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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(9):91-96
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是
一种广泛分布的革兰氏阳性细菌，在形成芽胞的
同时能产生由 cry 或 cyt 基因编码的杀虫晶体蛋白
（Insecticidal crystal proteins，ICPs）， 对 多 种 害 虫 有
特异杀虫活性［1，2］。目前，Bt 不仅被开发成生物农
药在害虫防治中得到应用，表达 Bt Cry 蛋白的转基
因抗虫植物也已经被广泛种植，实现了巨大的经济
效益与生态效益。其中，Cry1A 是一个对鳞翅目害
收稿日期 ：2015-03-06
基金项目 ：国家转基因专项（2014ZX0800912B，2014ZX08009003-001-004）
作者简介 ：徐曼，女，硕士研究生，研究方向 ：分子遗传学 ；E-mail ：dianxin5@126.com
通讯作者 ：宋福平，男，研究员，研究方向 ：苏云金芽胞杆菌 ；E-mail ：fpsong@ippcaas.cn
Cry1Ab/Cry1Ah 杂合蛋白构建与功能研究
徐曼1  蒋健2  束长龙2  张杰1，2  宋福平1，2
（1 东北农业大学，哈尔滨 150030 ；2. 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害国家重点实验室，北京 100193）
摘 要 ： Cry1A 类杀虫蛋白是目前应用最为广泛的杀虫蛋白，目前已经报道的 Cry1A 类杀虫蛋白之间存在普遍的结构域交
换现象。针对鳞翅目害虫具有高活性的 Cry1Ab 与 Cry1Ah 蛋白开展研究，构建了 Cry1Ab、Cry1Ah 的杂合蛋白 AhAhAb 并测定了杀
虫活性。结果显示，Cry1Ab、Cry1Ah 的结构域交换引起蛋白杀虫活性的显著变化，与出发蛋白相比，杂合蛋白 AhAhAb 丧失了对
棉铃虫杀虫活性，降低了对玉米螟、小菜蛾杀虫活性。利用生物信息学方法对 Cry1Ah 结构域 I 建模，并分析其与其他 Cry1A 蛋白
结构及表面性质差异，分析表明 Cry1Ah 与 Cry1Ab 的结构域 I 有相同的碳骨架和二级结构，但是表面电势分布有较大差异。进一
步分析杂合蛋白 AhAhAb 与 Cry1Ab、Cry1Ah 之间杀虫活性差异的原因对进一步揭示 Cry1A 类蛋白杀虫特异性进化规律有重要意义。
关键词 ： Cry1Ah ；结构域 I ；杀虫活性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.09.012
Creation of Cry1Ab/Cry1Ah Hybrid Proteins and Its Functional
Analysis
Xu Man1 Jiang Jian2 Shu Changlong2 Zhang Jie1，2 Song Fuping1，2
（1. Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；2. State Key Laboratory of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection
of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract: Cry1A is the most widely used insecticidal protein, and the domain swapping in the reported Cry1A family frequently occurs.
In this paper, we investigated the Lepidoptera pests’ highly active protein Cry1Ab and Cry1Ah, and constructed the hybrid protein AhAhAb from
Cry1Ab/Cry1Ah and bioassayed the activities. The results showed that the domain swapping of two proteins Cry1Ab and Cry1Ah resulted in the
insecticidal activities significantly changed. Compared with the origin proteins, hybrid protein AhAhAb lost the insecticidal activity to Heliothis
armigera, caused the insecticidal activity to Ostrinia nubilalis, Plutella xylostella reduced. We then modeled Cry1Ah domain I, and compared
the structure and the surface properties with other Cry1A proteins by bioinformatics methods. The results indicated that domain I of Cry1Ah and
Cry1Ab had identical carbon skeleton and secondary structure but varied surface and potential distribution. The further studies on the reasons of
the activity’s difference between hybrid protein AhAhAb and Cry1Ab or Cry1Ah will give enlightenment for unclosing the evolution pattern of
insecticidal specificity of Cry1A family proteins.
