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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):100-105
温度是影响植物正常生长发育的主要环境因子
之一。温度过高或过低均能抑制植物生长发育，限
制植物分布，同时也会造成植株无法恢复的伤害，
甚至会导致死亡。植物体可以响应非致死高低温，
这使其能够抵御极端温度从而存活［1］，高温能破坏
植物的正常生理和代谢过程，如光系统Ⅱ活性［2］、
花粉和种子发育［3］、乙炔还原［4］、内质网完整性［5］
及叶生长［6］等。同样，非致死性高温也能使植物
基因的表达模式发生改变。热胁迫使植物正常生长
发育所需蛋白质合成受到抑制，同时诱导产生大量
的热激蛋白，提高植物耐热性。热胁迫相关蛋白
Hsa32（heat stress associated protein32，Hsa32）是一
种小分子热激蛋白，分子量为 32 kD，在植物抵御
热胁迫及植物耐热性获得方面具有关键作用 ；另外，
收稿日期 ： 2014-11-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270737），高等学校学科创新引智计划资助项目（B13007），长江学者和创新团队发展计划资助项目
（IRT13047），北京市自然科学基金项目（6112016）
作者简介 ：贺茜，男，硕士，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：tree.hq@163.com
通讯作者 ：卢存福，男，博士，教授，研究方向 ：植物分子细胞生物学 ；E-mail ：lucunfu@bjfu.edu.cn
沙冬青 AmHsa32 基因超表达提高转基因烟草抗热性
贺茜  王艳萍  陈玉珍  卢存福　
（北京林业大学生物科学与技术学院 林木育种国家工程实验室，北京 100083）
摘 要 ： Hsa32 是一类新型的热激蛋白，主要发现于陆地植物中，对植物抗逆性的获得起关键作用。AmHsa32 是 Hsa32 的
同源蛋白之一，是从沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）克隆得到的耐热性相关基因。成功构建了 Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS
植物表达载体，经农杆菌介导转入到本生烟中。经 PCR 和 Western boltting 检测证明 AmHsa32 已经被转入到本生烟基因组中。对转
基因和野生型本生烟在高温胁迫下种子的萌发率、幼苗生长耐热性进行检测发现，转基因植物的抗热得到了明显提高。研究结果
表明，AmHsa32 可作为植物耐热基因育种的重要基因资源。
关键词 ： 沙冬青 ；AmHsa32 ；转基因 ；耐热性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.016
Ectopic-overexpression of AmHsa32 from Ammopiptanthus mongolicus
Promoted Heat Tolerance in Nicotiana benthamiana
He Qian Wang Yanping Chen Yuzhen Lu Cunfu
（College of Biological Sciences and Biotechnology，National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Beijing Forestry University，
Beijing 100083）
Abstract: Hsa32 is a novel heat-shock protein（Hsp）and mainly found in land plants and essential for acquired thermo-tolerance.
AmHsa32 as one orthologue of the Hsa32 gene, was isolated from a desert plant, Ammopiptanthus mongolicus（Leguminosae）. In order to
verify the function of AmHsa32, we constructed the plant expression vector Pcambia2300-35S-AmHsa32-OCS, and transferred it into Nicotiana
benthamiana through the medium of Agrobacterium strain. PCR and Western blotting demonstrated that AmHsa32 had been integrated into the
genome of Nicotiana benthamiana. Seed germination and seedling growth analysis indicated that overexpressing AmHsa32 resulted in enhanced
tolerance to heat stresse in transgenic Nicotiana benthamiana. Our work suggests that AmHsa32 might be a valuable gene for plant resistant
breeding with transgene technology.
