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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
在奶牛乳腺炎的发病过程中，乳腺上皮细胞是
与外界直接相通的细胞，乳腺上皮细胞上含有模式
识别受体 TLR，对机体的先天性免疫具有重要的作
用。除此之外，乳腺上皮细胞最重要的功能是泌乳。
因此建立简便、经济、纯净的乳腺上皮细胞的体外
培养模型，对病原免疫学以及泌乳机制的研究都具
有重要的意义。1961 年，Ebner 等［1］第一次将乳腺
上皮细胞在体外培养至 30-40 代，但是，随着传代
收稿日期 ：2012-08-27
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30901066），内蒙古自然科学基金项目（2010MS0514）
作者简介 ：崔新洁，女，硕士研究生，研究方向 ：分子免疫学 ；E-mail ：cuixinjie.1111@yahoo.com.cn
通讯作者 ：王潇，男，副教授，博士研究生，研究方向 ：分子免疫学 ；E-mail ：wxiao1978@yahoo.com.cn
牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定
崔新洁  王婷  刘秉春  陶林  王潇
（内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010010）
摘 要 ： 旨在建立简便、经济、纯净的牛乳腺上皮细胞的体外培养方法，并对所培养细胞进行鉴定。以新鲜牛奶为材料，
离心收集细胞进行原代培养并传代，通过测定生长曲线、乳腺上皮细胞骨架蛋白 -角蛋白 8 和 18、β-酪蛋白、核型等对所培养细胞
进行鉴定，以确定其为乳腺上皮细胞。离心收集到的细胞原代培养 3 d 后形成多个单克隆，细胞呈典型的铺路石状，同时伴随少量
的吞噬细胞，继续培养至单克隆汇合时，细胞表层产生大小不等的乳滴，吞噬细胞大多转移到乳滴中，传代后，得到纯净的乳腺
上皮细胞，吞噬细胞随传代而消失 ；细胞生长曲线呈“S”型，RT-PCR 法扩增到了乳腺上皮细胞的骨架蛋白 8、18 以及 β-酪蛋白，
细胞免疫组化检测到了细胞角蛋白 8，核型为 29 对端着丝粒常染色体，1 对近端着丝粒性染色体。通过以上试验证明，乳汁分离
法可以培养纯净的、具有正常分裂增生能力的牛乳腺上皮细胞，建立了乳腺上皮细胞的体外培养模型。
关键词 ： 乳汁 牛乳腺上皮细胞 细胞骨架蛋白 泌乳
Isolation，Culture and Identification of Bovine
Mammary Epithelial Cell
Cui Xinjie Wang Ting Liu Bingchun Tao Lin Wang Xiao
（College of Life Sciences，Inner Mongolia University，Hohhot 010010）
Abstract:  It was to set up a simple, economic and pure method to culture and identify bovine mammary epithelial cell（BMEC）in
vitro, which were collected from centrifuging the fresh milk. Then, the cell growth curve, keratin8, keratin18, Beta casein and karyotype were
identified. After three days, several cells grew together, and the shape looked like typical paving stones. At the same time, there were also a few
phagocytes. Continue to culture several days, all cells grew together, and there were some emulsion droplets secreted to the outside of the cells
with almost all phagocytes transferring into the emulsion droplets. When the cells were propagated, all phagocytes were disappeared. The cell
growth curve was “S”. Keratin8, Keratin18 and Beta casein had been detected through the method of RT-PCR. Keratin8 were also detected by
immunohistochemistry. The karyotype result was the same as bovine’s.