Key words: Cry1Ah ；domain I ；insecticidal activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.992
虫有高活性的杀虫蛋白家族，目前已知的 Cry1A 类
基 因 有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cry1Ad、cry1Ae、
cry1Af、cry1Ag、cry1Ah、cry1Ai 及 cry1Aj 等 10 个 模
式种类，112 个杀虫基因，编码 130 kD 左右的蛋白
（http ：//www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/
Bt/）。 这 些 基 因 中 cry1Ab、cry1Ac 应 用 最 为 广 泛，
cry1Ah 是中国农业科学院植物保护研究所克隆的具
有自主知识产权的杀虫基因（专利号 ：ZL20041000-
9918.9），其编码的 Cry1Ah 蛋白对棉铃虫（Helicoverpa
armigera）、亚 洲 玉 米 螟（Ostrinia furnacalis）和水
稻二化螟（Chilo suppressalis）等多种鳞翅目害虫具
有 很 高 的 毒 杀 活 性， 超 过 目 前 商 业 化 的 cry1Ab、
cry1Ac 等基因［3，4］，具有巨大的应用前景，目前正
在利用其进行转基因抗虫植物研究［5-7］。
Cry1A 类蛋白属于典型的 3 个结构域蛋白（3
Domain，3D）。结构域 I 由 7 个 α 螺旋组成（其中 6
个两性螺旋围绕 1 个中心螺旋）；结构域 II，也称作
β“三棱镜”，由 3 个 β 折叠片对称折叠形成一个“希
腊钥匙”形状的结构 ；结构域 III，是一种两个反平
行的 β-折叠片包裹在一个类似 “果冻卷”中的结构。
研究结果表明，结构域 I 与蛋白插入细胞膜以及形
成穿孔有关，结构域 II 和 III 都与受体识别及结合
有关，决定杀虫特异性。对目前已经明确杀虫活性
蛋白的各结构域进行序列比对聚类发现，部分杀虫
活性（特别是 Cry1 类蛋白）可以由结构域 III 的重
组获得，Cry 毒素结构域交换是一种杀虫特异性进化
的机制。
通过序列比对发现，Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah
三个蛋白之间有共同的结构域 II（序列一致性大于
97%）；Cry1Ab、Cry1Ac 有 共 同 的 结 构 域 I（ 序 列
一致性为 98%）；而 Cry1Ac、Cry1Ah 有共同的结构
域 III（序列一致性为 100%）。Cry1Ab 结构域 III 与
Cry1Ac、Cry1Ah 不同，但是在 Cry1A 家族中比较常
见， 与 Cry1Aa、Cry1Ae、Cry1Af 等 蛋 白 结 构 域 III
序列一致性大于 97% ；Cry1Ah 结构域 I 比较独特，
不仅与 Cry1Ab、Cry1Ac 不同，与所有报道的 Bt 杀
虫蛋白的结构域 I 差异都较大（序列一致性都小于
72%）。本研究通过同源建模的方法比较 Cry1Ab 和
Cry1Ah 结构域 I 结构、表面电荷分布特点 ；进一步
构建 Cry1Ab 和 Cry1Ah 的杂合蛋白并测定杀虫谱，
分析结构交换对 Cry1Ab 和 Cry1Ah 杀虫活性的影响，
旨在对进一步揭示 Cry1A 类蛋白杀虫特异性进化规
律奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株和质粒 本研究所用到的菌株和质
粒，见表 1。
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特点描述 来源
E. coli
Rosetta（DE3） Supply tRNAs for AGG，AGA，AUA，CUA，CCC，GGA Novagen 公司
JM110 rpsL（strr）、thr、leu、thil、lacy、，galT、ara、tonA、tsx、dam、dcm、supE44、△（lac-proAB），
［F’，traD36，proAB，laclqZΔM15］
TaKaRa 公司
Plasmid
pET21b lac operator，T7 promoter，multiple cloning site，His·Tag，HSV·Tag，Ampr Novagen 公司
