全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2011-12-10
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31100135）, 江苏省农业自主创新基金项目 [CX(11)4038]
作者简介 : 张旭 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物疫病诊断 ; E-mail: zhangxu8446@126.com
通讯作者 : 邵国青 , 男 , 研究员 , 博士生导师 , 研究方向 : 猪肺炎支原体免疫学机制 ; E-mail: 84391973@163.com
PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展
张旭1, 2 白方方1 武昱孜1 刘茂军1 冯志新1
熊祺琰1 张映2 邵国青1
（1 江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室 国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014 ；
2 山西农业大学动物科技学院，太谷 030801）
摘 要： 猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）是引起猪支原体肺炎的重要病原，该病常引起继发感染和混合感染，
严重威胁养猪业发展，造成巨大的经济损失。利用 PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义。从猪肺炎支原体
的特异性靶基因、临床样品采集方法与样品 DNA处理方法、关键技术因素及普通 PCR技术、多重 PCR技术、套式 PCR技术、荧
光定量 PCR技术、芯片检测和环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述。
关键词： 猪支原体肺炎 猪肺炎支原体 PCR检测 临床样品采集
Research Advances on the Detection of Mycoplasma
hyopneumoniae by PCR
Zhang Xu1, 2 Bai Fangfang1 Wu Yuzi1 Liu Maojun1 Feng Zhixin1
Xiong Qiyan1 Zhang Ying2 Shao Guoqing1
（1Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，Ministry of Agriculture，Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu
Academy of Agricultural Science，National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products，Nanjing 210014；2College of Animal
Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801）
Abstract: Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen causing mycoplasma pneumonia of swine（MPS）. It often arises
secondary infections and mixed infections, which seriously threats the pig industry and results in huge economic losses. It is very important for
early diagnosis of swine mycoplasma pneumonia using PCR technology. The article systematically introduced specific target genes, how to collect
the clinical sample, the key technical factors of handling the DNA sample methods, and also introduced the application, research advances and
the main advantages and disadvantages of several detection methods including ordinary PCR, multiplex PCR, nested PCR, Real-time PCR,
