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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
主要组织相容性复合体（Major histocompatibility
complex，MHC）是脊椎动物的一个与免疫应答和抗
病性密切相关的高度多态基因家族，其表达产物分
布于各种细胞表面，即 MHC 分子［1］。这种遗传变
异改变了肽的编码蛋白的结合位点，使它们能够结
合多种外来多肽［2］。许多研究支持了这一假设，即
MHC 基因的等位基因多样性是由寄生虫介导的平
衡选择［3-7］。猪的 MHC 称为 SLA（猪白细胞抗原），
位于猪的 7 号染色体上［8］，与猪的抗病力有密切的
收稿日期 ：2013-08-23
基金项目 ：甘肃省自然科学基金项目（096RJZA005）
作者简介 ：张国华，男，硕士研究生，研究方向 ：动物免疫与抗病 ；E-mail ：664802394@qq.com
通讯作者 ：马小军，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：动物免疫与抗病 ；E-mail ：maxj712@163.com
合作猪 SLA-DQA 基因第 4 外显子多态性分析
张国华1 马小军1，2 吕伟丽1
（1. 甘肃农业大学 动物医学院，兰州 730037 ；2. 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）
摘 要 ： 合作猪的 MHC-DQA 基因的适应性变异，其抗原识别区域（即外显子 4）通过 PCR 扩增和随后的单链构象多态性
（SSCP）和序列分析，结果显示在 439 个合作猪个体，SLA-DQA 第 4 外显子检出 4 个等位基因和 6 个基因型（AA、BB、DD、AB、
AC 和 AD），其中 A 等位基因和 AA 基因型的频率最高，为优势基因和优势基因型。对不同型的 PCR-SSCP 条带测序分析，发现 7
个突变位点（5 068 bp T → C，5 109 bp 和 5 149 bp 处缺失 C，5 131 bp A → G 导致丝氨酸变为甘氨酸，5 135 bp C → T，5 234 bp
G → A，5 136 bp 处插入 A）。遗传学分析发现，合作猪多态信息含量（PIC）为 0.240 1，属于低度多态，各种基因型的分布不显著。
研究结果证实，合作猪 SLA—DQA 基因第 4 外显子为低度多态。
关键词 ： 合作猪 SLA-DQA 基因 多态性 遗传特性。
Analyzing Polymorphism of Hezuo Swine SLA-DQA Gene Exon 4
Zhang Guohua1 Ma Xiaojun1，2 Lü Weili1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2 Gansu Key Laboratory of Herbivorpous Animal
Biotechnology，Lanzhou 730070）
Abstract: The Hezuo swine SLA-DQA gene adaptive mutation, antigen recognition region（exon 4）by PCR amplification and
subsequent single-strand conformation polymorphism（SSCP）and sequence analysis . The results show that 439 Hezuo swine individual SLA
-DQA exon 4 detection of three alleles and six genotypes（AA, BB, CC, AB, AC, BC）the highest frequency of the A allele and AA genotype,
genotype was the dominant gene and advantages .On a different type of PCR-SSCP pieces with sequencing analysis found that the fourmutated
sites（5 068 bp T → C, 5 109 bp and 5 149 bp insert C, 5 131 bp A → G cause serine into glycine, 5 135 bp C → T, at 5 136 bp insert A, the
5 234 bp G → A lead tyrosyl acid becomes cysteine.Genetic analysis ：cooperation pig polymorphic information content（PIC）was 0.240 1,
belongs to the moderate polymorphism ；significant distribution of various genotypes .The findings confirm that cooperation pig SLA - DQA gene
the 4 exon has low rich genetic polymorphism .
