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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
葡 萄 糖 氧 化 酶（glucose oxidase， 简 称 GOD ；
EC 1.1.3.4）是一种需氧脱氢酶，于有氧条件下能高
度专一地将 β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，
其在食品工业、医疗诊断、生物传感器等方面都有
着广泛的应用［1-3］，1999 年被我国农业部批准为 12
种“允许使用的饲料添加剂”之一。目前葡萄糖氧
化酶的工业化生产一般采用青霉属菌株和黑曲霉两
种［4］。但是野生菌产酶水平低、后续纯化困难等问
题会提高工业化生产成本，在一定程度限制其应用。
收稿日期 ：2013-02-27
基金项目 ：“十一五”国家科技支撑计划重点项目（2008BAI63B07）
作者简介 ：王帅坤，男，硕士研究生，研究方向 ：酶工程 ；E-mail ：wangshkn@126.com
通讯作者 ：孟延发，男，教授，研究方向 ：蛋白质工程与酶工程 ；E-mail ：yfmeng0902@scu.edu.com
毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件
王帅坤  郝杰清  王振伟  师慧  孟延发
（四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都 610064）
摘 要 ： 对甲醇诱导重组 Pichia pastoris GS115 mut+ 高效表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的条件进行了研究，拟建立一条高效
低成本的生产重组葡萄糖氧化酶的工艺路线。通过摇瓶试验对发酵培养基、诱导时机、pH、诱导温度、甲醇诱导浓度等进行了优化，
随后进行了 50 L 发酵罐扩大化培养。结果表明，最适发酵培养基为 YEPD 培养基，甲醇诱导产酶的最佳时机为菌体对数生长末期，
最佳诱导浓度为 1%，最适诱导 pH 范围为 6-6.5，最适诱导温度 25℃。按优化的条件用 50 L 发酵罐分批培养酵母 14 h，甲醇诱导
培养 48 h 后生物量和酶活性达到最高。菌体终密度达到 OD600 为 44，每升发酵液中产酶 105 kU，发酵液上清蛋白含量为 1 000 mg/L。
关键词 ： 葡萄糖氧化酶 毕赤酵母 诱导表达 高密度发酵
Studies on Fermentation Conditions for r-GOD Production
by Pichia pastoris GS115
Wang Shuaikun Hao Jieqing Wang Zhenwei Shi Hui Meng Yanfa
（Key Laboratory of Bio-Resources and Eco-Environment Ministry of Education，College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064）
Abstract:  Using methanol to induce the expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene cloned in Pichia pastoris GS115 mut+
was deeply investigated for establishing a high-performance but low-cost method of recombinant glucose oxidase production. The medium, the
pH, the time point of induction, the temperature and the methanol concentration for induction were optimized and studied in detail by shake
flask experiment. The results of optimization were verified by enlarged fermentation in 50 L fermentor. Results suggested that the best medium
culturing the Pichia pastoris were YEPD medium, the optimum time for induction was the mid-anaphase of logarithmic phase, the optimum
inducing concentration of methanol was 1%, and the optimum pH and temperature conditions were pH6-6.5 and 25℃. According to the optimum
conditions, the highest biomass and glucose oxidase expression level were obtained in 50 L fermentor with batch culture for 14 h and induced by
1% methanol for 48 h. The final cell density（OD600 ）was 44, 105 kU enzyme activity and 1 000 mg protein were obtained in 1 L fermentation
broth.