microarray diagnostic techniques, loop-mediated isothermal amplification technology of Mycoplasma hyopneumoniae.
Key words: Mycoplasmal pneumonia of swine Mycoplasma hyopneumoniae PCR detection Clinical samples collection
猪支原体肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，
MPS），又称“气喘病”，是由猪肺炎支原体（Mycoplas-
ma hyopneumoniae，Mhp）引起的一种慢性、接触性、
高发病率及低死亡率为特点的传染病。Mhp 常与其
他细菌和病毒混合感染，引起地方性肺炎（enzootic
pneumoniae，EP）和猪呼吸道疾病综合征（porcine
respiratory disease complex，PRDC），给养猪业造成
了巨大损失［1］。由于猪群感染 MPS 后难以治愈，且
此病难以净化，避免接触 Mhp 是最有效的预防措施，
早期快速地检测诊断十分必要。近年来对 Mhp 快速
检测方法的研究有了很大的进展，一些敏感、特异、
快速及准确的检测方法已被广泛应用于Mhp的诊断，
如临床诊断（屠宰场监测）、分离培养法、染色电镜
观察法、血清学方法、免疫学诊断方法、核酸探针
2012年第5期 55张旭等 ：PCR 技术检测猪肺炎支原体的研究进展
技术和 PCR 诊断技术等。
从病猪体内分离培养出 Mhp 被认为是猪感染
MPS 的标准判断，由于 Mhp 是世界上公认的最难分
离和鉴定的病原体之一，生长缓慢且经常因猪鼻支
原体（M. hyorhinis）过度生长而被掩盖，药物治疗
后或康复的猪也很难再分离［2］。因此，分离培养诊
断在临床上的应用仍不可行 ；由于 PCR 诊断方法具
有敏感性、特异性及产率高、扩增速度快、操作简
易快速和重复性好等独特优点，能够检测到用经典
方法检测不到的 Mhp，同时克服了培养困难、血清
学检测易发生交叉反应的缺点，因此 PCR 检测技术
在猪肺炎支原体的检测中发展迅速。
1 Mhp特异性鉴别基因
Mhp 属于原核生物界软壁菌门软膜体纲支原
体目支原体科支原体属，大小介于细菌与病毒之
间，具有高度多形性。已鉴定的 Mhp 各种蛋白 P36、
P46、P97 及 P110 等均是重要的免疫原蛋白。目前
对猪肺炎支原体 PCR 检测的靶基因主要包括 16S
rRNA 基因、P36、P46、P97 及 P110 基因。
1.1 16S rRNA基因
16S rRNA 基因是细菌染色体上编码 rRNA 相对
应的 DNA 序列，它集保守性与变异性于一身，是
目前应用最广的分子微生物学检测的靶基因，编码
16S rRNA 的基因与细菌染色体上大多数基因相比有
高度的保守性。针对 Mhp16S rRNA 基因进行检测已
有许多报道［3-6］。
1.2 编码乳酸脱氢酶的P36基因
P36 蛋白又称乳酸脱氢酶（L-lactate dehydrogen-
ase，LDH），是 Mhp 的一种特异性免疫优势蛋白。
P36 基因在 Mhp 进化过程中高度保守，具有细菌
LDH 的典型区域，并且同源性很高［7, 8］。逯晓敏等［9］
利用 P36 基因建立的猪肺炎支原体套式 PCR 检测方
法能成功检测出肺泡灌洗液中的猪肺炎支原体。
1.3 编码膜蛋白的P46基因
P46 蛋白是猪肺炎支原体的表面膜蛋白，具有
种的特异性。Mhp 克隆序列全长 1 152 bp，编码 383
个氨基酸和一个终止子（TAA）。同源性比较发现，
猪肺炎支原体的 P46 基因在 Mhp 种内保守。一些
研究者根据 Mhp P46 蛋白基因设计引物建立了普通
PCR、荧光定量 PCR、芯片检测等检测方法［10-12］。
1.4 编码黏附因子的P97基因
研究发现，P97 蛋白是 Mhp 的一种纤毛结合素
蛋白，同时也是最主要的免疫原之一，在感染Mhp后，
最早产生的抗体是针对 P97 的 IgA 和 IgM，比其他
Mhp 主要抗原的抗体早 30-60 d。Strait 等［13］成功建
立了以 P97 为靶基因荧光定量 PCR。
1.5 编码糖蛋白的P110基因
P110 是一种糖蛋白，由 1 个 P54 蛋白亚基和
2 个 P28 蛋白亚基通过二硫键组成，P110 能够抑
制 Mhp 对纤毛的黏附。丁敏等［14］根据 Mhp 保守区
域 Pll0 基因序列，建立了可以对 Mhp 培养物定量检
测的荧光定量 PCR 方法，灵敏度可达 13 copies/μL，
与常见的其他支原体、病毒和细菌无交叉反应。
2 临床样品采集
Mhp 临床样品采集主要有几种方式，包括肺组
