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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
TRIP-1（transforming growth factor-β receptor
interacting protein）最初是在 B 细胞文库中使用酵母
双杂交的方法，利用 TGFβR Ⅱ C 端作为诱饵蛋白，
发现的一个含有 5 个 WD40 重复结构域的蛋白，分
子量为 36 kD［1］。TRIP-1 可以被 TGFβ 二型受体磷
酸化。TRIP-1 是 TGFβ 信号通路的调节子，可以抑
制 TGF-β 所调控的血浆纤维蛋白溶酶原激活抑制因
子 -1（PAI-1）基因转录［2］，细胞迁移，表皮间充质
转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［3］和
骨细胞的分化中起重要的调控作用［4，5］。TRIP-1 也
是一个与癌症密切相关的蛋白，被发现在多种癌症
收稿日期 ：2012-08-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30570960，30900749），深圳市重点实验室建设与提升计划
作者简介 ：张宏玲，女，博士研究生，研究方向 ：细胞生物学 ；E-mail ：zhanghl08@mails.tsinghua.edu.cn
通讯作者 ：黄来强，男，教授，研究方向 ：分子与细胞生物学 ；E-mail ：huanglq@tsinghua.edu.cn
TRIP-1 抗体的制作及应用
张宏玲  万骏  董一辰  曹威  张新胜  张锦勰  黄来强
（1. 清华大学生命科学学院，北京 100084 ；2. 清华大学深圳研究生院生命与健康学部
生物医药研究中心和基因与抗体治疗重点实验室，深圳 518055）
摘 要 ： 旨在制作 TGF-β二型受体结合蛋白 TRIP-1 的抗体，以便推进对该蛋白在 TGF-β信号通路以及癌症发生发展中的功
能研究。首先克隆出人的 TRIP-1 基因，构建其原核重组表达载体 pET-His-TRIP-1，将其转化至大肠杆菌 BL21（DE3）中，诱导获
得 TRIP-1 蛋白，纯化后将其分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠（KM），免疫 4 次后取血清，并对抗血清进行效价和亲和力测定。
通过 Western blot 和免疫荧光试验鉴定抗血清特异性。最后，利用 proteinG 初步纯化抗血清。结果表明，通过重组表达获得抗原蛋
白，纯化后免疫新西兰大耳兔和昆明鼠可得到效价较高的抗 TRIP-1 的多克隆抗体，在稀释倍数较高的情况下仍可以用于 Western
blot 和免疫荧光试验，且有非常好的特异性。
关键词 ： 原核表达纯化 TRIP-1 蛋白 动物免疫 抗血清 抗体鉴定
The Production and Application of TRIP-1 Antibody
Zhang Hongling Wan Jun Dong Yichen Cao Wei Zhang Xinsheng Zhang Jinxie Huang Laiqiang
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084 ；2. The Shenzhen Key Lab of Gene and Antibody Therapy，Center for Biotech
& Biomedicine and Division of Life & Health Sciences，Graduate School at Shenzhen，Tsinghua University，Shenzhen 518055）
Abstract:  To produce antibody against the TGF-β type II receptor binding protein, TRIP-1, contributing to study TRIP-1’s function in
TGF-β signaling pathway and cancer development. Human’s TRIP-1 gene was cloned into the prokaryotic expression vector of pET-His, and
then transformed into E. coli BL21 to induce TRIP-1 protein expression. Purified TRIP-1 protein was used to immunize New Zealand rabbits
and Kunming mice（KM）. The serum was removed and the titer and affinity was determined after immunization 4 times. The antiserum was
highly purified by proteinG. Results indicated that the titer of the anti-serum from murine and rabbit are high enough for Western blot and
immunofluorescence assay.