Key words:  Glucose oxidase Pichia pastoris Inducible expression High density fermentation
基因工程技术是解决工业化产酶的有效方法之
一，不但能大大降低生产成本，而且容易获得高产量。
20 世纪 70 年代建立的以巴斯德毕赤酵母作为重组
蛋白生产菌的高密度发酵方法已经成熟。毕赤酵母
是一类真核表达系统，它具有真核表达系统所共有
的优点，表达产物分泌至胞外，杂蛋白少，易于纯化，
从而有利于降低成本。国内外已有将葡萄糖氧化酶
基因克隆到毕赤酵母并成功表达的报道［5-7］，但有
关优化发酵生产条件的报道较少，主要集中于摇瓶
2013年第9期 137王帅坤等 ：毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件
培养规模。因此开展重组葡萄糖氧化酶大规模生产
研究就显得很有必要。本研究主要以表达葡萄糖氧
化酶基因毕赤酵母工程菌为出发菌，通过系统地优
化发酵培养条件，旨在提高重组葡萄糖氧化酶的表
达量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与培养基 表达黑曲霉葡萄糖氧化酶基
因 的 重 组 Pichia pastoris GS115 mut+ 按 参 考 文 献 构
建［7］，由本室保存。种子培养基（L-1）：酵母膏 10
g，蛋白胨 20 g，葡萄糖 20 g ；发酵培养基配方和
作 用 如 下 ：YEPD（L-1）：酵 母 膏 10 g， 蛋 白 胨 20
g，葡萄糖 20 g，溶于 1 L pH6.0，0.1 mol/L K2HPO4-
KH2PO4 缓冲液，用于毕赤酵母的初始培养与诱导
产酶 ；BMGY（L-1）：酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，甘
油 10 mL，酵母基本氮源培养基（YNB）13.4 g，生
物 素 0.000 4 g， 溶 于 1 L pH6.0，0.1 mol/L K2HPO4-
KH2PO4 缓冲液，用于发酵初始培养 ；BMMY（L
-1）：
酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，甲醇 5 mL，YNB 13.4 g，
生物素 0.000 4 g，溶于 1 L pH6.0，0.1 mol/L K2HPO4-
KH2PO4 缓冲液，用于诱导产酶 ；MD（L
-1）：葡萄糖
20 g，YNB 13.4 g，硫酸铵 5 g，生物素 0.000 4 g，用
于发酵初始培养；MM（L-1）：甲醇 5 mL，YNB 13.4 g，
硫酸铵 5 g，生物素 0.000 4 g，用于诱导产酶。诱导
用甲醇含 12 mL/L PTM1。PTM1 配方按 Invitrogen 公
司毕赤酵母表达手册配置。
1.1.2 试剂 蛋白胨（Peptone，北京奥博星），酵
母膏（Yeast Extract，湖北安琪），酵母基本氮源培
养基（YNB，DIFCO 公司），丙烯酰胺（Acr）及甲
叉双丙烯酰胺（Bis）购自 Fluka 公司，过氧化物酶
（POD）、4-氨 基 安 替 比 林（4-AA）、N-乙 基 -N-（2-
羟基 -3-磺丙基）-3-甲基苯胺钠盐（TOOS）和十二
烷基硫酸钠（SDS）购自 Sigma 公司。其余试剂均为
国产分析纯。
1.1.3 仪器 Dansence 3000K 型发酵罐（鼎兴生物
工程设备有限公司）；HZQ-C 型空气浴振荡器（哈尔
滨市东明医疗仪器厂）；高速冷冻离心机（Eppendorf
5804R）；电泳仪（Bio-Rad 公司 Power PAC300）；凝
胶成像分析仪（Bio-Rad 公司 Power PAC300）；紫外
可见分光光度计（UnicoTM UV-2102）；721 分光光度
