全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
实时荧光定量 PCR在猪肺炎支原体检测中的应用
王建波 1 　任杰 2 　张映 1
(1 山西农业大学动物科技学院 ,太谷 030801; 2 宁夏灵武市畜牧局 ,灵武 750400)
　　摘 　要 : 　实时荧光定量 PCR技术是一种利用荧光检测方法来定量核酸的技术 ,具有高度的灵敏性、特异性和精确性。
综述了荧光定量 PCR技术的基本原理及其在猪肺炎支原体检测中的应用。
关键词 : 　实时荧光定量 PCR　猪肺炎支原体 　定量检测
Application of Rea l2time Fluorescent Quantitative PCR Technology in
the Detection of M ycoplasm a hyopneum on iae
W ang J ianbo1 　Ren J ie2 　Zhang Ying1
(1 College of Veterinary M edicine and Anim al Science, Shanxi Agricultural Univercity, Taigu 030801;
2 Anim al Husbandry B ureau of L ingwu C ity, L ingwu 750400 )
　　Abs trac t: 　Real2time fluorescent quantitative PCR is a kind of technique that can quantify the nucleic acid on different fluores2
cence, as it features high sensitivity, accuracy, and specificity1 In this paper, the basic p rincip le of real2time PCR and its app lication in
the detection ofM ycoplasm a hyopneum oniae were reviewed1
Key wo rds: 　Real2time PCR　M ycoplasm a hyopneum oniae　Quantitative detection
收稿日期 : 2009202209
基金项目 :山西省科技厅攻关项目 (051056)
作者简介 :王建波 (19842) ,男 ,山西省大同市人 ,硕士生 ,主要从事动物分子生物学研究
通讯作者 :张映 ,女 ,教授 , E2mail: dkyzy@1261com
　　聚合酶链式反应 ( polymerase chain reaction,
PCR)自 1989年开始应用以来 ,不仅在分子生物学
领域称为常规的方法和手段 ,而且在遗传性疾病的
诊断 ,临床标本病原体的检测、法医学标本的鉴定等
方面得到了广泛的应用。实时荧光定量 PCR ( real2
time Q2PCR)结合传统 PCR的优点并克服其不足 ,
实现检测结果和检测样品之间的定性和定量关系 ,
从而可以根据需要对样品进行准确定量 [ 1 ]。另外 ,
该技术不仅实现了对 DNA模板的定量 ,而且具有灵
敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自
动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点 ,
目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领
域。
1　荧光定量 PCR技术
111　荧光定量 PCR技术的发展概况
1993年 , H iguchi[ 2 ]第一次报道了实时 PCR 方
法在 PCR过程中使用 EB插入显色 ,改良 PCR仪 ,
用紫外光照射 ,用电荷耦合装置 ( CCD )照相机检
测。荧光信号转换成循环次数的函数。除了早期循
环的产物是在 CCD检测的限度之下外 ,良好的显示
了获得每一 PCR循环产生的产物量。这种方法的
主要缺点是除了使用 EB致癌剂外 ,非特异性 PCR
产物同样地被检测出来。直到 1996年 ,实时定量
PCR仪器由美国 App lied B iosystem s公司推出。由
于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃 ,而
且与常规 PCR相比 ,它具有特异性更强、有效解决
PCR污染问题、自动化高等特点 ,目前已得到广泛
应用。
112　荧光定量 PCR技术的原理
Real2time2Q2PCR技术是指在 PCR反应体系中
加入荧光基团 ,利用荧光信号累积实时检测整个
PCR进程 ,最后通过标准曲线对未知模板进行定量
2009年第 7期 王建波等 :实时荧光定量 PCR在猪肺炎支原体检测中的应用
分析的方法。
PCR反应过程中产生的 DNA拷贝数是呈指数
方式增加的 ,随着反应循环数的增加 ,最终 PCR反
应不再以指数方式生成模板 ,从而进入平台期。在
传统的 PCR中 ,常用凝胶电泳分离并用荧光染色来
检测 PCR反应的最终扩增产物 ,因此用此终点法对
PCR产物定量存在不可靠之处。在荧光定量 PCR