Key words: Ammopiptanthus mongolicus ；AmHsa32 ；transgene ；thermotolerance
2015,31(5) 101贺茜等：沙冬青 AmHsa32基因超表达提高转基因烟草抗热性
Hsa32 也能够响应低温、干旱、盐等非生物胁迫［7，8］。
目前，对 Hsa32 蛋白的研究主要集中在拟南芥、小麦、
番茄等［9］，还未见对木本植物 Hsa32 的报道。
沙冬青是我国西北荒漠地区的常绿灌木，是
亚热带地区第三纪残遗物种［10，11］，具有很强的抵
抗干旱、寒冷、高温、盐碱等特性。与杨树等已测
序木本植物相比［12］，沙冬青抗逆基因功能研究比
较滞后，目前主要集中在抗逆基因的挖掘和功能验
证［13-26］。Chen 等［26］克隆了沙冬青的 CBL1，将其
转入到烟草中，转基因烟草相较于对照组具有较强
的抗逆性。李晓东等［27］将沙冬青脱水素基因 AmD-
HN 转入到甜菜中，抗性实验表明转基因甜菜的抗旱
性要高于非转基因。智冠华等［28］初步证明了沙冬
青基因 AmZFPG 能提高植物的耐寒性。因此，沙冬
青是研究木本植物抗逆基因资源的理想材料［29］。
我们先前的研究［29］表明，沙冬青 AmHsa32 基
因 ORF 区域为 858 bp，共编码 286 个氨基酸，与拟
南芥、玉米、水稻、番茄、小麦中 Hsa32 都有较高
的同源性。在 40℃胁迫下，AmHsa32 在沙冬青幼苗
中表达量迅速提高，1 h 后达到对照的 25 倍。除此
以外，转入 AmHsa32 基因的大肠杆菌也具有一定的
耐热性［13］。本研究构建 Pcambia2300-35S-AmHsa32-
OCS 植物表达载体，经农杆菌介导转入到模式植物
本生烟中，验证了 AmHsa32 具有提高植物耐热性的
功能。
1 材料与方法
1.1 材料
含 AmHsa32 基 因 的 菌 液、 真 核 表 达 载 体
Pcambia2300-35S-OCS、 农 杆 菌 LBA4404 以 及 野 生
型本生烟（Nicotiana benthamiana）均由本实验室保
存 提 供。 内 切 酶 Kpn I、BamH I、pMD-18T Vector、
DNA marker 均购自日本 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 真核表达载体构建 以 AMSP（5-AggTACC-
ATgTCAgCATACAgATggAAAAgC-3，下划线为 Kpn I
酶切点）为上游引物，AMSR（5-AggATCCATgCAA-
CACCAgCTATgA gACAAC-3，下划线为 BamH I 酶切
点）为下游引物，含有 AmHsa32 的菌液为模板，进
行 PCR 扩增。PCR 扩增参数 ：94℃ 5 min ；94℃ 30
s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，40 个循环 ；终延伸 72℃
10 min。 扩 增 产 物 进 行 1% 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 将
AmHsa32 目的片段切胶回收后与 pMD18-T 载体 16℃
连接 3 h，转入大肠杆菌感受态细胞。挑取阳性克隆
测序验证。对正确序列的阳性克隆提质粒，用 Kpn I
和 BamH I 双酶切，同时双酶切载体 Pcambia-2300，
均 37℃酶切 3 h，产物回收后，用 T4 连接酶 16℃连
接 3 h，获得重组载体，测序验证。提取重组载体质
粒转化农杆菌 LBA4404 感受态细胞。
1.2.2 野生型烟草侵染，T1 代转基因烟草鉴定 用
农杆菌介导的叶盘侵染法将重组载体 AmHsa32-2300
转化到野生型烟草中，将 T1 代烟草种子播种在含
150 mg/L 卡那霉素的 MS 培养基上，筛选转基因阳