Key words:  Freash milk Bovine mammary epithelial cell Cytoskeletal protein Lactation
次数的增加，大多数上皮细胞失去原有的特性，而
表现成纤维细胞的特性。之后多种方法被采用，以
去除成纤维细胞的污染，如在培养液中添加 D-缬氨
酸以选择性地去除成纤维细胞，或密度梯度离心法，
或胶原酶与胰酶共同消化法等［2-10］，但随着传代的
进行，都不同程度地混有成纤维细胞的污染。乳汁
是由乳腺上皮细胞分泌的，在分泌乳汁的过程中，
会有很多乳腺上皮细胞自然脱落，随乳汁分泌到体
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期108
外，因此从乳汁中可以分离培养乳腺上皮细胞，同
时，分离到的细胞中不含有成纤维细胞的污染，克
服了组织块消化法的缺点，另外，该种方法无需使
用昂贵的胶原酶，较组织块消化法更为经济。国
外研究人员已利用该法成功培养出了乳腺上皮细
胞［11， 12］，主要是通过离心新鲜牛奶收集牛奶中细
胞的方法来培养乳腺上皮细胞，目前在国内报道
中，通过乳汁分离法获得乳腺上皮细胞的不多，只
有崔立莉［13］成功从牛奶中分离培养了乳腺上皮细
胞。牛乳腺上皮细胞是高度分化的细胞，在体外培
养时培养基的成分是培养成功的关键。早期的研究
者已经证实激素对乳腺上皮细胞的生长是有利的，
Turkington［14］研究发现牛胰岛素、氢化考的松、催
乳素等激素的相互作用会促进乳腺细胞中 RNA 的生
物合成 ；另外，Turkington 还发现 EGF，即上皮细胞
生长因子可以促进乳腺上皮细胞中 DNA 的合成及随
后的细胞分裂［15］。因此，在培养细胞的过程中，通
常将激素、EGF 和谷氨酸作为上皮细胞培养基中主
要的成分［16-19］。综合前人的研究，本研究采用新鲜
牛奶作为试验材料，拟建立一种较成熟、简单的乳
腺上皮细胞的体外培养方法，旨在为体外试验的研
究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2011 年 7 月至 12 月，在内蒙古大学完成。
新鲜牛奶取自内蒙古呼和浩特市小黑河镇二道河村
奶农饲养的日产奶量 25-40 kg 的高产荷斯坦奶牛。
试验过程中使用的仪器包括超净工作台、离
心机、CO2 培养箱、荧光倒置显微镜、普通光学显
微镜以及 PCR 仪等。完全培养液成分是 10% FBS+
DMEM/F12+100 U 双 抗 + 氢 化 考 的 松（1 μg/mL）+
孕酮（1 μg/mL）+ 转铁蛋白（5 μg/mL）+ 胰岛素（5
μg/mL）+200 mmol L-谷 氨 酰 胺 +10 ng/mL EGF ；其
中 FBS 和 DMEM/F-12 购自 Hyclone 公司，EGF 购自
北京索莱宝生物技术有限公司，其余添加因子购自
Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 乳汁中分离培养细胞 用无菌水清洗牛乳房，
酒精消毒，手挤牛乳于灭菌的蓝盖瓶中，放于盛有
37℃水的保温盒中带回实验室。将 200 mL 乳汁与
含双抗的 PBS 按 2∶1 混合后，转入 15 mL 离心管
中，1 500 r/min，离心 20 min，离心后分 3 层，弃掉
乳脂层及大部分乳白色浑浊层至剩余 1 mL 左右，混
合所有离心管中剩余的液体（切勿吸取底层白色沉
淀）于一离心管中，再次离心 15 min 后，小心弃掉
上层乳白色液体后，剩余 0.5 mL 细胞层，将剩余细
胞层转移到 5 mL 完全培养液中（切勿吸取底层白色
沉淀），接种于 25 cm2 细胞培养瓶中，5%CO2 箱中
培养，每隔 2 d 换液，待细胞长出单克隆后原瓶消化，
待长至 80% 汇集时，传代培养（1 传 3），多次传代
后冻存。
1.2.2 MTT 法测定细胞生长曲线 细胞复苏，用台
盼蓝染色确定浓度，接种于 96 孔细胞培养板。细胞
接种浓度为 4×103 个 / 孔，设置对照组和试验组，
每组 3 个重复，37℃、5％ CO2 培养箱中培养 1、2、3、
4、5、6、7 d 后于同一时间吸出孔内培养液，分别
加入 MTT 使用液（100 μL 孔，浓度 0.5 mg/mL），继
续培养 4 h，加入 DMSO 液（150 μL/ 孔），37℃下培
养箱中孵育 10 min，不断震荡使结晶物溶解。酶标
仪检测各孔 OD570nm 值。记录结果，绘制细胞活力曲
线图。