pSXY422-cry1Ab
pSXY422-cry1Ah
pSXY422 carrying cry1Ab13 gene
pSXY422 carrying cry1Ah1 gene
实验室保存
pETAhAHAB pET21b 载体和 AHAHAB 基因重组质粒 本研究
1.1.2 培 养 基 及 生 化 试 剂 LB 培 养 基 ：1.0% 胰
蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1.0% 氯化钠，pH7.0。
ZYP-5052 培 养 基 和 50×5052 诱 导 剂。Primer star
高保真 DNA 聚合酶购自宝生物工程大连有限公司
（TaKaRa/Japan），限制性内切酶、DNA 连接试剂盒、
DNA 回收试剂盒等购自 Axygen 公司（Axygen/USA）。
1.1.3 供试昆虫 敏感种群小菜蛾由本实验室提供；
棉铃虫、亚洲玉米螟分别由中国农业科学院植物保
护研究所棉花害虫组和玉米害虫组提供 ；甜菜夜蛾
由武汉科诺公司提供。
2015,31(9) 93徐曼等：Cry1Ab/Cry1Ah 杂合蛋白构建与功能研究
1.2 方法
1.2.1 蛋白质序列与结构分析 首先将要分析蛋白
氨基酸序列提交 NCBI 保守结构与数据库（Conserved
Domain Database，CDD）进行比对，获取蛋白中对应
Endotoxin_N，Endotoxin_M，Endotoxin_C 三个结构域
的氨基酸序列，并通过 BLAST 的方法比较杀虫蛋白
氨基酸序列间的一致性。进一步利用 SWISS-MODEL
（http ：//swissmodel.expasy.org/）对 3 个结构域对应氨
基酸序列进行自动建模，获得的三维结构进一步用
PyMOL 软件包进行结构比对与表面特性分析。
1.2.2 杂合蛋白构建 采用无缝克隆的方法构建
Cry1Ah 与 Cry1Ab 杂合蛋白 AhAhAb，杂合蛋白具
备 Cry1Ah 结构域 I 和结构域 II、Cry1Ab 结构域 III，
引物 Cry1AhF 和 AhAhAbR 用于扩增 Cry1Ah 结构域
I 和结构域 II，引物 AhAhAbF 和 Cry1AbR 用于扩增
Cry1Ab 结构域 III，表达载体是 pET21b。杂合蛋白
载体构建引物序列，见表 2。
表 2 杂合蛋白载体构建引物序列
引物名称 序列（5-3）
AhAhAbR AAATTCAGCACTACGATGTATCCAAGAGAACATAGGAGCTC
Cry1AhF GGACAGCAAATGGGTCGGGATCCGATGGAGATAGTGAATAATCAGAATCAATG
AhAhAbF GAGCTCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTGAATTT
Cry1AbR TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC
1.2.3 杂合蛋白表达与分析 方向正确的重组质粒
转 入 表 达 菌 株 Rosetta（DE3）， 进 行 IPTG 诱 导 表
达，诱导表达条件见参考文献［8］。在 20 mmol/L
Tris·Cl（pH8.0） 缓 冲 液 中 进 行 细 胞 破 碎， 然 后
可溶组分和不可溶组份分别进行 SDS-PAGE 分析，
蛋白电泳样品制备与 SDS-PAGE 分析方法参见文
献［9］。蛋白定量后进行活性测定，棉铃虫、亚洲
玉米螟、小菜蛾、甜菜夜蛾的生物测定方法参照文
献［10-12］。此外，利用 Image-J 软件包对照片中试
虫的身长进行测定，比较发育情况。
2 结果
2.1 Cry1Ah与Cry1Ab、Cry1Ac序列比较
通 过 NCBI 保 守 结 构 与 数 据 库（Conserved
domain database，CDD）进 行 比 对 分 析 发 现，
Cry1Ah1 蛋白的结构域 I、结构域 II、结构域 III 分
别 位 于 第 57-275 位、 第 280-481 位、 第 491-629
位氨基酸。分别将 Cry1Ah1 全长蛋白、3 个结构域
核心活性区及 3 个独立结构域与 Cry1Ab、Cry1Ac
进 行 比 较 发 现，Cry1Ah1 的 Endotoxin_N 结 构 域 与
Cry1Ab、Cry1Ac 不同，而 Cry1Ab 的 Endotoxin_C 与
Cry1Ac、Cry1Ah 差异较大，3 个蛋白的 Endotoxin_M
