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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
抗虫 /耐草甘膦双价融合基因表达
载体的构建及烟草转化
祁伟彦 孙鹤 周妮 朱莉 郎志宏 黄大昉
(中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)
摘 要: 随着植物基因工程的发展，将多个基因转化植株已成为研究的热点之一，利用连接肽进行多个基因融合的策
略已引起广泛关注。利用连接多肽 2A和 LP4 /2A分别将抗虫基因 Bt (Bacillus thuringiensis，Bt)cry1Ah和耐草甘膦基因 mG2-
epsps连接起来，构建了 4 个融合基因表达载体 pHAG、pHLAG、pGAH、pGLAH 和两个单基因载体 pSAh、pSmG2，其中 pHAG、
pHLAG是 Bt cry1Ah基因在前，mG2-epsps基因在后，pGAH、pGLAH是 mG2-epsps基因在前，Bt cry1Ah基因在后，分别用 2A和
LP4 /2A作为连接肽，由 CaMV35S启动子驱动。利用农杆菌介导法将 6 个植物表达载体转入烟草，得到再生植株 529 株。经
PCR检测，有 261 株再生苗为阳性植株，转化率达到 49． 3%。获得的转基因烟草可用于分析连接肽 2A和 LP4 /2A的剪切效率
以及不同基因与连接肽连接位置差异对基因表达的影响。
关键词: cry1Ah mG2-epsps 2A LP4 转基因烟草
Construction of Co-ordinated Expression Vectors with Insect Resistance /
Glyphosate Tolerance and Transformation of Tobacco
Qi Weiyan Sun He Zhou Ni Zhu Li Lang Zhihong Huang Dafang
(Biotechnology ResearchInstitute，Chinese Academy of Agricultural Science，Beijing 100081)
Abstract: With the development of plant genetic engineering，the research for introducing multiple heterologous proteins into
plants becomes one of the hot spots and the polyprotein strategy for multiple genes transformation is paid growing attention． In this stud-
y，the Bt cry1Ah gene was connected with the mG2-epsps gene by the linker peptide 2A and LP4 /2A． In order to compare the splicing
efficiency between the 2A and the LP4 /2A，and study the position effect to gene expression，four coordinated expression vectors were
constructed，including pHAG，pHLAG，pGAH，pGLAH and two single expression vectors PSAh，pSmG2 were constructed as control． The
six expression vectors were transferred into tobacco by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and 529 transformants were
obtained． PCR detection showed that there were 261 PCR-positive plants and the transformation efficiency was 49． 3% ． The transgenic
plants were used for further splicing efficiency and positioneffect of target gene in polyprotein．
Key words: cryl Ah mG2-epsps 2A LP4 Transgenic tobacco
收稿日期:2011-03-28
基金项目:国家自然科学基金项目(30771383) ，转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08003-001)
作者简介:祁伟彦，女，专科，研究方向:分子生物学;E-mail:qiqiweiyan@ 163． com
通讯作者:郎志宏，副研究员，研究方向:植物基因工程;E-mail:langzh@ caas． net． cn
随着植物基因工程的快速发展，如何将多个不
同功能的基因转入植物组织并让其同步表达已成为
目前研究的重点。许多传统的方法已经应用于转基
因作物的基因叠加，并成功地应用于商业化的转基
因作物中，但传统的多基因转化手段存在各自的弊
端，如杂交和多次转化需要花费更多的时间和精力;
共转化难以做到多个基因的同步表达，连锁基因转
化引起基因沉默的可能性较大等。到目前为止还没
有一种可以满足种种要求的理想方法。在植物基因
工程中利用有自我剪切功能的口蹄疫病毒片段