1.2.3 RT-PCR 检测角蛋白 8、18 及 β-酪蛋白 细
胞复苏，生长到 80% 汇合时，胰酶消化，收集细胞，
用总 RNA 提取试剂盒（TaKaRa ；D9108A）抽提细
胞总 RNA。为排除基因组 DNA 的污染，用 DNA 酶
（TaKaRa ；00079459）消化处理后，用反转录试剂
盒（TaKaRa ；BK3702）反转录，用 PCR 反应试剂
盒（TaKaRa ；DR100A）进行扩增反应，电泳检测
扩增产物。退火温度分别是角蛋白 8 ：62℃ ；角蛋
白 18 ：62℃ ；β-酪蛋白 ：62℃ 。
根据 NCBI 上公布的牛基因序列设计引物如表 1
所示。
1.2.4 细胞免疫荧光染色法鉴定角蛋白 8 细胞复
苏，于常温下用 4％的多聚甲醛固定 30 min，PBS 清
洗 3 次，每次 5 min ；加入 0.2% 的 TritonX-100 通透
处理 5 min，PBS 清洗 3 次，每次 5 min ；加入 10％
正常山羊血清封闭处理 30 min ；加一抗（空白对照
试验用 PBS 代替）于 37℃下振荡孵育 1 h，一抗为
兔抗人的细胞角蛋白 8 多克隆抗体（1∶100 稀释），
2013年第3期 109崔新洁等 ：牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定
PBS 清洗 3 次，每次 5 min ；加入 1∶50 稀释的 FITC
标记的山羊抗兔 IgG 的二抗，室温下避光振荡孵育
30 min，PBS 清洗 3 次，每次 5 min ；加入 DAPI 使
用液（10 μg/mL），室温避光孵育 10 min，荧光显微
镜下观察结果。
1.2.5 染色体中期分裂相制备与组型分析 细胞生
长至 70%-80% 汇合，加入秋水仙素（终浓度 0.1
μg/mL），在 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中
作用 3 h ；0.25% 胰酶消化使细胞脱壁，将细胞悬液
装入 15 mL 离心管，1 500 r/min 离心 5 min，去上清；
缓缓加入 37℃预热的 0.075 mol/L KCl 5 mL，37℃条
件下孵育 30 min ；加入 1 mL 新鲜配制固定液（甲
醇∶冰乙酸 = 3∶1）预固定 3 min，1 500 r/min 离心
5 min，去上清 ；加入新鲜固定液 6 mL，轻轻吹打均
匀，室温固定 30 min，500 r/min 离心 5 min 去上清，
重复固定细胞 2 遍 ；末次离心后，小心吸除大部分
上清液，余下 0.5 mL 固定液，轻轻吹打重悬细胞并
混匀 ；胶头滴管吸少量细胞悬液，滴落在 -20℃预
冷过的洁净载玻片上，迅速在酒精灯火焰上烤干 ；
制备好的染色体标本用 Giemsa 染色液浸染 10 min，
流水冲洗 3 次，自然干燥后，于显微镜下观察，并
进行组型分析。
2 结果
2.1 牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养
接种 3 d 后，均可见许多鹅卵石样细胞聚集生
长形成的克隆，如图 1-A，以及分散生长的梭形的
单个细胞，如图 1-B，同时还可见少量的吞噬细胞
（图 1-A，图 1-B 中标记出的细胞）；每 3 d 换液，继
续培养 9 d 后，形成许多大的、生长均匀的单细胞
克隆，有鹅卵石和多角形状两种，如图 1-C 和 1-D ；
在细胞克隆的表面有分泌到胞外的乳滴，如图 1-E ；
同时发现吞噬细胞大多转移到乳滴中，如图 1-F ；原
瓶消化使细胞分散，继续培养 2 d 后，细胞在瓶底
80% 汇集，吞噬细胞消失，形成均匀的多角形和鹅
卵石状细胞混合生长的乳腺上皮细胞层，如图 1-G，
形状也分鹅卵石和多角形两种。细胞传代后冻存，
复苏后存活率高达 90%，如图 1-H。
GeneBank 序列号 基因 引物序列 产物长度（bp）
NM_001033610.1
keratin 8 P1 TGGAAGGGCTGACTGATGAG
540
keratin 8 P2 GCTTCCTGTAGGTGGCAATC
NM_001192095.1
keratin 18 P1 CAGGGCGAGAAGGAGACCAT
504
keratin 18 P2 TAAGGTCCTGAGGTTTGGGG
NM_181008.2
casein beta P1 ATCCCTAACAGCCTCCCAC
303
casein beta P2 AGAAAGGGACAGCACGGAC