性苗。选择转基因植株炼苗，之后转移至营养土中
培养。用 CTAB 法提取 T1 代不同种系转基因烟草
DNA，进行 PCR 验证。
1.2.3 Western boltting 检测 AmHsa32 抗血清是用
我们先前获得的重组蛋白 AmHsa32-N［30］注射免疫
兔子得到。液氮研磨不同株系转基因烟草，将叶片
粉末分装于无菌 2 mL EP 管，加入 200 μL 预冷过
的磷酸缓冲液（pH>7.0），将 Ep 管置于 4℃冰箱 30
min 溶解水溶性蛋白。12 000 r/min 低温离心 10 min，
取 5 mL 上清并加入 5 μL loading buffer，混匀后上样，
进行 SDS-PAGE 电泳分离 AmHsa32。随后利用水溶
式电转移转膜，进行免疫印迹反应。
1.2.4 胁迫条件下转基因烟草种子的萌发率的测
定 将 AmHsa32 转基因 T1 代烟草种子和野生型种
子在 MS 培养基中培养 12 h（25℃，16 h 光照 /8 h
黑暗）。热处理 ：37℃处理 2 h，42℃再处理 2 h 后，
转入正常培养条件，恢复培养 10 d 统计发芽率，实
验重复 3 次。
1.2.5 转 基 因 烟 草 T1 代 幼 苗 耐 热 性 分 析 将
AmHsa32 转基因烟草 T1 代种子及野生型烟草播种于
MS 培养基上，至幼苗长出 4 叶片时进行热胁迫处理。
胁迫结束后，转入 25℃控温箱（16 h 光照 /8 h 黑暗）
培养 15 d，观察转基因烟草及野生型株系的表型变
化，统计存活率，实验重复 3 次。
分别将转基因烟草和野生型种子播种于营养钵
中，培养 6 周。选择长势一致的植株进行热处理观
察表型变化。热胁迫过程 ：将土培苗在 37℃热驯
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5102
化 1 h 后，室温恢复生长 2 h，45℃再次热激 3 h 后，
在 25℃恒温培养箱中继续培养 7 d，观察表型变化，
统计植株存活率。实验重复 3 次。
2 结果
2.1 真核表达载体的构建
2.1.1 2300-Hsa 真核表达载体的构建 克隆沙冬青
AmHsa32 基因，与 pMD18-T 载体连接后测序。选择
测序正确的单克隆菌液提质粒，与 Pcambia-35s-ocs
真核表达载体构建重组质粒，具体构建见图 1。
菌培养基形成愈伤组织，培养愈伤组织 4-5 周后形
成不定芽，将不定芽转移至抑菌生根培养基中，得
到 T0 代转基因烟草。
将灭菌后的 T1 代转基因株系种子播种到 MS 培
养基（含卡那霉素）中进行抗性筛选。培养 4 周后，
转基因种子正常生长，叶片较绿，根系较为发达，
无抗性的种子叶片发黄，根系短小，最终叶片白化
死亡。在 T1 代种子中出现卡那霉素抗性分离，抗性
苗与白化苗分离比约为 3∶1。选择生长 6 周大小的
组培苗进行炼苗，3 d 后转移至营养土中生长 2 周，
提取 T1 代转基因烟草叶片 DNA 进行 PCR 检验，条
带位置在 850 bp，即 T1 代转基因株系与阳性对照在
相同位置存在目的条带（图 3）。证明 AmHsa32 已整
合到烟草基因组中，获得含卡那霉素抗性的 T1 代转
基因烟草。
ploA npt II 35S prom 35S prom
Kpn I BamH I
AmHsa32 OCS
RBLB
图 1 2300-HAS 真核表达载体构建图
2.1.2 克隆 AmHsa32 基因片段 以含有测序正确的
AmHsa32 的菌液为模板，AMSP、AMSR 为引物扩增
目的基因编码序列。PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电
泳后，获得大小约为 850 bp 的目的条带（图 2）。将
目的条带切胶回收后，与 pMD18-T 载体 16℃连接 5 h，
