全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
主要组织相容性复合体（Major histocompatibility
complex，MHC）是紧密连锁、高度多态的基因位点
所组成的染色体上的一个遗传区域，其表达产物分
布于各种细胞表面，称为 MHC 分子［1，2］。这种遗
传变异改变了肽的编码蛋白结合位点，使它们能够
结合多种外来多肽［3］。有研究表明，MHC 在机体的
免疫应答调控与免疫识别过程中有重要作用。MHC
收稿日期 ：2013-10-30
基金项目 ：甘肃省自然科学基金项目（096RJZA005）
作者简介 ：张国华，男，硕士研究生，研究方向 ：动物免疫与抗病 ；E-mail ：664802394@qq.com
通讯作者 ：马小军，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：动物免疫与抗病 ；E-mail ：maxj712@163.com
合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 多态性分析
张国华1  马小军1，2  吕伟丽1
（1. 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730037 ；2. 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）
摘 要 ： 旨在研究合作猪 DQA 基因外显子 2 多态性，确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各个等位
基因之间的遗传关系，分析其进化意义。选用 PCR-SSCP 对 439 只合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 的多态性进行检测 ；测序群体内
因变异而产生的各等位基因序列，并分析序列数据。结果显示，在合作猪 SLA-DQA 外显子 2 中发现了 7 个新等位基因，共 18 个
核苷酸多态位点，10 个氨基酸多态位点。合作猪 SLA-DQA 外显子 2 具有较丰富的多态性，群体内可能蕴藏着更加丰富的遗传资
源 ；合作猪 SLA-DQA 外显子 2 基因最初可能由一个等位基因突变分化成一大类基因 ；合作猪 SLA-DQA 外显子 2 序列与各个猪种
的 SLA-DQA 外显子 2 序列具有较高的同源性，预示着这些猪种的 SLA-DQA 外显子 2 基因最早可能来源于其分歧之前的共同祖先
原始序列 ；新发现的 7 个 SLA-DQA 外显子 2 等位基因，可能由遗传关系较近的两个等位基因突变产生。
关键词 ： 合作猪 SLA-DQA 外显子 2 多态性 PCR-SSCP
Analyzing Polymorphism of SLA-DQA Gene Exon 2 in the Hezuopig
Zhang Guohua1 Ma Xiaojun1，2 Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730037 ；2. Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal
Biotechnology，Lanzhou 730070）
Abstract:  The polymorphism, allele number, nucleotide polymorphism sites, amino acid polymorphism sites, the genetic relationship
and evolutionary significance of the alleles of the SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs were studied. Variation of SLA-DQA gene in the 439
Hezuopigwas investigated by amplification of exon 2 using PCR, followed by single-strand conformational polymorphism（SSCP）, DNA
sequencing and sequence data analysis. Result showed that seven alleles were found in the SLA-DQA geneexon 2. Eighteen nucleotide
polymorphism sites and ten amino acid polymorphism sites were identified in seven SLA-DQA gene exon 2 haplotypes. The study indicated that
a high level of sequence polymorphism existed in SLA-DQA gene exon 2 of Hezuo pigs, and the population might have more genetic resources.
SLA-DQA gene exon 2 in Hezuo pigs might be differentiated into two major categories alleles from one mutant alleles at first. SLA-DQA gene
exon 2 in Hezuo pigs and other pig had high homology, which indicated that SLA-DQA gene exon 2 in pig might come from primordial sequences
that were present in a common ancestor and persisted in the pig populations since their divergence. Seven new alleles that had near genetic
relationship, may came from the two near allele by mutation.