表 1 本研究所设计的引物序列
A ：单细胞克隆，红色标记为吞噬细胞 ；B ：分散的单个细胞，圆圈标记为
吞噬细胞 ；C ：鹅卵石状细胞 ；D ：多角形细胞 ；E ：分泌到胞外的乳滴 ；F ：
箭头指向胞外乳滴，乳滴中有吞噬细胞 ；G ：多角形与鹅卵石状细胞混合均
匀生长 ；H ：复苏后细胞存活率达 90%
图 1 细胞培养图片
A B
C D
E F
G H
2.2 MTT法测定细胞生长曲线
牛乳腺上皮细胞生长曲线如图 2 所示，牛乳腺
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期110
上皮细胞接种后前 2 d 生长相对缓慢，之后 3 d 进入
快速生长的对数期，最后细胞生长缓慢，活性降低。
结果表明，培养的牛乳腺上皮细胞具有正常的分裂
增殖特性。
结果分离培养的乳腺上皮细胞呈阳性，如图 4-A 和
4-B ；而空白对照，即一抗用 PBS 替代其他处理条件
相同的细胞为阴性，如图 4-C 和 4-D，进一步在蛋
白水平上证明分离培养的细胞是乳腺上皮来源。
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.15
0.05
0
1 2 3 4 5 6 7
0.25
0.35
0.45
ᰦ䰤d
੨ݹ
٬
图 2 牛乳腺上皮细胞生长曲线
2.3 RT-PCR检测角蛋白8、18以及β-酪蛋白
角蛋白 8、18 是乳腺上皮细胞的特异性蛋白，
牛的细胞角蛋白 8 和 18 基因没有内含子结构，提取
的细胞总 RNA 中含有少量的基因组 DNA 污染，因此，
在进行反转录之前，用 DNA 酶对 RNA 进行消化处
理，以去除 DNA 污染的 RNA 为模板。将角蛋白 8
作为阳性对照，以提取 RNA 以及消化后的 RNA 为
模板进行 PCR 反应以确定基因组 DNA 被彻底降解，
如图 3-A，用此彻底消化的 RNA 为模板进行反转录
合成 cDNA 的第一链并用以合成的角蛋白 8、18 的
引物进行 PCR 反应，得到了单一的目的条带如图 3-B
和 3-C。结果表明，乳汁分离法体外培养的乳腺上
皮细胞在 mRNA 水平上表达细胞角蛋白 8 和 18，具
有上皮细胞特性。
酪蛋白是乳汁中含有的一种主要的蛋白，β-酪
蛋白是其中一种。培养细胞所用的培养基中胰岛素、
孕酮以及氢化可的松的添加会刺激细胞分泌乳汁。
提取细胞总 RNA，反转录后用所设计的 β-酪蛋白的
引物进行 PCR 扩增反应得到了目的条带，如图 3-D，
证明所培养的细胞具有正常的泌乳功能。
2.4 细胞免疫组化的方法鉴定角蛋白8
用细胞免疫组化的方法分析了分离培养的乳腺
上皮细胞的骨架蛋白 - 细胞角蛋白 8 的表达情况，
2000
bp
M 1 2 3 4
1000
750
250
500
100
2000
bp
M 1 2
1000
750
250
500
100
2000
bp
M 1 2
1000
750
250
500
100
2000
bp
M 1 2
1000
750
250
500
100
504
bp
540
bp
540
bp
303
bp
A B
C D
（A）1 ：阳性对照，M ：DL2000 DNA Marker，1，2 ：RNA 为模板 PCR 产物，
3，4：消化后的 RNA 为模板 PCR 产物；（B）M：DL2000 DNA Marker，1，2：
角蛋白 8 PCR 产物 ；（C）M ：DL2000 DNA Marker，1，2 ：角蛋 18 PCR 产物 ；
（D）M ：DL2000 DNA Marker，1，2 ：β-酪蛋白 PCR 产物
图 3 PCR 结果
A B
C D
A ：试验组，荧光显微镜拍摄，细胞发出绿色荧光 ；B ：试验组，普通光学
显微镜拍摄 ；C ：对照组，荧光显微镜拍摄，细胞核呈蓝色 ；D ：对照组，
普通光学显微镜拍摄
图 4 免疫组化鉴定角蛋白 8
2013年第3期 111崔新洁等 ：牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定
2.5 染色体中期分裂相制备与组型分析
选择分散良好、轮廓清晰的视野进行分析（图
5-A），并进行组型排列，结果（图 5-B）显示有 60
条染色体，共 30 对，29 对常染色体为端着丝粒染
色体，一对性染色体是进端着丝粒染色体，与乳牛
染色体组型一致，证明所养细胞来源于乳牛。
乳汁是由乳腺上皮细胞分泌的，在分泌乳汁的过程
中，会有很多乳腺上皮细胞自然脱落，随乳汁分泌