Key words:  Prokaryotic expression and purification TRIP-1 Animal immunization Anti-serum Antibody identification
中高表达。另外，TRIP-1 可作为 eIF3i 蛋白存在细
胞内行使蛋白质翻译功能［6，7］。目前，TRIP-1 的功
能仍然还不很清楚。
抗体是研究蛋白功能至关重要的工具。TRIP-1
蛋白被克隆 17 年以来，相关的研究文献并不多见，
直到近两年才出现 TRIP-1 商业化抗体，但商业化抗
体用量有限且价格昂贵。为了便于后续研究，本实
验室通过动物免疫来生产大量 TRIP-1 特异抗体。首
先，通过 RT-PCR 获得 TRIP-1 基因，并将其克隆到
原 核 表 达 载 体 pET-His 中，IPTG 诱 导 表 达 TRIP-1
蛋白。将诱导所得蛋白纯化后对试验动物进行免疫，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期140
一段时间后获取抗血清，经效价测定及纯化，制造
的抗体用于 Western blot 和免疫荧光等试验，旨在为
进一步研究该蛋白在真核细胞内的功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质 粒 pET-His-TRIP-1， 重 组 大 肠 杆 菌 E. coli
BL21（DE3）（ 携 带 质 粒 pET-His-TRIP-1） 为 本 实
验 室 构 建 和 保 存 ；HeLa、HepG2、HEK293、CNE、
NIH3T3 细胞为本实验室储存 ；用于饲养哺乳动物
细胞的 DMEM 培养基购自 Gibico 公司 ；新西兰大耳
兔、昆明鼠购自广州实验动物中心 ；蛋白质 marker
购自 Fermentas 公司 ；HRP 酶标二抗（抗鼠和抗兔）
和 FITC 标记的二抗购自 KPL 公司，鬼笔环肽购自
Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 TRIP-1 蛋白原核诱导表达及纯化 随机挑取
单克隆接种于 5 mL 含适量抗生素 LB 液体培养基中，
于 37℃、200 r/min 条件下过夜培养。然后按 2% 接
种量接种于 200 mL 含抗生素新鲜的 LB 液体培养基
中，于 37℃、200 r/min 条件下继续培养。菌液浓度
达 OD600=0.6 时加入终浓度 0.2 mmol/L IPTG，37℃、
200 r/min 条 件 下 培 养。IPTG 诱 导 5 h，5 000 r/min
离 心 5 min， 收 集 菌 体， 用 40 mL 20 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）缓冲液混合重悬，冰上进行超声处理。
5 000 r/min 离心，根据蛋白表达情况分别收集上清，
沉淀。
1.2.2 包涵体的洗涤和纯化 由于 TRIP-1 蛋白在包
涵体中，本研究采用尿素法纯化包涵体［8］，具体纯
化方法如下 ：Ni-NTA His Binding·Resin 2 mL 柱预
处理 ：用 5 mL 去离子水洗涤 ；加 0.5-1 mL NiSO4 ；
再用 5 mL 去离子水洗涤。用 10 mL 20 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）+8 mol/L 尿素平衡柱。上样准备好的
包涵体溶液［20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）+6 mol/L
尿 素 溶 解 ］， 收 集 流 出 液。 用 10 mL 20 mmol/L
Tris-HCl，100 mmol/L 咪 唑，1 mmol/L β-巯 基 乙 醇
（pH8.0）+8 mol/L 尿素洗涤，收集流出液。用 30 mL
20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L 咪 唑，1 mmol/L β-
巯基乙醇，pH8.0 洗涤，收集流出液。用 10 mL 20
mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-
巯基乙醇，pH8.0 洗脱蛋白，收集 1 mL/ 管，蛋白
在此步收集。最后用 10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5
mmol/L 咪 唑，1 mmol/L β-巯 基 乙 醇，pH8.0 洗 涤，
收集流出液。用 10 mL 去离子水洗涤柱子，充满
20% 乙醇，放在 4℃冰箱保存。纯化的蛋白用 SDS-
PAGE 电泳检测。
1.2.3 TRIP-1 兔抗血清制备 取 2 mL TRIP-1 蛋白
（1.6 mg/mL）制品与等体积的弗氏完全佐剂（Freunds
Adjuvant，complete）混合，在新西兰大耳兔背部选
取 4-6 个点进行皮下多点接种，共接种 4 次，每次
间隔 14 d，第 4 次加强免疫后 7 d 耳缘静脉采血，
分离血清，进行效价检测，获阳性结果后进行心脏
取血，将血液收集到无菌的试管中，室温静置 1-2 h，
待血液凝固后转移到 4℃冰箱中，放置过夜，至血
清析出，将血清转移到无菌的离心管中，10 000 r/min、
4℃离心 30 min，取上清，保存于 -70℃备用。
1.2.4 TRIP-1 鼠抗血清制备 5 只 3-4 周龄昆明小
鼠，将 200 μg 抗原蛋白溶于 250 μL 生理盐水并与等
体积弗氏完全佐剂充分乳化，对小鼠进行皮下注射。
首次免疫 2 周后进行第 2 次免疫，免疫原剂量减半，
并用弗氏不完全佐剂乳化。第 2 次免疫后每隔 7 d
按照第 2 次免疫的方法继续免疫，第 4 次免疫之后
第 3 天，尾部取血分离血清，进行效价检测，获阳
性结果后，进行心脏取血，将血液收集到无菌的试
管中，室温静置 1-2 h，待血液凝固后，转移到 4℃
冰箱中，放置过夜，至血清析出，将血清转移到无
菌的离心管中，10 000 r/min、4℃离心 30 min，取上
清，保存于 -70℃备用。
1.2.5 ELISA 检测抗血清效价 抗原包被 ：将抗原
用 包 被 液 1∶4 000 稀 释（10 μg/mL 终 浓 度 ），100
μL/孔加入聚苯乙烯 96 孔反应板中，4℃放置过夜。
洗涤 ：次日倾去凹孔内的液体，PBST 洗 3 次。封
闭 ：加 100 μL/孔 3% BSA，室温放置 0.5 h。洗涤 ：
用 PBST 洗 3 次。
加待测样品（一抗）：将抗体血清在另一块板上
用 PBS 连续稀释，100 μL/孔加到已包被的板上，每
个样品平行做两份，免疫前的血清作为阴性对照。
加盖 37℃恒温箱温育 1 h。洗涤 ：用 PBST 洗 3 次。
加 HRP 酶 标 二 抗 ：用 封 闭 液 1∶8 000 稀 释，
100 μL/孔，加盖 37℃恒温箱温育 1 h。 洗涤 ：用
2013年第3期 141张宏玲等 ：TRIP-1 抗体的制作及应用
PBST 洗 5 次，蒸馏水洗 2 次。显色 ：加新鲜配制的
底物溶液 100 μL/孔暗处放置 5-30 min，显示蓝色。
终止反应，比色 ：加 50 μL/孔终止液，颜色变黄 ；
用酶标仪测定 450 nm 处各孔的吸光值，阳性反应的
最大稀释度为待测样品的效价。
1.2.6 ELISA 检测抗体相对亲和力 方法同 1.2.5。
用抗原包被酶标板，使用两个浓度梯度即 0.5 μg/mL
和 1.0 μg/mL 抗原包被，4℃放置过夜 ；以多抗浓度
的对数为横坐标，A450 值为纵坐标作图。以曲线达
到水平的 A450 值为 100%，求出 A50，即 50% 的 A450
值时对应的抗体摩尔浓度。按照文献［9，10］的方
法进行计算。
1.2.7 Western blot 检测 将收集的细胞加入 SDS 加
样缓冲液，煮沸 10 min，离心后取上清液进行 SDS-
PAGE 后电转移至 PVDF 膜上，以 5% 的脱脂牛奶
封闭 2 h，与自制兔抗人、鼠抗人 TRIP-1 的多克隆
抗体 4℃过夜，之后用 TBST 每 10 min 洗 1 次，共 3
次 ；加入相应二抗室温 1 h 后用 TBST 洗膜 3 次，每
次 10 min，曝光。
1.2.8 细胞免疫荧光 固定在盖玻片上的细胞用
PBS 漂洗 3 次，每次 5 min；用 3.7% 的甲醛固定细胞，