将连接产物转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞。将上
述连接产物涂在氨苄霉素抗性 LB 平板上筛选，挑
取菌落，37℃震荡培养后，PCR 鉴定阳性克隆。
2000
bp
1 2 3 MCK-
1000
750
500
250
100
1-3 ：AmHsa32 基因的扩增条带 ；CK- ：阴性对照 ；M ：DNA Marker
图 2 PCR 扩增 AmHsa32 电泳检测图
2.2 侵染本生烟及转基因植株T1代的鉴定
在 25℃恒温（16 h 光照 /8 h 黑暗）条件下，培
养野生型烟草 6 周后，用农杆菌介导的叶盘侵染法
将重组载体 AmHsa32-2300 转化野生型烟草。在诱
导分化培养基中暗培养侵染叶片 5 d，转入分化及抑
2000
bp
1 2 3 4 5 MCK+ wt
1000
750
500
250
100
CK+ ：阳性对照 ；1-5 ：T1 代转基因本生烟 ；wt ：野生烟草 ；M ：DNA Marker
图 3 T1 代转基因本生烟的 PCR 检测
2.3 Western blotting检测
为研究转基因烟草中 AmHsa32 的表达情况，分
别提取 T1 代不同株系转基因烟草叶片中的可溶性
蛋白，以野生型烟草可溶性蛋白作为对照，进行
Western blotting。结果（图 4）显示，T1 代不同转基
因株系（H1-1，H2-1，H3-1）均有免疫印迹信号，
而野生型烟草无信号，证明 AmHsa32 基因已在转基
因株系中表达。
CK+ H1-1 H2-1 H3-1 WT
WT ：野生型本生烟 ；H1-1、H2-1、H3-1 ：代转基因本生烟 ；CK+ ：BL21 经
过 IPTG 诱导产生的 AmHsa32
图 4 转 AmHsa32 的 Western blotting 检测
2015,31(5) 103贺茜等：沙冬青 AmHsa32基因超表达提高转基因烟草抗热性
2.4 热胁迫下烟草萌发率
将野生型烟草种子及 AmHsa32 转基因株系 T1
代种子，分别播种于 MS 培养基，在 25℃控温培养
箱（16 h 光照 /8 h 黑暗）中培养 12 h，分组进行热
胁迫。热胁迫 37℃处理 2 h 后，42℃处理 2 h 转入
25℃控温培养箱，10 d 后统计发芽率。结果（图 5）
显示，AmHsa32 转基因株系 98% 全部萌发，野生型
仅有 36% 萌发，结果表明，转 AmHsa32 基因烟草高
温胁迫抗性明显提高。
AmHsa32 转基因幼苗约有 60% 存活（图 6-B）。
培养钵中生长 6 周后的幼苗，经 42℃处理后，
恒温箱 25℃恢复培养 7 d，转基因烟草与野生型植
株的表型变化差异明显。经过热胁迫，与转基因植
株相比，野生型株系叶片变黄，逐渐白化，受害明
显（图 7-D），转基因株系 80% 叶片保持绿色（图
7-C），表明 AmHsa32 的表达能够有效减轻热胁迫对
植株的伤害。
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
25 42⑙ᓖćਁ⢉⦷% WTAmHsa32
图 5 转 AmHsa32 和野生型本生烟种子在不同温度处理下
的萌发率
2.5 T1代转基因烟草幼苗的耐热性
将野生型烟草播种在 MS 培养基，T1 代转基因
烟草播种在含抗生素的 MS 培养基中，25℃控温培
养箱（16 h 光照 /8 h 黑暗）培养幼苗长出 4 叶片时，
进行热胁迫处理，具体处理条件如表 1。37℃处理
幼苗 1 h，42℃处理 3 h，转入 25℃控温培养箱回复
培养 15 d，观察转基因株系及野生型表型，野生型
烟草约有 20% 叶片发白干枯，而转基因株系正常
生长。37℃处理幼苗 1 h，42℃处理 3 h，45℃进一
步处理 3 h，转入 25℃控温培养箱，恢复培养 15 d，