计（上海第三分析仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 重组葡萄糖氧化酶基因工程菌的摇瓶培养
1.2.1.1 摇瓶生长曲线的绘制 挑取斜面保存菌种
于试管种子培养基，30℃、220 r/min 培养 24 h。以 5%
的接种量接种于三角瓶种子培养基，同样条件培养。
每隔 4 h 取样，用培养基作空白对照，测其在 600
nm 处的吸光值。以培养时间和 OD600 值为横纵坐标，
绘制生长曲线。
1.2.1.2 发酵培养基的筛选 以 5% 的接种量将种子
液接入发酵培养基 ：YEPD、BMGY 和 MD，30℃、
220 r/min 培养 24 h 后，补加甲醇到 YEPD 培养基至
浓度 0.5% ；对 BMGY、MD 发酵液离心，弃上清，
并 分 别 用 BMMY、MM 培 养 基 悬 浮 菌 体。 然 后 于
25℃诱导培养，每 24 h 补加一次甲醇，诱导培养 72
h 后，检测生物量和葡萄糖氧化酶表达量，确定最
佳发酵培养基。
1.2.1.3 最佳诱导时机的确定 30℃、220 r/min 分
别培养毕赤酵母 2、8、16、24 和 36 h 后，补加甲
醇至浓度 0.5%，温度降到 25℃，进行诱导培养。每
隔 24 h 补加一次甲醇，诱导培养 72 h 后根据生物量
和目的蛋白表达量确定最佳诱导时机。
1.2.1.4 培养基 pH 对诱导产酶的影响 用不同 pH
（5、5.5、6、6.5、7 和 8）0.1 mol/L K2HPO4-KH2PO4
缓冲液配置发酵培养基，30℃培养毕赤酵母 24 h 后，
补加甲醇至浓度 0.5%，于 25℃进行诱导培养。每隔
24 h 补加一次甲醇，诱导培养 48 h。分析目的蛋白
表达量，确定最适诱导 pH。
1.2.1.5 诱导温度对目的蛋白表达的影响 30℃培
养毕赤酵母 24 h 后，补加甲醇至浓度 0.5%，分别于
20℃、25℃、28℃、30℃条件下诱导葡萄糖氧化酶
的表达。每隔 24 h 补加一次甲醇，诱导培养 48 h 后
确定最佳诱导温度。
1.2.1.6 甲醇最佳诱导浓度的确定 30℃培养毕赤
酵母 24 h 后，分别用 0.5%、1%、1.5%、2% 和 4%
的甲醇于 25℃诱导培养。每隔 24 h 补加甲醇，并取
样分析酶活性、生物量。诱导培养 144 h，确定最佳
甲醇诱导浓度。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期138
1.2.2 重组葡萄糖氧化酶基因工程菌的发酵罐培养
1.2.2.1 分批诱导培养 50 L 发酵罐装入 32 L 发酵
培养基，115℃灭菌 20 min。以 5% 的接种量接入种
子液，30℃、220 r/min 培养。溶氧维持在 30%，流
加 25% 的氨水和 50% 磷酸控制 pH 在 6.0-6.5。定时
取样，测 OD600 和葡萄糖含量。当葡萄糖消耗完时，
饥饿 0.5 h，将发酵罐温度降到 25℃，开始诱导培养。
甲醇最初浓度 0.3%，使酵母细胞适应甲醇。待检测
甲醇消耗完时，流加甲醇至浓度 1%。每隔 1-3 h 取
样检测甲醇含量，探索甲醇消耗规律，以便及时补加。
每隔 6 h 取样分析生物量和目的蛋白表达量。当葡
萄糖氧化酶表达量持续 6 h 停止增长或下降时，发
酵结束。
1.2.2.2 分批补料诱导培养 分批培养阶段按上述
过程进行。当葡萄糖消耗为 0 时，补加葡萄糖至 2%，
进行补料培养。补料培养阶段每隔 1 h 取样检测葡
萄糖含量，当消耗完时及时补加。持续补料培养 4-7
h 之后，进入甲醇诱导培养阶段。诱导培养过程同上。
1.2.3 生物量、目的蛋白表达量、葡萄糖含量和甲
醇浓度分析 生物量的测定采用光电比浊计数法，
用分光光度计测发酵液 OD600 表示菌体浓度。该重
组葡萄糖氧化酶为胞外酶，其表达量分析方法如下：
取发酵液离心，检测上清酶活性、蛋白含量，并进
行 10% SDS-PAGE（样品处理方法 ：发酵液上清不