中 ,对整个 PCR反应扩增过程进行了实时的监测和
连续地分析扩增相关的荧光信号 ,随着反应时间的
进行 ,监测到荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。
在 PCR反应初期 ,产生荧光的水平不能与背景明显
的区别 ,随着荧光的产生进入指数期、线性期和最终
的平台期 ,可以在 PCR反应处于指数期的某一点上
来检测 PCR产物的量 ,并且由此来推断最初的含
量 [ 3 ]。
113　实时荧光定量 PCR的相关概念
11311　阈值 ( threshold)以 PCR反应的前 15个循环
的荧光信号作为荧光本底信号 ,一般荧光阈值的定
义为 3～15个循环的荧光信号的标准偏差的 10
倍 [ 4 ]。
11312　循环阈值 ( cycle threshold, Ct值 ) Real time
PCR扩增过程中 ,每个反应管内的荧光信号达到设
定的阈值所经历的循环数 [ 5 ]。
研究表明 ,每个模板的 Ct值与该模板的起始拷
贝数的对数存在线性关系 (负相关 ) ,起始拷贝数越
多 , Ct值越小。利用一直其实拷贝数的标准品可做
出标准曲线 ,其中横坐标代表起始拷贝数的对数 ,纵
坐标代表 Ct值。因此 ,只要获得未知样品的 Ct值 ,
即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 [ 1 ]。
114　实时荧光定量 PCR技术的类型
荧光定量 PCR的技术类型包括 : SYBR GreenⅠ
检测、水解探针法 ( TaqMan探针法 )、分子信标 (mo2
lecular beacons)、杂交探针、蝎子引物法 ( scorp ions)
以及 LUXTM引物等方法 [ 1 ]。在实际应用当中 ,主要
有 SYBR GreenⅠ检测和 TaqMan探针检测两种方
法。
11411　SYBR GreenⅠ检测 　SYBR GreenⅠ是一种
能结合到 dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的
染料 ,它只有与 dsDNA结合后才会发出荧光。在变
性时 , DNA 双链分开 ,不产生荧光 ;在复性和延伸
时 ,形成 dsDNA, SYBR GreenⅠ发出荧光。通过荧
光强度的检测 ,可以实时检测 PCR扩增的产物量。
由于 SYBR GreenⅠ可以非特异性结合于 DNA 双
链 ,因此它可以与任意引物、模板相配合 ,用于任意
反应体系中。从经济角度考虑 ,它比其它的探针的
价格要便宜的多 ,但由于同样的原因 ,一旦反应体系
中出现非特异性扩增 ,那它就会影响到定量结果的
可靠性与重复性。要想用荧光染料法得到比较好的
定量结果 ,对 PCR引物设计的特异性和 PCR反应
的质量要求就比较高。在此前提下 ,用这种方法是
一种成本低廉的选择。
11412　TaqMan探针法 　这种探针的长度为 20～
24 bp,在其 5′末端标记一个荧光报告基团 , 3′末端
标记一个荧光淬灭基团 ,其序列与两引物包含序列
内的一段 DNA模板完全互补。该法利用 Taq酶的
5′→3′外切酶活性 ,当探针保持完整时 ,淬灭基团吸
收发射基团的发射荧光。在 PCR的退火期 ,探针与
模板发生特异性杂交 ,延伸期引物在 Taq酶作用下
沿 DNA模板延伸 ,当达到探针后 , TaqMan的外切酶
活性将探针切断 ,荧光信号得以释放。模板每复制
一次 ,就有一次荧光信号的释放 ,通过该技术可以对
模板进行准确定量 [ 6 ]。
由于采用了荧光和淬灭基团双末端标记 ,因此
淬灭难以彻底 ,本底较高。针对此问题 , 2000年美
国 AB I公司推出了一种新的 TaqMan2MGB 探针。
探针 3′端采用了非荧光性的淬灭基团 ,吸收报告基
团的能量后并不发光 ,大大降低了本底信号的干扰。
同时探针上还连接有 MGB (m inor groove binder)修
饰基团 ,可以将探针 Tm 值提高 10℃左右。使得较
短的探针同样能达到较高的 Tm 值并且短探针的荧
光报告基团和淬灭基团的距离更近 ,淬灭效果更好 ,
荧光背景更低 ,使得信噪比更高。另外 ,较短的探针
也降低了成本 ,还使得探针设计的成功率大为提高。
因为在模板的 DNA碱基组成不理想的情况下 ,短的
探针比长的更容易设计 [ 7 ]。
2　实时荧光定量 PCR技术在猪肺炎支原体
检测中的应用
猪肺炎支原体 (M ycoplasm a hyopneum oniae,
Mhp)是引起猪支原体肺炎又称“喘气病 ”(MPS)的
病原微生物。MPS以接触性、高度传染性、慢性、高
16
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
发病率和低死亡率为特点 ,主要表现为咳嗽、呼吸困
难 ,解剖可见肺组织肉变或大理石样病变。其主要
危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降。
高的发病率使其严重影响养猪业的经济效益 [ 8 ]。
猪肺炎支原体结构简单 ,无细胞壁。它仅有 3种细
胞器 ,即细胞膜、核糖体和原核细胞核。虽然猪肺炎
支原体的结构简单 ,但由于它对营养要求较高 ,故培
养难度大 [ 9 ]。