2A［1，2］和凤仙花种子的 LP4［3］多肽进行多基因融合
是一种可以替代传统多基因转化方法的新手段。本
研究利用连接肽 2A 和杂合连接肽 LP4 /2A 进行基
因融合，以期探索一条快速、高效转化外源多基因的
2011 年第 10 期 祁伟彦等:抗虫 /耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化
方法，为多基因转化提供参考。
2A为来自于口蹄疫病毒的一段多肽，由 20 个
氨基酸构成，具有自我剪切功能，在生物体内翻译时
在第 19 个氨基酸(Gly)和第 20 个氨基酸(Pro)之间
会发生剪切作用，形成两个肽段［1，2］;LP4 为一段来
自于凤仙花(Impatiens balsamina L．)种子的多
肽［3］，含有保守的蛋白酶剪切位点，前体蛋白翻译
后可在胞间溶胶中被蛋白酶剪切为各成熟的肽单
元。将 LP4 的前 9 个氨基酸和 2A 融合起来形成
LP4 与 2A的杂合序列(LP4 /2A序列)，可以在肽链的
N端增加一个剪切位点，剔除多余的氨基酸残基，避免
剩余的氨基酸残基影响蛋白的活性。2004年，Francois
等［4］利用 LP4 /2A序列将基因 DmAMP1 和 RsAFP2 融
合转入拟南芥，得到了高抗病性的拟南芥植株，LP4 /2A
的剪切效率也比单独用 LP4提高了很多。
本研究将具有自主知识产权的来源于苏云金芽
胞杆菌的抗虫基因 Bt cry1Ah［5］和来自于荧光假单
胞菌的编码 EPSP 合酶耐草甘膦的基因 mG2-ep-
sps［6］融合，以 2A和 LP4 /2A 作为连接多肽，利用重
叠延伸 PCR方法，构建了 6 个植物表达载体，转化
烟草。获得的转基因烟草用于进一步分析连接肽的
剪切效率、基因表达水平。以期探索一条快速、高效
转化外源多基因的方法，为多基因转化提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
大肠杆菌(Escherichia coli)菌株 JM110、根癌农
杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404、质粒
pCAMBIA2301、pGEM-7Z、pUCS1Ah、pUCSmG2 及烟
草(Nicotiana tabaccum L．)NC89 由中国农业科学院
生物技术所郎志宏老师实验室提供。各种限制性内
切酶、连接酶、pMED19-T 载体、胶回收试剂盒等购自
TaKaRa公司;引物合成自 Invitrogen 公司。植物激素
6-BA、NAA、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、链
霉素(Sm)等羧苄青霉素(Cb)等购自 Sigma公司。
1． 2 方法
1． 2． 1 引物设计 根据文献报道的 2A 序列［7 － 9］，
设计合成互补引物 2A3F、2A3R(表 1) ，用于合成 2A
序列。用于 PCR 扩增的其他引物 AHF、AH2R1、
AG2R2、LPAH2R1、LPAG2R2、LPAG2R3、BmG2F、
AG2R1 和 LPAG2R1 见表 1。
表 1 本研究所用的引物
名称 引物序列 长度(bp) 限制性内切酶
AHF GCT CTA GAG CCA TCG ATT GAG CCA TGT TTC C 31 Xba Ⅰ，Cla Ⅰ
BmG2F TAG TCT AGA GAT ATC GGA GCT AGG GGA TA 29 Xba Ⅰ，EcoR Ⅴ
AH2R1 GTC AAA ATT CAA CAG CTG ATC AAT GTG GTA GTC AGT 36 无
AG2R1 GTC AAA ATT CAA CAG CTG AAG CTC ATC CTT CTC AGA 36 无
AG2R2 CCC AAG CTT AAG AAG GTC AAA ATT CAA CAG CTG 33 Hind Ⅲ
LPAH2R1 CGT CCG CCG CGT TGG AAT CAA TGT GGT AGT CAT TG 35 无
LPAG2R1 CGT CCG CCG CGT TGG AAA GCT CAT CCT TCT CAG A 34 无
LPAG2R2 GGT AGC CAC CTC GTC CGC CGC GTT GGA A 28 无
LPAG2R3 GTC AAA ATT CAA CAG CTG GGT AGC CAC CTC GTC CGC 36 无
2A3F
CTA GAG CAA GCT TGC GGG AGA CGT CGA GTC CAA CCC
TGG GCC CAT GGG GAA TTC GAG CT
59
Hind Ⅲ
NcoⅠ，EcoR Ⅰ
2A3R
CGA ATT CCC CAT GGG CCC AGG GTT GGA CTC GAC GTC
TCC CGC AAG CTT GCT
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EcoRⅠ，Nco Ⅰ
Hind Ⅲ
1． 2． 2 质粒载体的构建 利用重叠延伸 PCR 技术
构建了 4 个融合基因表达载体(图 1)。根据文献报
道的 2A 序列［7］，设计合成了两段互补序列 2A3F、
2A3R，退火使之结合成一段双链 DNA 片段，即 2A
后半段。用 Xba I 和 Sac I 酶切后，与同样酶切的
pGEM-7Z 大片段连接，构成质粒命名为 p7Z2AB。
以 pUCS1Ah 为模板，引物 AHF 为前引物，AH2R1、
AG2R2 为后引物进行重叠延伸 PCR扩增，所扩增片
段即 cry1Ah基因后半段且连有 2A 的前半段，命名
为 1Ah后-2A前。对其进行 Xba I 和 Hind III 双酶
切并进行片段回收，然后与用同样酶切的 p7Z2AB