观察表型，野生型烟草幼苗全部死亡（图 6-A），而
表 1 转基因和野生型本生烟幼苗对热胁迫反应的比较
序号 热处理 野生型植株 转 AmHsa32 植株
1 37℃ 1 h ；25℃恢复 15 d 叶片绿色，植株存活 叶片绿色，植株存活
2 37℃ 3 h ；25℃恢复 15 d 叶片绿色，植株存活 叶片绿色，植株存活
3 37℃ 1 h ；42℃ 1 h ；25℃恢复 15 d 叶片绿色，植株存活 叶片绿色，植株存活
4 37℃ 1 h ；42℃ 3 h ；25℃恢复 15 d 20% 植株叶片干枯 叶片绿色，植株存活
5 37℃ 1 h ；42℃ 3 h ；45℃ 3h ；25℃恢复 15 d 全部干枯死亡 60% 存活，部分干枯死亡
WT
A B
AmHsa32
图 6 转基因及野生型本生烟热处理后恢复 15 d 后的表型
AmHsa32 WT
AmHsa32 WT
A B
C D
A，B ：转基因及野生型培养 6 周的表型 ；C，D ：转基因及野生型热激后恢
复 7 d 的表型 ；WT ：野生型烟草 ；AmHsa32 ：转基因烟草
图 7 转基因及野生型本生烟的表型
3 讨论
已有的研究表明热胁迫相关蛋白 Hsa32 对植物
耐热性的获得具有关键作用。Liu 等［30］对 Hsa32 耐
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5104
热性方面的研究表明，缺少 Hsa32 基因的拟南芥在
高温处理下较野生型更为敏感。生物信息学分析发
现 Hsa32 的氨基酸序列与 2-磷酸 3-磺基乳酸合成
酶（参与硫脂合成）相似，但是实验结果表明拟南
芥 Hsa32 突变体对高温的敏感性与硫脂的含量并无
关联，Hsa32 也不参与硫脂的合成。Charng 等［7］用
插入突变的方法在 Hsa32 基因中插入 T-DNA，该基
因的突变并不影响植物在正常温度下的生长和发育。
耐热性获得实验发现，突变株和野生型植株在经受
高温处理后，需要一段时间的恢复，再次经历高温
时，野生型长势良好，突变株则相反 ；但是如果恢
复时间不够，则突变株和野生型都会死亡。这说明
Hsa32 在植物中起作用不仅需要诱导，Hsa32 在热胁
迫后起作用也需要一段时间的恢复期。Wu 等［31］为
了探索 Hsa32 无效突变株仅存在短暂的耐热性，但
不具备长期的耐热性这一现象的内在机制，采用正
向遗传筛选的两个错义隐性等位基因（编码热激蛋
白分子伴侣 HSP101）的突变体，免疫印记和异位表
达等的实验结果都表明了 HSP101 和 HSA32 在蛋白
水平上互相调控，是一种正反馈机制，通过这种新
型的机制能够延长植物热驯化的效力。
我们前期的研究表明，转 AmHsa32 大肠杆菌
（BL21）经 50℃热胁迫后存活率较野生型明显提高。
AmHsa32 有可能结合了其他蛋白，共同维持大肠杆
菌在逆境下的正常生存［29］。本研究中转基因烟草
种子在热及低温胁迫条件下仍能全部萌发，而野生
型烟草种子在热胁迫后仅有 35% 的萌发率，这说
明 AmHsa32 提高了转基因烟草的抗热能力。幼苗的
耐热分析结果表明，AmHsa32 转基因植株抵御长时
间的高温胁迫后仍有 60% 存活，而野生型烟草全部
死亡。在模式植物拟南芥的研究中也有类似报道，
Hsa32 突变体与野生型受到同样的热胁迫（44℃）
处理 60 min 后，前者死亡［7］，这表明 Hsa32 的表达
对植物响应热胁迫有重要作用。
4 结论
构建沙冬青 AmHsa32 基因 cDNA 真核表达载体，
侵染野生型烟草，经过 PCR 及 Western blotting 鉴定
后，证实目的基因已转入烟草。对转基因烟草在高
温胁迫下的萌发率及幼苗生长分析证明，AmHsa32
使转基因植株的耐热性明显提高。
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（责任编辑 李楠）