织样本的采集 ；气管支气管灌洗液（bronchoalveolar
lavage fluids，BALF）样本的采集 ；鼻、咽和气管拭
子样本的采集（nasal，pharynx and tracheal swab）和
空气样本（air sample）的采集。
2.1 肺组织的采集
肺组织样本的采集需要将待检猪剖杀，采取新
鲜猪肺脏，并用无菌 PBS 冲洗干净，剪切正常与病
变交界处。肺组织样本采集简单，需要的人力极少，
可直观的观察到猪肺脏病理变化及严重程度，但是
每次取样都要对试验动物进行屠杀，成本较高。
2.2 BALF的采集
BALF 样本的采集需将待检猪剖杀，收集新鲜
肺脏，从气管灌入无菌 PBS 溶液，轻轻揉捏肺脏，
使 PBS 充分浸入肺脏，收集灌洗液样本。BALF 也
可直接观察猪肺脏病理变化及严重程度，操作比较
繁琐。Nienhoff［15］建立了活体采集猪支气管肺泡灌
洗液的方法，灌洗液的采集率达 20%。Kuthy 等［16］
通过比较几种采样方法，结果表明 BALF 是最佳的
采样位点，能更好地反应猪体感染 Mhp 情况。
2.3 鼻试子样本的采集
鼻拭子用于鼻咽部标本的采集。首先将待检猪
绑定后，棉签轻轻碰到鼻中隔，刺激猪打喷嚏 3-5
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期56
次后，迅速拔出棉签得到鼻拭子样本。鼻试子样本
的采集简单快捷，需要极少的人力，但检出率较低。
Otagiri 等［17］研究表明，鼻拭子更适于猪群水平的
检测而不是猪个体水平的检测。
2.4 咽、气管拭子样本的采集
咽拭子用于咽部标本的采集，主要用于 15 kg
左右的保育猪样品的采集。首先肌肉注射氯胺酮 4
mL 使待检猪全身麻醉，将嘴轻轻打开，插入喉镜，
挑起会厌软骨暴露气管口，将消毒棉签在气管和喉
头处擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，要尽量使咽部液
体浸湿棉签，迅速取出棉签，及时用高压灭菌的
PBS 浸泡所取样本。咽拭子样本的采集 Mhp 的检出
率比鼻拭子高，相对 BALF 操作简单，应激比 BALF
活体采集少，而比鼻拭子样本采集大。Stakenborg等［2］
通过对咽、气管拭子的检测和屠杀后的肺组织是否
病变作对照，结果表明咽、气管拭子和实际感染情
况基本符合。
2.5 空气样本的采集
在待检猪场，通过电磁式空气泵（内部保证无菌）
抽取猪场内自然空气，注入到无菌 PBS 的锥形瓶中，
边注边轻摇晃动，持续 4 min，之后高速离心，进行
PCR 检测。Stark 等［18］应用此方法收集空气中 Mhp，
利用套式 PCR 在 80% 有急性呼吸道疾病的猪场检
测到气源性 Mhp。在室内或温度低时采样，能增加
检测成功率。此方法操作简单，通过收集猪场气溶胶，
为猪场对 Mhp 临床诊断、净化、监测提供便利。
3 PCR检测中模板 DNA的制备
模板 DNA 的制备是 PCR 准确检测的关键因
素，不同的组织样品成分对 PCR 均有不同的抑制作
用［19］，部分样品中本身菌体数量较少及培养过程中
受到杂菌的抑制［20, 21］，因此，模板的制备对 PCR 检
测 Mhp 精确度至关重要。
3.1 双蒸水煮裂解法制备模板DNA
双蒸水煮法制备模板 DNA 适用检测 Mhp 培养
物。将培养好的 Mhp 离心，沉淀用 ddH2O 悬浮，并
经过沸水处理，即可得到基因组 DNA，此方法操作
简单，不需要昂贵的仪器，适用于实验室和基层工作。
3.2 酚-氯仿法提取模板DNA
酚 - 氯仿法适用于从含菌量高的大量组织样品
中提取模板 DNA。氯仿和酚的配合使用，加速有机
相与液相分层，萃取 DNA 溶液中的蛋白质类有机物
质，保留 DNA 于水相溶液中。此方法操作步骤较为
复杂，且需要多次更换离心管，易交叉污染 ；酚、
氯仿等有机溶剂容易造成环境污染，有损操作者健
康 ；获得的 DNA 纯度低，每次抽提都会损失一部分
核酸，且残留的成分会抑制 PCR 反应，较费时，低
浓度核酸的醇沉淀效率低，操作中应当避免交叉污
染，不太适合微量 DNA 样品。
3.3 试剂盒法制备模板DNA
试剂盒法制备模板 DNA 主要原理是蛋白酶裂解
法及离心柱式洗涤DNA，是提取基因组DNA的首选，
适用范围广泛，包括组织、灌洗液和细胞培养物等
多种样品。避免了苯酚和氯仿对人体的危害，且离
心柱式的洗涤效率比传统洗涤效率高，柱式纯化的
核酸纯度也较高 ；但在操作过程中，柱子有可能被
蛋白酶消化不彻底而阻塞，经过适量的蛋白酶以及
充分的温育，可以避免类似现象的发生。操作过程中，
称取待检组织样品，按照试剂盒使用说明进行操作，
所得样本 -20℃保存。
4 PCR及其衍生技术在Mhp检测上的应用
近些年，PCR 技术的不断改进，在对 Mhp 的
检测上有了更广泛的应用，发展了套式 PCR 诊断
技术、实时荧光定量 PCR 诊断技术、基因芯片检