Key words:  Hezuopig SLA-DQA gene exon 2 Polymorphism PCR-SSCP
作为疾病抗性和易感性基因，其组成、结构和疾病
之间的关系成为抗病育种研究的一个重要部分［4，
5］。猪的 MHC 称为猪白细胞抗原（SLA），位于猪的
7 号染色体上［6］，SLA 的多态性主要集中在基因编
码区的外显子 2，具有高度的多态性和连锁不平衡，
也与猪的抗病力有密切的关系。猪 SLA-DQA 基因位
于猪 SLA-class Ⅱ区的 DQ 亚区［10］，合作猪 DQA 基
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期92
因外显子 2 的遗传多态性检测与分析，可为进一步
研究该高原猪种 MHC 的抗病性，高原适应性，抗逆
性奠定理论基础，为更好地利用中国优良的遗传资
源，进行猪抗病、抗逆性的育种研究提供有价值的
免疫遗传学基础资料。近年来，有关猪 MHC-DQA
基因的研究报道有所增加，发现其多态性可以增加
仔猪断奶前后的重量和体质［7］；谈永松等［8］对 NIH
小型猪及五指山猪的 cDNA 序列分析表明，SLA-
DQA 基因多态性主要集中在外显子 2 ；彭永波等［9］
研究发现，具有不同 SLA-DQA 基因型的猪对疾病
的抵抗能力存在着差异，且与生长、胴体品质及肉
质等性状有关。高度表达的 SLA-DQA 外显子 2 是
SLA 中功能最重要的区域，其多态性丰富［1，10］，但
是这些研究并未涉及中国合作猪（亦名蕨麻猪或山
猪），它是甘肃省甘南藏族自治州特有的地方小型猪
种。该品种生长在海拔 3 000 m、气温最低 -28.5℃
的高寒潮湿半农半牧区。具有放牧性能强、抗逆性好，
不惧暴晒和风雪、体型小、生长较慢、繁殖力低等
特点。有关中国合作猪 SLA-DQA 外显子 2 基因的研
究，国内外还没有相关文献报道。本研究旨在确定
合作猪 SLA-DQA 外显子 2 基因的等位基因和多态位
点，分析各个等位基因之间的遗传关系和进化意义，
为猪的抗病、抗逆性杂交育种研究奠定分子生物学
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究在甘南州合作市屠宰场采集合作猪血液
样品 192 份和耳组织样品 91 份，在夏河屠宰场采
集合作猪血液样品 156 份，用冰盒带回实验室，置
于 -20℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 提取 采用常规的酚 / 氯仿提取
法，从血样中提取 DNA 并溶解于 TE 缓冲液，在 1%
琼脂糖凝胶，200 V 电泳检测后，放于 -20℃冰箱保
存备用。
1.2.2 引物设计及 PCR 扩增 采用 primer5.0 引物设
计软件，根据 GenBank 发表的苏太猪 SLA-DQA 基
因核苷酸全序列（AY303988）设计第 2 外显子的核
苷酸序列引物（上游引物 ：5-TCCCTTTGTTGTCAC-
CT-3，下游引物 5-GCCTGATGTGAACGGGTA-3），
扩增目的片段约为 341 bp，引物由大连宝生物有限
公司合成。
PCR 扩增采用 20 μL 的体系，各成分用量 ：上
下游引物各 0.4 μL，模板 DNA 0.8 μL，灭菌 ddH2O2 6.4
μL，DNA-TAQ 预混酶 12 μL。
PCR 反应条件 ：预变性 95℃ 1 min ；变性 95℃
45 s，退火 49℃ 30 s，延伸 72℃ 54 s，35 个循环 ；
最后延伸 72℃ 10 min。4℃保存，PCR 产物用 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 PCR 产物的 SSCP 检测 取 2.5 μL PCR 产物，
7.5 μL 变性剂（98% 去离子甲酰胺、0.03% 二甲苯青、
0.025% 溴酚蓝、0.5 mol/L 混合而成），经 105℃变性
5 min，然后放置于冰上 10 min，在 12% 非变性聚丙
烯 酰 胺 凝 胶（Acr∶Bis=37.5∶1），4℃、240 V， 电
泳 24 h，结束后银染法显色。
1.2.4 SLA-DQA 外 显 子 2 测 序 SSCP 分 析 之 后，
选取不同基因型个体 PCR 扩增产物送至北京六合华
大基因科技股份有限公司测序。
1.2.5 数据统计分析 用 DNAMAN 进行核苷酸变异
位点、氨基酸变异位点的分析，系统发育树的构建；
Megalign 对所测的合作猪 SLA-DQA 外显子 2 序列进
行同源序列比对分析。
2 结果
2.1 PCR扩增
对采集的合作猪样 DQA 基因第 2 外显子进行扩
增，得到 341 bp 的扩增产物，经 1% 琼脂糖凝胶电
泳检测，目的条带清晰且无杂物（图 1），可以进行