Key words: Hezuo swine SLA-DQA gene polymorphism Genetic characteristics
关系。MHC 分为 Ш 类基因，Ⅱ类基因是其中之一，
编码糖蛋白在细胞表面［5］，在该基因区域中，分为
两个次区域，即 DQ、DR，具有高度的多态性和连
锁不平衡［9］。目前，对 DQA 的研究集中于第二外
显子，且发现其多态性可以增加仔猪断奶前后的重
量和体质［10］；彭勇波［11］等研究发现，第 4 外显子
与猪膘厚度、内脂率、眼肌高度、肌肉失水率存在
明显的关系。高度表达的 SLA-DQA 基因的第 4 外
显子是该基因中功能最重要的区域，其多态性较丰
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期98
富［1， 2］。但是，这些研究均未涉及中国甘肃省甘南
州特有的地方猪种—合作猪（亦名蕨麻猪或山猪，
是甘肃省甘南藏族自治州特有的地方小型猪种。该
品种生长在海拔 3 000 米、气温最低-28.5℃的高寒
潮湿半农半牧区。具有放牧性能强、抗逆性好，不
惧暴晒和风雪、体型小、生长较慢、繁殖率低等特点）。
有关中国合作猪 SLA-DQA 基因的研究，国内外鲜有
报道。本试验采用 PCR-SSCP 和克隆测序的方法对
439 头合作猪的 SLA-DQA 第 4 外显子的遗传多态性
检测与分析，为进一步研究合作猪 MHC 的抗病、易
感性提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
在甘南州合作市屠宰场采集合作猪血液样品
192 份和耳组织样品 91 份，在夏河屠宰场采集合作
猪血液样品 156 份，用冰盒带回实验室，置于-20℃
保存备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 提取 采用常规的酚 / 氯仿提取
法，从血样中提取 DNA 并溶解于 TE 缓冲液，在 1%
琼脂糖凝胶，200 V 电泳检测后，放于-20℃冰箱保
存备用。
1.2.2 引物设计及 PCR 扩增 采用 Primer5.0 引物
设计软件，根据 GenBank 发表的苏太猪 SLA-DQA
基因核苷酸全序列（AY303988）设计第 4 外显子的
核苷酸序列引物（上游引物 ：5-CTCACCCCATCCC-
ACTTA-3，下游引物5-AATCCTTACCTTCCCTTC-3），
扩增目的片段约为 251 bp，引物由大连宝生物有限
公司合成。
PCR 扩增采用 20 μL 的体系，各成分用量 ：上
下游引物各 0.4 μL，模板 DNA 0.8 μL，灭菌 dd H2O
6.4 μL，DNA-TAQ 预混酶 12 μL。
PCR 反应条件 ：预变性 95℃ 1 min，变性 95℃
30 s，退火 56℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，35 个循环，
最后延伸 72℃ 10 min。4℃保存，PCR 产物用 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 PCR 产物的 SSCP 检测 取 2.5 μL PCR 产物，
7.5 μL 变性剂（98% 去离子甲酰胺、0.03% 二甲苯青、
0.025% 溴酚蓝、0.5 mol/L 混合而成），经 105℃变性
5 min，然后放置于冰上 10 min，在 12% 非变性聚丙
烯酰胺凝胶（acr∶bis=37.5∶1），4℃、200 V，电泳
24 h，结束后银染法显色。
1.2.4 SLA-DQA 外 显 子 4 测 序 SSCP 分 析 之 后，
选取不同基因型个体 PCR 扩增产物送至北京六合华
大基因科技股份有限公司测序。
1.2.5 数据统计分析 采用 SPSS17.0 计算各个基因
型的频率、等位基因频率 ；用 POPGNE 计算纯合度
（Ho）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne）；用
PIC 软件计算多态信息含量（PIC）；用 DNAMAN 进
行核苷酸序列及氨基酸序列比对。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
对采集的 439 头合作猪 DQA 的外显子 4 进行
PCR 扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测（图 1），目的条
带清晰，无杂带，片段大小为 251 bp，包含完整的
第 4 外显子和部分的第 3、4 内含子。