测、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal
amplification，LAMP）等［22］。表 1 列举了各种不同
PCR 技术对 Mhp 的检测。
4.1 普通PCR诊断技术在Mhp诊断上的应用
研究人员根据 Mhp 16S rRNA 基因或其他特异
基因序列设计引物建立 PCR 检测技术［3, 10, 22-28］。
常规 PCR 是经典的病原检测方法，它具有简洁、
方便、快速及节约成本的优点，但敏感性较低，不
能精确定量，限制了该技术的发展，但常规 PCR 仍
然广泛应用在临床检测。
4.2 多重PCR诊断技术在Mhp诊断上的应用
多重 PCR 又称复合 PCR（multiplex PCR），是
在同一 PCR 反应体系里加上两对以上引物，使得一
次扩增能同时对几种不同类型的支原体进行检测［2］，
扩增出多个核酸片段，其反应原理、反应试剂和操
2012年第5期 57张旭等 ：PCR 技术检测猪肺炎支原体的研究进展
作过程与一般 PCR 相同，节约了时间、试剂和成本，
避免了多次配置 PCR 体系所造成的污染 ；但由于多
重 PCR 扩增时，同时用几对引物，可能引起非特异
性扩增，对结果造成影响 ；通过引物优化，可避免
这一现象出现。
4.3 套式PCR诊断技术在Mhp诊断上的应用
套式 PCR 又称巢式 PCR（Nested PCR，nPCR），
即在第一对引物（外套引物）的扩增区域内另行设
计一对引物（内套引物），用外套的扩增产物做模板
进行第二次扩增。套式 PCR 外套扩增增加了起始模
板量，内套引物扩增将目的基因进一步倍增至可观
察的量，由于采用两对不同的引物二级放大，故可
提高 PCR 检测的灵敏度，保证产物的特异性，使灵
敏度和特异性高于传统的PCR方法。此方法可快速、
特异地从感染猪的鼻拭子和气管、支气管灌洗液中
检测到 Mhp［9, 16, 18, 29-31］。这种方法敏感性较高，可
用于活体猪和死亡猪的检查，极大地方便了 Mhp 的
流行病学研究，有利于了解猪场中病原感染及传播
方式，但阴性样品容易受到气溶胶中 Mhp 的污染，
需要谨慎操作。
4.4 实时荧光定量PCR在猪肺炎支原体检测中的
应用
随着分子生物学技术的发展，上述的 PCR 检
测只能对 Mhp 进行定性以及半定量的检测，难以
准确定量，实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检
测技术的建立填补了不能准确定量的空缺，已有
许多研究者建立荧光定量 PCR 方法对 Mhp 的检
测 ［11, 13, 14, 32-35］。
Strait 等［13］根据 Mhp232 株的全基因组序列，
设计了以 Mhp165 与 Mhp183（P97）为靶基因的荧
光定量 PCR 方法。该方法检测人工发病试验获得的
猪肺炎支原体感染样品，检出率近 100%，仅有一份
表 1 猪肺炎支原体各种 PCR检测技术比较
PCR 类型 目的基因
基因大小
（bp）
检测浓度底限 临床样本类型 DNA 制备方法 参考文献
普通 PCR 16S rRNA 200 1000 拷贝 无 \ ［3］
16S rRNA 649 5 CFU 鼻拭子 煮沸法 ［4］
基因间序列 P36 948 50 pg 肺组织及支气管灌洗液 DNA 提取试剂盒（罗氏） ［20］
16S rRNA 645 0.18 CFU/g 肺组织 DNA 提取试剂盒（Qiagen） ［27］
多重 PCR 16S rRNA 1000 1pg 无 酚氯仿法 ［2］
巢式 PCR MHYP1-03-950 重复序列 808 1 cell/ 过滤膜 过滤空气样本 酚氯仿法 ［18］
16S rRNA 352 80 cells 鼻拭子 煮沸法 ［29］
假定 ABC 转运蛋白 706 1 fg 支气管灌洗液、鼻拭子 \ ［30］
唯一假定序列 240 0.5-1 fg 支气管刷、肺泡灌洗液 \ ［16］
16S rRNA 352 \ 肺组织和鼻拭子 组织提取试剂盒 ［17］
荧光定量
PCR
mhp165
mhp183
132
90
2.5-fg/μL 鼻拭子 DNA 提取试剂盒（Qiagen） ［13］
ABC 转运蛋白基因
MHY-03-095 重复序列（REP）
91
104
1 fg 肺组织 DNA 提取试剂盒（Qiagen） ［34］
P46
P97
P102
150
101
137
13 拷贝 /mL
1.3 拷贝 /mL
1.3 拷贝 /mL
鼻腔、扁桃体、气管和
肺组织
\ ［32］
芯片检测
技术
16S rRNA
P36
P46
389
315
430
10 pg 基因组
DNA/50 μL
扁桃体组织和坏死肺组
织块
煮沸法 ［12］
LAMP 16S rRNA 581 10 拷贝 鼻拭子 细菌基因组 DNA 提取试