下一步的 SSCP 分析。
500
400
300
100
341
bp bp
1 2 3 4 5 6 7 8 M
图 1 DQA 基因第 2 外显子扩增产物电泳图
2.2 PCR-SSCP检测结果
PCR 扩增产物经 SSCP 分析，所检测的 439 只
合作猪中共发现 7 个等位基因，分别指定为 SLA-
2014年第4期 93张国华等 ：合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 多态性分析
DQA*A、*B、*C、*D、*E、*F、*G。各等位基因的
电泳带从 2-6 条不等，结果如图 2 所示。
突 变，C 等 位 基 因 在 202 bp 处 的 A/G 突 变，B、D
等位基因 220 bp 处的 C/T 突变，E 等位基因 118 bp
处的 C/T 突变并没有引起氨基酸的变异。
对测序获得的 7 个 SLA-DQA 基因第 2 外显子的
等位基因频率进行统计分析（表 1）发现，B 等位基
因的频率最高 ；其次是 A 等位基因，分别为 42.14%
和 19.14%，为 SLA-DQA 基因的优势等位基因。
2.4 SLA-DQA基因第2外显子序列系统发育分析
为了分析合作猪 SLA-DQA 基因第 2 外显子的
等位基因与其他相应的等位基因间的遗传关系，利
用 DNAMAN 软 件 对 SLA-DQA 基 因 第 2 外 显 子 的
序列进行 NJ 树的构建（图 5）。所用序列包括本研
究获得的 7 个单倍型序列，基因库下载 AY285931
（尤卡坦猪），AY303988（苏太猪），AY906855（辛
克莱猪），DQ159886（长白猪），DQ159887（大白
猪），DQ159892（桐城猪），EU432058（梅山猪），
EU477534（五指山猪），FJ905827（甘肃猪）。图 5
显示，猪 SLA-DQA 第 2 外显子在各个品种之间的同
源性很高，遗传关系很近。在新发现的等位基因中，
B、D 的遗传关系最近，可能是由同一个等位基因突
变而产生的。
3 讨论
3.1 合作猪SLA-DQA第2外显子基因多态性
合作猪是中国古老的猪品种，分布在海拔 3 000
E A G F B C D
图 2 DQA 基因第 2 外显子 SSCP 电泳图谱
2.3 SLA-QDA基因外显子2多态位点、等位基因频
率与氨基酸差异分析
通过 PCR 产物测序，共有 7 个 DQA 基因第 2
外显子单倍型序列被确定（图 3）。对 7 个 DQA 基
因第 2 外显子 341 bp 单倍型序列进行对比分析，发
现 18 个变异位点（图 3），占分析位点的 5.28%。其
中转换位点 15 个，占变异位点的 83.33%，包括 G/A
的转换 4 个，T/C 转换 8 个，A/C 转换 2 个，G/T 转
换 1 个。颠换位点 3 个，占变异位点 16.67%。用
SLA-DQA 基因第 2 外显子和部分内含子共 341 bp 序
列推导出的氨基酸序列（图 4），共有 10 个氨基酸
位点发生了突变，其中单一氨基酸突变位点 9 个。A、
F、G 等 位 基 因 在 133 bp 处 C/T 和 241 bp 处 的 T/C
Majarity
A
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
B
C
D
E
F
G
Majarity
A
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
B
C
D
E
F
G
Majarity
A
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340
B
C
D
E
F
G
图 3 SLA-DQA 基因第 2 外显子等位基因核苷酸序列比对结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期94
m 的甘肃省甘南州等地，由于地理等原因，与群体
外的基因交流十分有限。在物种进化上，几乎所有
的脊椎动物的 MHC 的高度多态性是广泛存在的，并
在长期进化过程中被保留下来 ；MHC 的多态性对物
种的生存和繁殖都是有利的，一般认为 MHC 复合
体的每一座位基因上均存在众多的复等位基因，而
且这些等位基因均为共显性［11］。选择是 MHC 多态
性保持的基本方法［12］，有超显性选择、基因频率的
选择、会聚化与平稳选择、多样性选择及杂化交配，
这些选择的本质全是自然选择的作用。在没有考虑
选择的情况下，一般认为 MHC 的多态性是由于长
期进化过程中等位基因的积累、融合与扩增而形成
的［13］。刘云芳等［14］认为 MHC 基因的高度多态性
是由 MHC Ⅱ类抗原在免疫系统中的重要功能所决定
的，其功能是参加抗原递呈和免疫调控，这是机体
体液免疫的主要调控因素，进而决定了机体适应外