到体外，因此可以从乳汁中可以分离培养乳腺上皮
细胞［24］。许多研究人员从常乳中不能分离培养乳腺
上皮细胞，通过我们的研究，认为取材是关键的一
步，首先，奶牛要选择产奶量较高者 ；其次，在取
奶是要注意无菌操作 ；其三，所取牛奶一定要注意
保温，冷却的牛奶中细胞的活性很低，很难培养出
乳腺上皮细胞 ；其四，也是最重要的一点，离心后
弃掉上层浊液的过程一定要用枪头缓慢吸弃，不可
将枪头插到液面以下，以防吸走分离的细胞。我们
选取产后 2-4 个月的日产量 25-40 kg 的荷斯坦奶牛
的新鲜牛奶为材料，并成功培养，说明常乳也可用
于乳腺上皮细胞的培养。较昂贵的胶原酶消化法来
说，乳汁分离法取材方便、操作简单、培养周期短、
细胞较为纯净，是一个乳腺上皮细胞培养的有效方
法。该种方法分离到的细胞中除了上皮细胞外，还
含有吞噬细胞，具有吞噬自身以外杂质的能力，首
先就使得培养的过程中污染的几率减小，同时吞噬
细胞增殖性较小，而且吞噬了杂质的吞噬细胞会自
发死亡，传代之后吞噬细胞基本消失，有利于得到
纯净的上皮细胞。
试验中发现原代培养的过程中，吞噬细胞会向
分泌到胞外的乳滴中转移，有报道［25-27］说乳汁中
的乳铁蛋白的存在能帮助机体更好地抵御金黄色葡
萄球菌等主要乳房炎病原菌的侵害，这一现象或许
可以作为一个体外研究乳汁与病原菌作用的模型。
3.2 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定
乳腺上皮细胞的鉴定是通过鉴别细胞的特异性
标志物，其中细胞骨架如角蛋白，是乳腺上皮细胞
重要的标志蛋白。本研究对腺上皮角蛋白 8、18 进
行了 RNA 水平上的鉴定，并在蛋白水平上对角蛋
白 18 用细胞免疫组化的方法进行鉴定，证明了所培
养的细胞具有腺上皮属性。另外，乳蛋白是乳汁的
重要组成成分，在培养基中添加孕酮、胰岛素以及
氢化考的松等激素能够诱导乳蛋白的表达。酪蛋白
是一种主要的乳蛋白，对酪蛋白在 RNA 水平上的
鉴定以及显微观察细胞生成乳滴等证明了所培养的
细胞是能够产生乳汁的上皮细胞即乳腺上皮细胞类
1 2 3 4 5 6 7 8
9 10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20
25 26 27 28 29 XX
21 22 23 24
A B
图 5 核型分析结果
3 讨论
3.1 牛乳腺上皮细胞的培养
牛乳腺上皮细胞在宿主的先天性免疫中起重要
作用，因此，建立一个完善的牛乳腺上皮细胞体外
培养模型，将有助于在体外研究乳房炎的机理。目前，
被广泛使用的方法为胶原酶消化法，但是胶原酶的
消化不具有特异性，而牛乳腺组织中不仅含有乳腺
上皮细胞还有大量的成纤维细胞和脂肪细胞，因此，
胶原酶消化下来的细胞类型多样，培养后贴壁的细
胞主要是乳腺上皮细胞和成纤维细胞，成纤维细胞
的生长能力很强，在培养过程中很难去除，但是两
种细胞对胰酶 /EDTA 的敏感性不同，成纤维细胞比
乳腺上皮细胞容易被胰酶消化，因此主要采用胰酶
消化法去除成纤维细胞，但是纯化不彻底［20］。
乳腺上皮细胞是高度分化的细胞，若在体外培
养，环境因素的影响很容易导致其脱分化，发生基
因突变与缺失等，因此，体外培养过程中要不断摸
索其生长条件，添加各种生长因子，以维持其分化
状态。参考前人［11，12，21-23］对培养液中各因子的添
加情况，本试验采用的完全生长液配方，在该种培
养液成分中细胞生长状态良好。
腺泡是乳汁分泌的最小的结构单位，由泌乳上
皮细胞，导管上皮细胞以及肌上皮细胞等构成的。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期112
型。由于角蛋白和酪蛋白只由一个外显子构成，因
此提取的 RNA 要经过 DNA 酶的消化，以防止基因
组 DNA 的污染［20］。
通过对所培养的细胞增值的 MTT 法测定证明所
培养的细胞具有正常的分裂增生能力。通过核型分
析试验证明所培养细胞是乳牛来源。通过对所培养
的细胞进行鉴定，证明所培养的细胞是牛源的具有
正常分裂增生能力以及泌乳功能的乳腺上皮细胞。
4 结论
本研究建立了乳汁分离法体外培养牛乳腺上皮
细胞的模型，认为只要取材合适，200 mL 牛乳即可
用于原代培养乳腺上皮细胞。为乳腺上皮细胞的体
外培养研究提供了思路，建立了简便、经济、纯净
的乳腺上皮细胞的原代培养方法。
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（责任编辑 李楠）