现有的猪肺炎支原体检测技术包括分离培养
法、电镜法、血清学方法、核酸探针法和 PCR法等。
血清学方法又包括斑点免疫试验、EL ISA等。其中
最常用的就是 EL ISA和 PCR技术 , PCR技术又最为
敏感 [ 10 ]。但是上述的这些方法只能对猪肺炎支原
体进行定性以及半定量的检测 ,利用上述方法达到
对猪肺炎支原体的准确定量是非常困难的。而荧光
定量 PCR可以达到准确定量的目的。
由于荧光定量 PCR具有高灵敏性 ,高特异性和
高精确性的特点 ,目前 ,该项技术已被应用于病原体
测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其
多态性的研究等多个领域。在猪肺炎支原体检测方
面 ,也有相关的研究。Christoph等 [ 11 ]分别利用 M hp
基因组的一个重复序列 (MHYP12032950)以及 ABC
转运蛋白基因作为模板设计了两种定量 PCR方法
检测 M hp。这两种方法的特异性均达到 100%。利
用这两种方法 ,分别对养猪场内 70头感染了 Mhp
的猪或阴性猪场内阴性的猪肺进行了检测 ,结果发
现这两种方法可以检测出 50%和 70%的病样。将
其结合使用可检测出 85%的病样。但是由于这两
种基因在体外培养的条件下会发生突变而不稳定 ,
因此这两种方法不能广泛的应用于猪肺炎支原体的
定量检测。
同戈 [ 12 ] 根据 GenBank 公布的 Mhp232 株的
P110基因、P97基因和 P46基因序列作为模板 ,并
参考了 J株以及 7448株的序列 ,设计了 3对引物 ,
通过对荧光定量 PCR的扩增曲线、标准曲线和熔解
曲线的分析筛选出引物 P110 realF /R,并构建了含有
Mhp P110基因的标准质粒 ,建立了以 P110基因序
列作为靶序列的 Mhp SYBR Green荧光定量 PCR检
测方法。该方法具有良好的特异性、重复性 ,能够检
测到 10 copy /μl的标准质粒 ,可用于 Mhp培养物和
疫苗半成品的快速定量检测。
丁敏 [ 13 ]同样是根据 Mhp保守区域 P110基因
序列 ,设计一对特异引物和 TaqMan探针 ,同时构建
了 P110基因标准质粒 ,并对 TaqMan荧光定量 PCR
反应条件进行了优化 ,建立了可以对 Mhp培养物定
量的荧光定量 PCR检测方法。研究结果表明 ,该方
法检测灵敏度可达 13 copy/μl。
3　实时荧光定量 PCR用于 M hp培养物的
定量检测
在对 Mhp大规模培养和疫苗生产中 ,常常需要
测定培养物中菌体数 ,以确定最佳收获时间。最常
用的方法有 CCU ( colour change unit,颜色变化单
位 )、CFU ( colony form unit,菌落形成单位 )、浓缩培
养物的浊度测定。猪肺炎支原体培养物在无菌条件
下 ,采用高速离心浓缩菌液 ,测定 OD420。但此方法
需要至少 15～30 m l菌液进行离心浓缩 ,不适用于
微量应用。为了减少培养物 pH 对测定结果的影
响 ,菌液需要洗涤数次 ,使菌液的收获率大大降低。
CCU计数方法比较直观 ,但对操作要求比较高。测
定结果受到很多因素的影响。CCU计数方法耗时
长 ,约 30 d,决定了该方法不适于大规模培养和疫苗
生产中对菌数的实时检测。CFU计数原理同 CCU
计数相同 ,只不过是采用固体培养基。相对于 CCU
计数 , CFU计数更加精确 ,但操作更为复杂 ,而且对
培养条件要求更高。CFU 方法同样具有耗时长的
缺点 ,也不能区分其他种支原体的干扰。但 CCU计
数和 CFU计数方法测定的是培养物中的活菌数 ,结
果更具有代表性 ,特别是在检验疫苗活菌数中具有
不可替代的作用。
沈青春等 [ 14 ]采用猪肺炎支原体 16S RNA的特
异序列为目的片段设计引物 ,构建 PCR方法测定猪
肺炎支原体培养物菌数。 PCR方法不但能够达到
和 CCU计数相同的目的 ,还具有检测速度快、重复
性强、效率高等优点 ,能特异地测定培养物中 Mhp
的核酸浓度从而确定菌体数量 ,及时有效确定最佳
收获时机。丁敏利用已经建立的荧光定量 PCR方
法对 Mhp的生长过程进行定量检测 ,建立生长曲
线 ,并与 CCU检测法、浓缩培养物的浊度法进行了
比较。结果证明 ,在Mhp培养全过程中 ,定量 PCR
(下转第 75页 )
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2009年第 7期 王曼玲等 :水稻多逆境诱导基因 O sM sr4的克隆与表达分析
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(上接第 62页 )
检测法与浊度法检测结果高度相关 ;在培养 54 h内 ,
与 CCU法检测结果高度相关。而且定量 PCR方法的
检测时间只需要几个小时 ,而 CCU法至少需要一周
以上。
4　结语
实时荧光定量 PCR技术 ,为猪肺炎支原体研究
提供了强有力的技术支撑。与其他分子生物学及传
统方法的结合 , Real time PCR技术将会有更为广阔
的应用前景。
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