37℃ 10 min ；0.1% TritonX-100 透化 10 min ；PBS 漂
洗 3 次，每次 5 min ；5% 山羊血清（PBS 配制）室
温封闭 1 h；去除山羊血清封闭液之后，直接加入 5%
BSA 稀释的一抗，4℃杂交过夜。PBS 漂洗 5 次，每
次 5 min ；加入 5% BSA 稀释的二抗，室温避光杂交
1 h；PBS 漂洗 5 次，每次 5 min；抗催灭封片剂封片，
激光共聚焦荧光显微镜上观察。
1.2.9 ProteinG 亲和层析柱纯化抗体 配制缓冲液 ：
起始缓冲液为 TBS 缓冲液洗脱缓冲液为 pH2.7 0.1
mmol/L 甘氨酸盐酸 ；准备收集管 ：取 1.5 mL 离心管，
每支离心管加 70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl ；样品准
备 ：抗血清经 TBS 进行透析过夜，并经 0.22 μm 微
孔滤膜滤过。
透析过的待纯化的样品 15-25 mL 上柱，流速为
0.5 mL/min，将留出的样品反复过柱 ；然后以同样的
流速用 10-20 倍体积的 TBS 缓冲液洗涤，去除未结
合和非特异性结合的蛋白，可通过测定 OD280 的吸
光度判定洗涤是否完全 ；洗脱缓冲液（pH2.7，0.1
mmol/L 甘氨酸盐酸）6-7 mL 每管 1 mL 收集洗脱液，
测每管 OD280 吸收值。收集第 2 洗脱峰，BCA 法测
蛋白含量，4℃保存备用 ；纯化的抗体用 SDS-PAGE
电泳鉴定其纯度用 12% 分离胶、5% 浓缩胶，恒流
下电泳 2 h，考马斯亮蓝 R250（Pharmacia）染色。
2 结果
2.1 TRIP-1蛋白的表达与纯化
利用构建好的 pET-His-TRIP-1 载体分别转化大
肠杆菌 BL21（DE3），成功地原核诱导表达 TRIP-1
全长蛋白，并且用纯化好的蛋白进行下一步试验，
即免疫小鼠和新西兰大耳兔（图 1）。
116.0
kD kD
M 1 2 3 4 5
66.2
36
45.0
35.0
M ：蛋白质 Marker ；1 ：诱导前全菌上样 ；2 ：诱导后全菌上样 ；
3 ：上清 ；4 ：包涵体上样 ；5 ：纯化结果
图 1 TRIP-1 蛋白的诱导表达及纯化结果
2.2 TRIP-1抗血清效价检测
将用 TRIP-1 蛋白抗原免疫 4 次之后的新西兰
大耳兔以及小鼠抽取血清样本通过 ELISA 法测量
抗体效价，计算阳性血清和阴性血清 A450 值之比
（antiserum/preimmune serum，a/p），当 a/p≥2.1 时为
阳 性， 当 a/p<2.1 而 a/p≥1.5 时 为 可 疑， 当 a/p<1.5
时为阴性。如图 2 所示，两种抗血清稀释倍数为 106
时，和阴性血清相比，仍呈现阳性反应，表明免疫
后的两种抗血清的效价均达到 106。
2.3 抗体亲和力检测
通过对纯化的兔抗人 TRIP-1 多克隆抗体进行相
对亲和力检测测定，并且计算抗体亲和常数大约是
105-106，可以进行相关免疫学试验（图 3）。
2.4 利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况
利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况，
各细胞及组织蛋白，12% 蛋白胶 PAGE 电泳，将制
作好的 TRIP-1 鼠源及兔源抗体用于 Western blot 试
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期142
验，检测多种细胞和组织当中的 TRIP-1 表达情况。
将所制备抗体 5 000 倍稀释用来检测真核细胞内源
性 TRIP-1 蛋白表达情况，如图 4 所示，兔抗和鼠抗
均能够很好地检测真核细胞内源性的蛋白表达，并
且也能够直接检测从动物不同组织中抽提出来的蛋
白。说明制备的抗体具有较高的灵敏度和特异性。
2.5 细胞免疫荧光法检测TRIP-1蛋白细胞内定位
TRIP-1 蛋白细胞免疫荧光检测，取 HeLa 细胞
进行免疫荧光，用 Phallodin-FITC 染微丝（actin），
同时用 TRIP-1 兔抗来检测其在细胞内的定位情况，
