）的概念最早是由 Colwell［12］提
出的，综合利用微生物多种不同信息，包括表型、
基因型和系统发育分析，对微生物进行分类的方法。
马利等［11］曾提出多相分类是目前研究各级分类单
元的最有效手段。通过本研究可以看到，尽管形态
学和生理生化技术在放线菌分类鉴定中不断改进和
发展，但一些不可排除的环境因素和人为因素使该
方法存在一定的局限性，分子生物学技术虽然能够
快速和较准确地鉴定放线菌，但并不能完全取代形
态学和生理生化学等方法。
4 结论
本研究针对自芝麻香型白酒高温大曲中分离得
到的嗜热放线菌 Zm60 进行多相分类学鉴定，并最
终将 Zm60 鉴定为普通高温放线菌（Thermoactinomy-
ces vulgaris）。该菌株具有一些特殊的生理生化特征
及酶学活性，且是首次从我国芝麻香型白酒高温大
曲中分离并鉴定得到的高温放线菌，具有重要的理
论研究与实践应用价值。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）