回收的大片段进行连接，得到含有 cry1Ah 基因后半
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
段且连有 2A 全长的载体，命名为 p7ZBH2A。然后
用 Xba I 和 Cla I 双酶切 pUCS1Ah，得到 cry1Ah 基
因的前半段，然后将其与 p7ZBH2A 连接，获得
cry1Ah 基因且连有 2A 的中间载体，命名为
p7ZH2A。通过 Nco I 和 EcoRI 分别双酶切 pUC-
SmG2，获得 mG2-epsps 基因片段，将其与 p7ZH2A
连接，即得到用连接肽 2A 连接的 cry1Ah 基因和
mG2-epsps基因，命名为 p7ZHAG。最后，通过 Hind
III和 EcoR I 双酶切 pCAMBIA2301 和 p7ZHAG，将
构建好的融合基因插入农杆菌转化载体 pCAM-
BIA2301，形成最终融合基因表达载体 pHAG。
融合基因表达载体 pHLAG 的构建同 pHAG 的
构建，所不同的是在进行重叠延伸 PCR 时，前引物
为 AHF，后引物为 LPAH2R1、LPAG2R2、LPAG2R3。
融合基因表达载体 pGAH、pGLAH 的构建过程
同表达载体 pHAG、pHLAG 的构建，只是先将基因
mG2-epsps同 2A或 LP4 /2A连接，再连上 cry1Ah 基
因。在进行重叠 PCR 时所用的模板为 pUCSmG2，
构建 pGAH时前引物为 BmG2F，后引物为 AG2R1、
AG2R2;构建 pGLAH时前引物为 BmG2F，后引物为
LPAG2R1。
同时构建了两个单价基因载体 pSAh，pSmG2 作
为对照载体。用 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ双酶切 pCAM-
BIA2301，回收大片段，与用同样酶切的 pUCS1Ah 回
收片段连接，可以得到载体 pSAh。用 Hind Ⅲ和
EcoRⅠ双酶切质粒 pUCSmG2，回收 35SmG2nos 片
段，与用同样酶切的 pCAMBIA2301 回收片段连接，
得到载体 pSmG2。
将这 6 种植物表达载体分别导入农杆菌菌株
LBA4404 中，用于烟草的遗传转化。
cry1Ah． 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白编码基因;mG2． 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶的编码基因;35S． 花椰菜花叶病毒 35S 启
动子;NOS． 胭脂碱合成酶基因终止子;2A及 LP4 /2A． 连接肽
图 1 植物表达载体示意图
1． 2． 3 烟草的转化与再生 采用叶盘法［7］转化烟
草(NC89 品种)叶片，经 MS 培养基［8］共培养 3 d
后，转移至加有抗生素(Kan 100 μg /mL，Cb 500μg /
mL)的分化培养基培养至出现绿芽，转到生根培养
基诱导生根，再生苗移入花盆。
1． 2． 4 烟草基因组 DNA的提取及 PCR检测 提取
烟草叶片基因组 DNA，以之为模板，用引物 AHF、
AH2R1 对 Bt cry1Ah 基因进行 PCR 扩增，用引物
BmG2F、AG2R1对 mG2-epsps基因进行 PCR扩增。扩
增反应参数:94 ℃预变性 4 min，94℃ 30 s，56℃ 1 min，
72℃ 1 min，30个循环，72 ℃延伸8 min。取样10 μL在
1 %的琼脂糖凝胶上电泳 20 min检测目的基因。
2 结果
2． 1 载体的构建
为了验证连接肽 2A和 LP4 /2A的剪切效率，利
用 2A和 LP4 /2A分别连接抗虫基因 cry1Ah 和耐除
草剂基因 mG2-epsps，将两个基因分别构建在连接
肽的前端和后端，用来分析在连接肽前后位置不同
是否对基因的表达产生影响。利用重叠延伸 PCR
技术构建了 4 个融合基因表达载体:pHAG、
pHLAG、pGAH、pGLAH，其中 pHAG、pHLAG 为 Bt
cry1Ah基因在前，mG2-epsps 基因在后，前者以 2A
为连接肽，后者以 LP4 /2A为连接肽;pGAH、pGLAH
为 mG2-epsps 基因在前，Bt cry1Ah 基因在后，前者
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2011 年第 10 期 祁伟彦等:抗虫 /耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化
以 2A为连接肽，后者以 LP4 /2A为连接肽。同时构
建了两个只含有单个基因的对照载体:pSAh、
pSmG2。构建的植物表达载体酶切验证图见图 2 －
图 7。构建的融合基因表达载体 pHAG(图 2)、
pHLAG(图 3)、pGAH(图 4)、pGLAH(图 5)分别用
M． DNA分子量标准;1． Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切;2． Xho
Ⅰ酶切;3． BamHⅠ酶切
图 2 融合基因载体 pHAG的酶切验证
M． DNA分子量标准;1． Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切;2． Xho
Ⅰ酶切;3． BamHⅠ酶切
图 3 融合基因载体 pHLAG的酶切验证
M． DNA分子量标准;1． BamHⅠ酶切;2． XhoⅠ酶切;3．
Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切
图 4 融合基因表达载体 pGAH的酶切验证
Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切、XhoⅠ单酶切、BamHⅠ单酶
切来验证，结果表明载体构建正确;载体 pSAh(图
6)和 pSmG2(图 7)用 Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切、Xho
Ⅰ单酶切、NcoⅠ单酶切来验证，结果表明载体构建
正确。6 个植物表达载体可以用于农杆菌转化。
M． DNA分子量标准;1． BamHⅠ酶切;2． XhoⅠ酶切;
3． Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切
图 5 融合基因载体 pGLAH的酶切验证
M． DNA分子量标准;1． Hind Ⅲ /EcoRⅠ双酶切;2． XhoⅠ
酶切;3． NcoⅠ酶切
图 6 pSAh的酶切验证
M． DNA分子量标准;1． Hind Ⅲ /EcoRⅠ酶切;2． XhoⅠ酶
切;3． NcoⅠ酶切
图 7 pSmG2 的酶切验证
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
2． 2 根癌农杆菌介导的烟草转化
烟草转化采用叶盘法。最终得到烟草苗 529 株
(图 8) ，其中阴性对照植株 26 株，占总转化植株的
4. 91%;含单基因载体 pSAh的植株为 50 株，占总转
化植株的 9. 45%;含有 pSmG2 的植株为 59 株，占总
转化植株的 11． 15%;含有融合基因 pHAG 的植株
为 124 株，占总转化植株的 23. 44%;pHLAG的植株
为 109 株，占总转化植株的 20. 60%;pGAH 的植株
为 60 株，占总转化植株的 11. 34%;pGLAH 的植株
为 101 株，占总转化植株的 19. 09%。
A．分化培养基中诱导分化的抗性芽;B．转入生根培养基中后的抗性苗;C．转入小花盆的烟草苗;D．转入大花盆的烟草苗
图 8 转基因烟草植株的获得
2． 3 T0 代烟草植株的 PCR检测
提取烟草植株的基因组 DNA，分别利用引物
AHF、AH2R1和 BmG2F、AG2R1 进行 PCR 扩增，AHF、
AH2R1引物扩增 cry1Ah 基因，BmG2F、AG2R1 引物扩
增 mG2-epsps基因，结果(图 9)表明，携带有外源基
因的转基因烟草可以扩增目的条带，而非转基因植
株和阴性植株没有扩增出相应大小的产物。PCR
检测再生植株 529 株，其中有 261 株再生苗为阳性
植株，转化率达到 49． 3%。其中 pHAG转化植株 73
株，占总转基因植株的 27. 97%;pHLAG 转化植株
42 株，占总转基因植株的 16. 09%;pGAH转化植株
A． mG2 基因内部引物;B． cry1Ah 基因内部引物;M． 500 bp Ladder．
ck － ．阴性对照;ck +为阳性对照;1 － 9．样品
图 9 转基因植株的 PCR检测
27 株，占总转基因植株的 10. 34%;pGLAH 转化植
株 58 株，占总转基因植株的 22. 22%;pSAh 转化植
株 13 株，占总转基因植株的 4. 98%;pSmG2 转化植
株 32 株，占总转基因植株的 12. 26%;转 pCAM-
BIA2301 载体转化植株 16 株，占总转基因植株的
6. 13%。将对获得的转基因植株进行剪切效率分析
和抗虫、耐除草剂鉴定。
3 讨论
本试验利用重叠延伸 PCR(gene splicing by o-
verlap extension PCR)技术构建了 4 个融合基因表达
载体。重叠延伸 PCR 的原理是采用具有互补末端
的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的
扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增
片段重叠拼接起来。这种方法只需要两轮 PCR，一
次与 T 载体的连接，一次测序的完成就能得到目的
片段，省时、省力。重叠延伸 PCR 技术成功的关键
是重叠互补引物的设计。利用重叠延伸 PCR 技术
将 2A 和 LP4 /2A 连接在 cry1Ah 基因和 mG2-epsps
基因之间，完成了 4 个融合基因表达载体的构
建。重叠延伸 PCR 技术在基因的定点突变、融合
基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及
目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用，
为植物基因工程中载体构建的一种理想的方法。
本试验利用连接肽 2A 和 LP4 /2A 进行基因融
合，成功地将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因 Bt
cry1Ah和耐草甘膦基因 mG2-epsps 转入烟草，获得
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2011 年第 10 期 祁伟彦等:抗虫 /耐草甘膦双价融合基因表达载体的构建及烟草转化
转基因植株。下一步试验是对转基因烟草的 RNA
水平和蛋白质水平进行进一步分析，通过 western
blot和 ELISA 技术确定蛋白的表达量，如果构建的
融合基因表达载体中两个蛋白的表达量都较高且转
化植株既可以抗虫又可以耐草甘膦，那么利用连接
肽进行多基因转化的体系可以考虑在其他转基因农
作物上进行进一步应用。
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(责任编辑 李楠)
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