界环境的能力。由于各机体所处的环境（地理环境
和气候环境）有很大的区别，所以为了适应所处的
环境，其免疫系统具有丰富的多态，因此编码 MHC
抗原最主要功能的区域也应该表现出丰富的多态性。
本研究在合作猪 SLA-DQA 基因第 2 外显子中发现新
等位基因 7 个，之间存在大量的多态位点，占分析
位点的 5.28%，说明该基因是多碱基突变，具有高
度的多态性。这与合作猪（与平原猪种和国外品种
所处的地理环境和气候条件存在较大差异）生活在
高原这种比较恶劣的环境下所形成的适应性强，抗
逆性好，生长缓慢等特点相一致。合作猪新等位基
因的出现，可能与国内平原猪种和国外猪种所处地
理环境和气候环境的恶劣程度不同有一定的关系。
动物 MHC 与疾病的易感性和抗性有关系［15］。
SLA-DQA 基因的多态性和遗传性是为了保护机体组
织对疾病的感染［11］。免疫学研究揭示，采用免疫遗
传标记开展选种工作，可以提高畜禽的抗病力［16， 17］。
在哺乳动物的抗病育种中，MHC 基因是已经被多项
研究证实的一组重要的候选基因［4，18，19］，合作猪
抗病性强，抗逆性好，其在这方面的基因优势可以
用于猪的抗病分子育种实践之中。通过合作猪 SLA-
DQA 基因外显子 2 PCR-SSCP 分析，新发现的 7 个
等位基因，表明在合作猪群体之中蕴藏着丰富的遗
传多态性，是宝贵的遗传资源。
3.2 SLA-DQA基因外显子2系统发育
合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 序列系统发育分
A
B
C
D
E
F
G
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
图 4 SLA-DQA 基因第 2 外显子等位基因氨基酸序列对比结果
表 1 合作猪 SLA-DQA 基因第 2 外显子各等位基因频率
等位基因 数量 频率（%）
*A 30 6.83
*B 185 42.14
*C 39 8.88
*D 37 8.43
*E 32 7.29
*F 32 7.29
*G 84 19.14
A.seq
100% 95% 90%
96%
99%
99%
99%
99%
99%
98%
98%
100%
100%
97%
95%
94%
97%
G.seq
F.seq
B.seq
D.seq
AY285931.seq
DQ159886.seq
FJ905827.seq
DQ159887.seq
DQ159892.seq
AY906855.seq
C.seq
E.seq
EU432058.seq
EU477534.seq
AY303988.seq
图 5 SLA-DQA 基因第 2 外显子核苷酸序列的系统进化树
2014年第4期 95张国华等 ：合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 多态性分析
析表明，合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 遗传关系较
近，很可能是由同一个基因突变分化而来。系统发
育也表明合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 和国内平原
猪种和国外品种的 SLA-DQA 基因外显子 2 有着较高
的同源性。表明合作猪和其他猪种的 SLA-DQA 基因
外显子 2 最早可能来自于它们分歧之前的共同祖先
序列。机体对所处的地理环境和气候环境的适应可
能会提供选择压力来维持 MHC 特殊的序列［20］，各
猪种之间具有比较相似的 SLA-DQA 基因外显子 2 基
因序列，而之间的差异很可能就是因为各自所处环
境的差异而造成的。7 个新等位基因可能由遗传关
系较近的两个等位基因突变产生。
4 结论
研究获得了 7 个合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2
等位基因，说明合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2 具有
较为丰富的多态性。合作猪 SLA-DQA 基因外显子 2
最初由同一个等位基因突变分化而来。合作猪和其
他猪种的 SLA-DQA 基因外显子 2 具有较高的同源性，
预示着它们的 SLA-DQA 基因外显子 2 最早可能来源
于分歧之前的共同祖先的原始序列 ；SLA-DQA 基因
外显子 2 随地理环境和气候环境的改变而出现差异。
参 考 文 献
［1］ Snibson KJ, Maddox JF, Fabb SA, Brandon MR. Allelie variation of
ovine MHC class II DQA1 and DQA2 genes［J］. Animal Genetics,
1998, 29 ：356-362.