一致性大于 98%（表 3）。
2.2 Cry1Ah与Cry1Ab结构域I比较
由于 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 除结构域 I 差异外，
两者结构域 III 还存在较大差异，因此可以通过构
建 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 杂 合 蛋 白 来 分 析 Cry1Ah1
结 构 域 I 对 Cry1A 杀 虫 蛋 白 活 性 的 影 响。 利 用
SWISS-MODEL 自动建模功能分别获得了 Cry1Ah1
与 Cry1Ab13 结构域 I 以及 3 个结构域核心活性区
的结构信息（图 1），通过分子叠合比对发现，尽管
Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 序列存在较大差异（31%），但
是两者结构域 I 的碳骨架没有差异（图 1）。进一步
分析了结构域 I 的表面结构与表面静电势分布，结
果显示尽管两个蛋白结构域 I 的碳骨架没有差异，
表 3 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13、Cry1Ac1 序列比较 /%
Cry1Ah1（AF281866）
原毒素 毒素 结构域 I 结构域 II 结构域 III
Cry1Ab13（AAN76494） 82 73 69 98 42
Cry1Ac1（AAA22331） 90 88 71 99 100
AhAhAb 100 100 42
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.994
由于氨基酸序列以及氨基酸侧链基团不同，两个蛋
白的结构表面以及电势分布都有所不同（图 2）。
和 42%，进一步构建了 AhAhAb 杂合蛋白。图 3 显
示，杂合蛋白 AhAhAb 含有了源于 Cry1Ah1 的结构
域 I、结构域 II，源于 Cry1Ab13 结构域 III ；进一步
将构建好的重组质粒转化 BL21 Rosetta（DE3）进行
诱导表达，结果（图 4）显示 AhAhAb 细胞不可溶
组分明显出现约 76 kD 的目标蛋白条带，而可溶组
分中未检测到目标蛋白条带。
A B C
D E F
A，B，C ：顶部视图 ；D，E，F ：侧面视图 ；A、D ：Cry1Ab13 ；
C、F ：Cry1Ah1 ；B、E ：Cry1Ab13 与 Cry1Ah1 结构重叠图
图 1 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 结构域 I 碳骨架及二级结构
比较
A B
C D
180°
A，B ：Cry1Ab13 结 构 域 I ；C，D ：Cry1Ah1 结 构 域 I ；B 和 D 为 A 和 C 水
平旋转 180o 的视图
图 2 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 结构域 I 表面结构以及静电势
分布比较
㔃ᶴฏN
Cry1Ab
Cry1Ah
AhAhAb Ah
㔃ᶴฏM 㔃ᶴฏC
图 3 杂合蛋白的示意图
200
kD
M 1 2 3 4
116
97
66
45
M ：高分子量 Marker ；1 ：AhAhAb 细胞不可溶组分 ；2 ：空白对照细胞不可
溶组分 ；3 ：AhAhAb 细胞可溶组分 ；4 ：空白对照细胞可溶组分
图 4 杂合蛋白表达产物的 SDS-PAGE 分析
2.4 生物活性测定
对 AhAhAb 蛋白进行了小菜蛾、玉米螟、棉铃虫、
甜菜夜蛾的杀虫活性测定，结果（图 5）显示，杂
合蛋白 AhAhAb 对棉铃虫在 100 ppm 时无发育抑制
或致死活性 ；在高浓度（100 ppm）时对甜菜夜蛾有
发育抑制活性，处理组存活的试虫平均体长为对照
组的 79% ；对小菜蛾活性较低，LC50 为 10.99 ppm，
95% 置信区间为（4.57-23.38）；对玉米螟的活性较
低，LC50 为 13.66 ppm，95% 置信区间为（8.51-27.40），
并且主要活性表现为发育抑制，在蛋白浓度为 10.00
ppm 时，只有 7% 的试虫有较好的发育。
2.3 Cry1Ah与Cry1Ab杂合蛋白构建与表达
由于 Cry1Ah1 与 Cry1Ab13 结构域 I、结构域 II、
结构域 III 的氨基酸序列一致性分别为 69%、98%