500
251
bpbp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300
100
图 1 DQA 基因第 4 外显子扩增产物电泳图
2.2 PCR-SSCP检测结果
对扩增的 PCR 产物进行 SSCP 分析，在 439 头
个体中，检测到 4 种等位基因 ：A-D，形成了 AA、
BB、DD、AB、AD、AC 基因型（图 2）。
AB AB ABACAA BB DD DDAD
图 2 DQA 基因第 4 外显子 SSCP 电泳图谱
2.3 合作猪SLA-DQA基因不同等位基因的序列比对
合作猪 DQA 基因第 4 外显子引物扩增区域内
2014年第2期 99张国华等 ：合作猪 SLA-DQA 基因第 4 外显子多态性分析
发现的等位基因序列测定后，以苏太猪的 DQA 基因
（GenBank No ：AY303988）序列为参考基因，比对
分析发现的 4 个等位基因（图 3）。
势基因型。
χ2 检验表明，SLA-DQA 第 4 外显子在该品种中
的 χ2 高于显著水平（P<0.05），偏离了 Hardy-Wein-
berg 平衡状态（P<0.05）。
表 2 合作猪 SLA-DQA 第 4 外显子基因及基因型分布频率
基因型 合作猪（个数） 频率
AA 334 0.760 7
BB 8 0.018 2
DD 11 0.025 1
AB 20 0.045 6
AC 14 0.031 9
AD 52 0.118 5
A 754 0.858 8
B 36 0.041
C 14 0.015 9
D 74 0.084 3
χ2 105.7
3 讨论
MHC Ⅱ类基因的主要功能是抗原递呈和参与免
疫调控（体液免疫的主要调控方式），也决定了家畜
适应外界的能力。家畜所处的环境（地理环境和气
候环境）是有很大差别的，为了更好地适应所处的
环境，免疫系统表现出了丰富的多态，所以 MHC 的
功能区的编码基因也相应的表现出丰富的遗传多态
性。普遍研究认为，哺乳动物的 MHC 遗传多态性
是长期进化过程中等位基因积累和融合所致［11］，多
态性产生的主要机制是核苷酸的替换［12］。猪 MHC-
DQA 等位基因的多态性表现在点突变的基因序列
差异之上［13］。孔晶晶等［14］在大白猪，长白猪和杜
洛克猪 DQA 基因第 4 外显子分别检测出 3 种、4 种
和 4 种基因型，且编码区发现 3 个核酸突变位点 ：
A → G，A → T，G → A ；朱璟［15］在苏太猪 DQA 第
4 外显子检测出 3 种基因型 ；吴圣龙［16］在苏太猪
DQA 第 4 外显子检测出了 2 种基因型，二者均在编
码区发现 1 个 A → G 的突变。本研究在合作猪 DQA
基因第 4 外显子区发现了 6 种基因型共 7 处突变，
并且，在 5 234 bp 处检测到的突变与孔晶晶在大白
猪、长白猪和杜洛克猪以及朱璟在苏太猪中检测到
的一致。另外，检测到合作猪 SLA-DQA 第 4 外显
子的 6 处基因突变，与中国本地的苏太猪、滇南小
5126
5163
5243
5050
5127
5164
53025244
AY303988
A
B
C
D
AY303988
A
B
C
D
AY303988
A
B
C
D
AY303988
A
B
C
D
图 3 SLA-DQA 基因第 4 外显子等位基因核苷酸序列
比对结果
2.4 SLA-DQA基因多态性分析
遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多
态信息含量（PIC）是评价群体遗传变异的重要指标。
合作猪 DQA 基因第 4 外显子的遗传多态性如表 1 所
示，PIC 为 0.240 1，为低度多态。
表 1 SLA-DQA 基因的多态信息含量、纯合度、杂合度和
等位基因数
多态位点 遗传多态参数 合作猪
外显子 4 等位基因数 4
Exon 4 纯合度 0.804 1
杂合度 0.195 9
有效等位基因数 1.339 5
多态信息含量 0.240 1
0.25
2.5 合作猪SLA-DQA基因第4外显子基因型和等位
基因分布及差异显著性检验
合作猪 SLA-DQA 基因第 4 外显子基因频率和
基因型频率分布见表 2。检测到 6 个基因型（AA、
BB、CC、AB、AC 和 BC），其中，等位基因 A 的频
率最高，为优势基因，基因型 AA 频率最高，为优
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期100
耳猪和云南野猪［17］（特点是生长速度快，瘦肉率和
繁殖率高等），外引品种猪［14］大白猪、长白猪、杜