剂盒（TIANamp）
［37］
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期58
阳性鼻拭子未检出，可能是由于样品中猪肺炎支原
体 DNA 模板量很低。该方法能够实时监测，定量准
确，灵敏度高，特异性强，重复性好，自动化程度
高［36］。其弊端是对设备和试剂有较高的要求，检测
成本较高，不适于基层检测。
4.5 芯片检测技术在猪肺炎支原体检测中的应用
芯片检测是基于 PCR 原理的一种快速检测和
鉴定 Mhp 敏感性和特异性方法。肖国生等［12］根据
Mhp 的 16S rRNA、P36 和 P46 3 个基因的序列差异，
设计了 3 个靶基因片段，用 PCR 标记 Cy3 探针，建
立了用于检测和鉴定 Mhp 的芯片。结果显示，Mhp
与检测芯片的 3 个靶基因杂交呈阳性，猪鼻支原体
只与 Mhp-16S 靶基因杂交呈阳性，其他所测细菌和
病毒不与检测芯片的靶基因杂交，检测芯片灵敏度
能达到 10 pg 基因组 DNA/50 μL 的反应体系。
4.6 LAMP在猪肺炎支原体检测中的应用
LAMP 是一种特殊的快速、高效、特异的 PCR
检测方法，与 PCR 和 Real-time PCR 相比，不需要
昂贵的仪器设备，适合用于基层检测，在病原体检
测方面展现出令人鼓舞的前景。
郭盼盼等［37］根据 Mhp 保守基因 16S rRNA 为
靶序列设计了 6 条特异性引物，仅需在 63℃恒温条
件下，30 min 即可完成，建立了 Mhp 的 LAMP 的快
速检测方法，高敏感性的检测到 Mhp 10 个拷贝，且
具有高度的特异性 ；在临床样本检测中其敏感性高
于常规的 PCR 检测法，LAMP 具备操作简便、快速、
高效和特异等特点，在基层实验室和临床监测方面
的应用有一定的潜力 ；但 LAMP 方法也存在着定量
方面上及不能进行多重检测的缺陷，需要克服。
4.7 PCR-ELISA在猪肺炎支原体检测中的应用
猪肺炎支原体 PCR 检测除了以上提到的 PCR
相关的技术方法，还发展了与血清学方法结合的
PCR-ELISA 的方法，德国罗氏公司已形成商品化的
试剂盒。PCR-ELISA 灵敏度、特异性、准确度上
都能满足临床要求，并且对仪器要求较低。只要
有扩增仪和酶标仪就可以进行。然而该方法也有
一些不足，如污染问题严重和操作繁琐。
5 结语
分子生物学的飞速发展，为简便、快速、特异、
灵敏地检测 Mhp 提供了良好的手段。普通 PCR 由于
其简单、高效而成为一种实验室常规的 PCR 检测方
法，可用于普通培养物的鉴定，多重 PCR 提高了检
测效率，可用于多个病原的同时检测 ；套式 PCR 提
高了样品检测的灵敏性和准确性，适用于临床病料
的检测，本实验室应用 P36 套式 PCR 检测临床样本，
效果良好；荧光定量PCR的发展实现了样品的“实时、
在线”监测，适用于疫苗生产中抗原含量的精确检测；
LAMP 技术很好地弥补了常规 PCR 技术操作需要昂
贵的仪器以及跑电泳有毒污染的缺点，适合应用于
基层检测。
和其他支原体一样，为逃避宿主的监视，Mhp
进化形成与宿主相同的抗原［38］，这种物种间抗原
的变异为 Mhp 的准确检测带来了一定的难度，目前
尚未有一种方法可以把 Mhp 所有毒株都检测出来。
但同时，随着猪肺炎支原体全基因组 232 株、J 株、
7 448 株、168 株弱毒株及 168 株低代次菌株测序的
完成，为 Mhp 的引物设计提供了更全面的信息，利
于筛选到更适合于检测 Mhp 的特异性基因，也为进
一步通过 PCR 检测方法区分 Mhp 野毒株和疫苗毒株
提供了便利。
在某些情况下，单独检测一个基因是不够的，
由于环境、来源等因素的影响，个别基因丢失或未
转录，可能不能被检测出，但其仍然存在潜在危
害。在临床检测中，猪体的猪肺炎支原体的含量较
低，用普通 PCR 的敏感性难以满足检测需求，因而
需利用荧光定量 PCR 和套式 PCR 等高敏感性的检
测方法，然而这两种方法均容易导致污染情况的发
生，因此，在操作过程中要严格控制污染。解决污
染的问题可以通过设置分区，分别设立标本制备区、
PCR 扩增区、产物分析区和产物处理区 ；设置合理
的阴、阳性对照，如将已知含量的猪肺炎支原体培
养物加入到肺组织和支气管肺泡灌洗液等被检组织
及相应的健康组织设立阳性对照和阴性对照 ；通过
加入内控引物进行监测［16］等。通过上述途径和方法，
确保 PCR 检测结果的稳定可靠。
应用 PCR 技术进行猪肺炎支原体检测，需根据
试验条件和试验目的，选择合适的 PCR 相关检测技
术，还应结合临床症状和病理组织学病变进行综合
诊断［39］，以得到准确可靠的诊断结果。
2012年第5期 59张旭等 ：PCR 技术检测猪肺炎支原体的研究进展
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）