［2］ 孙东晓 , 张沅 , 李宁 . 蒙古绵羊和哈萨克绵羊 MHC-DRB3 基因
外显子 2 的多态性［J］. 遗传学报 , 2003, 30（8）：761-765.
［3］ Janeway CA, Travers P, Walport M, Capra JD. Immunobiology ：
the immune system in health and disease［M］. 4th ed. London ：
Current Biology Publication, 1999.
［4］ Raadsma HW. Fleece rot and boby strike in Merino Sheep V
heritability of liability to boby strike in weaner sheep under fly wave
conditions［J］. Australian Journal of Agricultural Research, 1991,
42 ：279-293.
［5］ Ballinggall KT, Fardoe K, McKeever DJ. Genomic organization and
allelic diversity within coding and non-coding regions of the Ovar-
DRB1 locus［J］. Immunogenetics, 2008, 60 ：95-103.
［6］ Rothschild MF. Selection for disease resistance in pig［J］. Pig
News Inf, 1985, 6 ：277-280.
［7］ 张冬杰 . SLA-DQA 基因的多态性与仔猪初生重和 30 日龄体重
的相关性分析［J］. 黑龙江农业科学 , 2010, 1（1）：1-2.
［8］ 谈永松 , 王林云 . 猪 MHC Ⅱ类区域基因研究进展［J］. 国外畜
牧学—猪与禽 , 2003, 23（1）：37-41.
［9］ 彭勇波 , 李奎 , 樊斌等 . 猪 SLA-DQA 一个新 SNP 的发现及遗传
效应的研究［J］. 中国农业科学 , 2005, 38（12）：2526-2530.
［10］ Amills M, Ramiya V, Norimine J, Lewin HA. The major
histocompatibility complex of ruminants［J］. Rev Sci Tech, 1998,
17 ：108-120.
［11］ 成述儒 , 罗玉柱 , 等 . 藏绵羊 DQA1 基因多态性分析［J］. 中
国农业科学 , 2011, 44（10）：2146-2153.
［12］ 潘星华 . MHC 基因分子进化研究进展［J］. 国外医学 ：遗传
学分册 , 1995, 18（1）：7-11.
［13］ 赵德荣 , 孙岚玲 . 哺乳类 MHC 多态性的形成［J］. 国外医学：
遗传学分册 , 1995, 18（6）：330-332.
［14］ 刘云芳 , 王新峰 , 等 . 多浪样 MHC-DEB3 基因座的 PCR-RFLP
多态性分析［J］. 遗传 , 2004, 26（1）：59-62.
［15］ Nagaoka Y, Kabeya H, Onuma M, et al. Ovine MHC class II DRB1
alleles associated with resistance or susceptibilitytodevelopment
of bovine leukemia virus-induced ovine lymphoma［J］. Cancer
Research, 1999, 59（4）：975-981.
［16］ Konnai S, Takeshima SN, Tajima S, et al. The influence of ovine
MHC class II DRB1 alleles onimmune response in bovine leukemia
virus infection［J］. Microbiology and Immunology, 2003, 47（3）：
223-232.
［17］ 晏光荣 , 马海明 . 分子标记在动物抗病育种中的研究进展［J］.
国外畜牧科技 , 2001, 28（6）：32-34.
［18］ 高树新 , 许尚忠 , 李金泉 , 等 . BoLA-DQA、DRB3 ～ *exon2
多态性及其与奶牛乳房炎的关联分析［J］. 畜牧兽医学报 ,
2006, 37 ：317-320.
［19］ 姚金梅 , 连林生 . 猪 SLA Ⅱ类基因多态性及其与抗病性状关
联的研究进展［J］. 中国畜牧兽医 , 2008, 35（10）：64-66.
［20］ Kanai TH, Tanioka Y, Tanigawa M, et al. Allelic diversity at class
DRB and DQB loci of the pig MHC［J］. Immunogenetics, 1999,
50（516）：295-300.
（责任编辑 马鑫）