洛克猪（特点是体型较大、生长较快和繁殖力强等）
在此基因的多态性分布上有显著的差异，这可能与
合作猪常年生活在高原恶劣环境下所具有的生长缓
慢、繁殖率低及适应性强等特点有关。猪品种之间
生长的环境、气候条件的差异，使其对外来病原体
的抵抗能力的不同，导致遗传多态性的差异［18］。研
究结果已证实在动物抗病育种中 MHC 基因是一组候
选基因，而 MHC Ⅱ类基因不同基因型的猪对疾病的
抵抗能力有一定的差异［19］，通过合作猪 DQA 基因
第 4 外显子 PCR-SSCP 分析发现了 6 个不同的基因
型，充分表明合作猪群体蕴藏着更加丰富的遗传多
态性，是宝贵的遗传资源。
基因外显子的功能区中的 SNPs，即功能 SNPs，
是导致氨基酸改变的 nsSNPs 对蛋白质的稳定性产生
显著影响的区域［20］。本研究的氨基酸变化位于编码
的跨膜区和胞质区，即 5 131 bp A → G 导致丝氨酸
变为甘氨酸，这种突变都可能影响 SLA-DQA 基因的
功能。
群体遗传学分析表明，合作猪 SLA-DQA 基因第
4 外显子的基因型频率偏离了 Hardy-Weinberg 平衡
状态，表明该区域可能受到自然选择的影响，造成
了基因型分布的不平衡，使 A 成为该品种的优势基
因，AA 为优势基因型。多态信息含量（PIC）和杂
合度（He）是群体内遗传变异的测度［21］。对某个群
体来说，PIC 和 He 的数值越大，说明该群体内基因
的一致性越差，基因的变异性也就越大 ；反之，其
数值越小，基因变异性也就越小，该群体选择的潜
力也就越小［14］。本研究发现，合作猪 PIC<0.25，为
低度多态。这可能是对高原猪种而言，受所处的特
殊环境的影响，使基因纯合，进而造成遗传多态性
之间的差异。
4 结论
本研究中合作猪 SLA-DQA 基因第 4 外显子多态
性不太丰富，属于低度多态。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
ISAAA 2013 年最新发布
2013 年是转基因作物成功商业化的第 18 年：种植面积比 2012 年上升 500 万公顷或 3%，从 1996 年的 170 万公顷增加到 2013 年的 1.75
亿公顷。
全球 27 个国家 1 800 万农民选择种植转基因作物，其中 19 个为发展中国家， 美国种植面积达到 7 010 万公顷，占全球种植面积的
40%。 巴西连续五年成为转基因作物第二大种植国，相比 2012 年，其转基因作物种植面积增加 370 万公顷，增幅达 10%，种植面积超越
其他国家。巴西更首次开始 220 万公顷抗虫和耐除草剂复合性状大豆的商业化种植。
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拉丁美洲、亚洲和非洲的农民共计种植转基因作物 9 400 万公顷，即全球转基因作物种植面积的 54%，而发达国家 8 100 万公顷的种
植面积占 46%。
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为全球首种获批的转基因甘蔗）；巴拿马批准商业化种植转基因玉米。非洲的布基纳法索和苏丹已进行商业化种植 ；喀麦隆、埃及、加纳、
肯尼亚、马拉维、尼日利亚和乌干达等国开始进行大范围新转基因作物的田间试验 ；埃及正等待复核。
公私营伙伴关系、全球研发转基因作物及政治决心对转基因作物采用率及持续性很重要。
巴西与巴斯夫公司（BASF）合作建立及批准一种可作商业化种植的耐除草剂大豆 ；孟加拉国与印度公司 Mahyco 合作研发 Bt 茄子，
并于 2013 年获批种植。另外，由国际基金会注资，并分别由国际玉米小麦改良中心（CIMMYT）及非洲农业技术基金会（AATF）管理及
执行的非洲节水玉米项目（WEMA），已由南非、肯尼亚及乌干达数个非洲国家进行。
转基因发展动力来自拉丁美洲、亚洲及非洲。2013 年，南美洲共计种植转基因作物面积达 7000 万公顷（占全球种植面积的 41%），
亚洲共计种植转基因作物面积则为 2000 万公顷（占全球种植面积的 11%），非洲共计种植转基因作物面积超过 300 万公顷，占全球种植面
积的 2%。
亚洲拥两个人口最多的国家中国及印度，都已受惠于 Bt 棉花，孟加拉国及菲律宾优先发展黄金大米。
2012 到 2013 年间，转基因作物种植面积于欧盟地区上升 15%。5 个欧盟国家种植了创记录的 148013 公顷转基因 Bt 玉米，比 2012
年增长了 15%。西班牙在欧盟排名第一，Bt 玉米的种植面积为 136962 公顷，比 2012 年增加了 18%。
（摘自国际农业生物技术应用服务组织）