2015,31(9) 95徐曼等：Cry1Ab/Cry1Ah 杂合蛋白构建与功能研究
3 讨论
Bt 不仅可以杀灭多种农业害虫，而且其杀虫活
性具有高度的特异性，对非靶标生物安全无害。Bt
这种高度特异的杀虫活性主要由其编码的 Cry 蛋白
决定的，因此研究 Cry 蛋白杀虫特异性及其进化规
律对 Cry 蛋白改良与应用有重要意义。本研究针对
鳞翅目害虫高效的 Cry1Ab13 与 Cry1Ah1 开展研究，
分析杂合蛋白的杀虫谱，对理解 Cry1A 蛋白杀虫特
异性的进化有重要意义。
为了研究 Cry 蛋白杀虫机制，目前已有多个杀
虫 蛋 白（Cry1［13］、Cry2［14］、Cry3［15］、Cry4［16］ 以
及 Cry8［17］）的三维结构通过 X 射线晶体衍射的方
法被解析出来，它们的结构非常相似，都有 3 个结
构域。本研究利用同源建模的方法分析 Cry1Ab13 与
Cry1Ah1 的结构域 I 发现，两者具有相同的碳骨架，
但是蛋白表面结构和电荷分布都有所不同，这可以
为进一步分析杂合蛋白活性变化的原因提供结构信
息依据。
对目前已经明确杀虫活性蛋白的各结构域进
行序列比对聚类发现，部分杀虫活性多样性（特别
是 Cry 类蛋白）可以由结构域 III 的重组获得，Cry
毒素结构域交换是一种新的杀虫特异性进化的机
制。例如 ：Cry1Ca 和 Cry1Cb 以及 Cry1Ea 和 Cry1Eb
等蛋白的结构域 I 和 II 非常相似，而序列分析发
现 Cry1Ca 和 Cry1Ea 的 结 构 域 III 有 共 同 的 起 源，
Cry1Cb 和 Cry1Eb 结构域 III 也由相同的序列变异而
来，与 Cry1Be 的结构域 III 极为相似。进一步的人
工杂合蛋白构建的研究也支持这一结论，一些 Cry1
蛋白（如 Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ba 和 Cry1Ea）对甜
菜夜蛾低或无活性，当它们的结构域 III 被 Cry1Ca
取代后，则变得具有活性［18］。此外，进一步的研
究认为，结构域 I 交换会引起杀虫蛋白在靶标害虫
中肠道细胞形成孔洞大小的不同，不会影响蛋白的
杀虫特异性［19］。本研究涉及的 Cry1Ac、Cry1Ab 与
Cry1Ah 蛋白之间也存在结构域交换的情况（Cry1Ab、
Cry1Ac 有相似的结构域 I 和 II、不同的结构域 III ；
Cry1Ac、Cry1Ah 有相似的结构域 II 和 III、不同的
结构域 I），这些变化没有影响蛋白对主要农业害虫
小菜蛾、玉米螟、棉铃虫的杀虫谱［20］。本研究构建
的杂合蛋白 AhAhAb 与 Cry1Ab 相比，有相似的结构
域 II 和 III、不同的结构域 I，杀虫活性测定结果显
示，杂合蛋白丧失了对棉铃虫的杀虫活性，改变了
对玉米螟活性类型。然而，Cry1Ac 与 Cry1Ah 之间
同样有相似的结构域 II 和 III、不同的结构域 I，但
是两者在这 3 种试虫的杀虫谱上却没有差异，只是
活性强度略有不同。这些数据显示，3D Cry 蛋白杀
虫特异性不仅可能与结构域 II、结构域 III 有关，还
有可能与包括结构域 I 在内的 3 个结构域的组合有
关。本研究数据显示，尽管 Cry1Ah 结构域 I 碳骨架
和二级结构其他 Cry1A 蛋白一致，然而由于氨基酸
序列的差异，结构域 I 的表面基团及电势分布有较
大差异［21］。3D Cry 蛋白中 3 个结构域两两之间都有
接触，包括结构域 I 在内的不同的结构域组合都会
影响蛋白结构表面微环境的变化，这些变化可能会
对 Cry 蛋白的性质产生影响。进一步分析杂合蛋白
AhAhAb 与 Cry1Ab、Cry1Ah 之间杀虫活性变化的原
因对进一步揭示 Cry1A 类蛋白杀虫特异性进化规律
有重要意义。
4 结论
本研究针对鳞翅目害虫具有高活性的 Cry1A 类
蛋白开展研究，构建了 Cry1Ab、Cry1Ah 的杂合蛋
白 AhAhAb 并 测 定 了 杀 虫 谱， 结 果 显 示 Cry1Ab，
Cry1Ah 的结构域交换引起蛋白杀虫谱的显著变化。
A
B
A ：空白对照 ；B ：100 ppm AhAhAb 蛋白处理结果
图 5 AhAhAb 蛋白对甜菜夜蛾发育抑制活性
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.996
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）