二抗用 rhodamine 标记的羊抗兔抗体。荧光显微镜
下拍照（图 5）。将制备的 TRIP-1 兔抗人多克隆抗
体 200 倍稀释进行细胞免疫荧光化学染色试验分析，
发现制备的抗体能够进行细胞免疫荧光化学染色，
且染色效果十分良好，同时发现，TRIP-1 蛋白在细
胞质内质网位置定位明显。
0 1 2 3 4〰䟺ؽᮠ10n 〰䟺ؽᮠ10n5 6 7 8 9 10
1.0 antiserum
preimmune serum
antiserum
preimmune serum0.9
0.8
0.7
A
45
0
A
45
00.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1.0A B
2.0
1.0
0.5
1.5
0.0
图 2 经免疫过的兔（A）和小鼠（B）的血清通过 ELISA 法测定效价
3.0
2.0
1.0
0.5
1.5
2.5
08 7.5 6.5 5.5 4.5 3.5 2.5 1.5 0.51234567 0
1.0 mg/L
0.5 mg/L
ob
se
rv
ed
O
D
logarithms of assumed antibody concentrations
图 3 TRIP-1 兔抗相对亲和常数计算图表
antibody from rabbit
antibody from mouse
TRIP-1
A
B
TRIP-1
NI
H3
T3
29
3
He
pG
2
CN
E
mo
use
liv
er
mo
use
br
ain
29
3
He
La
He
pG
2
CN
E
图 4 Western blot 检测 TRIP-1 鼠源（A）及
兔源（B）抗体
Actin TRIP-1 Merge
图 5 TRIP-1 蛋白细胞免疫荧光检测
2.6 TRIP-1抗体纯化
取免疫过的兔和鼠的抗血清，利用 proteinG 方
法进行纯化，成功将 2 种抗体进行了初步纯化，从
纯化结果（图 6）中可以清楚地看到抗体重链（55
kD）和轻链（26 kD）。
3 讨论
生命科学的研究，尤其是针对某个蛋白的功能
研究，抗体是至关重要的工具。抗体可分为多克隆
抗体，单克隆抗体等。单克隆抗体的特异性较好，
但制作过程比较繁琐，多克隆抗体则制作较为容
2013年第3期 143张宏玲等 ：TRIP-1 抗体的制作及应用
易。本研究通过原核诱导表达发现诱导的 TRIP-1 蛋
白主要表达在包涵体当中，有文献报道用含尿素的
缓冲液洗涤包涵体，可初步纯化目的蛋白，可以满
足后续试验中对抗原的要求［11］。鉴于此，本试验选
择用尿素法提取并洗涤纯化包涵体得到较为纯净的
TRIP-1 蛋白。采用直接免疫新西兰白兔和昆明鼠的
方法获得抗血清。ELISA 是检测抗体质量相关系数
的重要手段［12，13］。本试验 ELISA 检测结果显示抗
血清效价极高，并且计算出的亲和常数证明抗体可
用于免疫学试验。未经纯化的抗血清，稀释很高的
倍数仍可用于 Western blot 和免疫荧光等试验，且有
非常好的特异性。细胞免疫荧光法检测 TRIP-1 蛋白
细胞内定位发现，TRIP-1 蛋白在细胞质内质网位置
定位明显，此结果与发表的相关文献吻合［6］。同时，
本研究通过 proteinG 的方法对多克隆抗体初步进行
了纯化。以上结果表明，成功制备、纯化了特异性
的 TRIP-1 多克隆抗体，为今后深入研究 TRIP-1 的
生物学活性和与疾病的关系及可能的临床应用奠定
了基础。
4 结论
本研究通过原核诱导表达和包涵体纯化，获得
了较为纯净的 TRIP-1 全长蛋白。通过免疫新西兰
大耳兔和昆明小鼠，获得了抗血清。通过 ELISA、
Western blot 和免疫荧光试验验证了抗体的效价和特
异性。结果证明用这种方法可以制备具有较高特异
性和灵敏度的多克隆抗体。
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（责任编辑 马鑫）
55
43
34
26
55
26
kDkD
M 1 2 3 4
M ：蛋白质 Marker ；1 ：TRIP-1 兔抗血清全上样 ；2 ：TRIP-1 兔抗
血清纯化 ；3 ：TRIP-1 鼠抗血清全上样 ；4 ：TRIP-1 鼠抗血清纯化
图 6 抗体纯化结果图