稀 释， 直 接 用 5×SDS-PAGE loading buffer 处 理 ）。
葡萄糖含量分析采用 DNS 法（3，5-二硝基水杨酸
法）。甲醇浓度分析采用品红-亚硫酸比色法，参考
文献［8］。
1.2.4 蛋白含量和酶活力测定方法 蛋白含量测
定 采 用 Bradford 法［9］， 以 BSA 作 为 标 准 蛋 白。 酶
活 力 测 定 参 照 Toyobo 方 法［10］， 并 有 所 改 进。 取
适当稀释酶液 50 μL，加入 1.0 mL 79 mmol/L pH6.0
MES-Na、131 mmol/L 葡萄糖、0.2 mmol/L 4-AA、0.3
mmol/L TOOS 和 4 U/mL POD 的反应液中，40℃反应
5 min，加入 1 mL 2% SDS 终止反应，测定 555 nm
吸光值。在上述条件下，每分钟催化生成 1 μmol/L
H2O2 所需的酶量定义为一个酶活力单位。
2 结果
2.1 摇瓶培养优化结果
如图 1 所示，毕赤酵母在摇瓶培养 4 h 后进入
对数生长期，24 h 进入对数末期，约 32 h 后进入稳
定期。用不同发酵培养基培养毕赤酵母诱导产酶，
结果如表 1 所示，在相同条件下，用 BMGY/BMMY、
YEPD 培养基培养工程菌均获得了高产酶量，约是
MM/MD 培养基的两倍。但 YEPD 培养基成分简单，
价格低廉，适宜于大规模发酵罐培养使用，因此选
择 YEPD 为最适发酵培养基。在菌体生长不同阶段
诱导产酶，由图 2 可知，初始培养毕赤酵母 24 h 后
（OD600 为 13），用甲醇诱导培养获得最高生物量和
产酶量。菌体初始培养低于或者超过 24 h，生物量
和酶活力均有所减少。
表 1 不同培养基培养毕赤酵母所得生物量和葡萄糖氧化酶
活性
培养基 OD600
蛋白含量
（mg/mL）
酶活力
（U/mL）
比活力
（U/mg）
YEPD 18 0.32 31 94
BMGY/BMMY 18.1 0.33 31 93.9
MD/MM 10 0.2 18 90
16
12
8
4
0
0 6 12
Timeh18 24 30 36 42
A
60
0n
m
图 1 重组 Pichia pastors GS115 mut+ 摇瓶生长曲线
由图 3 可知，在 pH5-8 培养毕赤酵母诱导产酶，
表达量随着 pH 的增大而提高，但酶活性测定结果
显示，在 pH6.0-6.5 时酶活性最高。因此选择最适
诱导 pH 为 6-6.5。
在 不 同 温 度 条 件 下 诱 导 产 酶， 由 图 4 可 知，
25℃条件下诱导培养，葡萄糖氧化酶表达量最高，
高于或者低于 25℃时表达量均有所下降。
不同浓度甲醇诱导产酶试验结果（图 5 和图 6）
显示，甲醇浓度为 1% 时诱导产酶效果最好，在相
同的诱导时间内，葡萄糖氧化酶表达量约是 0.5% 甲
2013年第9期 139王帅坤等 ：毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件
醇诱导的两倍。甲醇浓度高于 1% 时，葡萄糖氧化
酶表达量随甲醇浓度的增大而出现不同程度的下降。
养。在毕赤酵母适应甲醇之后，约 3 h 消耗 1% 的甲
醇，因此约每 3 h 补加 1% 的甲醇。生物量和葡萄糖
氧化酶表达量随诱导时长的增加而增加，诱导培养
48 h 后葡萄糖氧化酶表达量达到最高。菌体终密度
达到 OD600 为 44，每升发酵液中产酶 105 kU，发酵
液上清蛋白含量为 1 000 mg/L。采用分批补料诱导
培养的方法，补料培养 7 h 后诱导培养，诱导前获
图 2 不同生长点诱导培养 72 h 葡萄糖氧化酶的表达量和
菌体生物量
A ：1-6 ：分别代表在 pH5、5.5、6、6.5、7 和 8 条件下诱导产酶，
每道点样 25 μL
图 3 不同 pH 条件下诱导培养 48 h 葡萄糖氧化酶的表达
量和酶活性
1-6 ：分别代表 0.5%、1%、1.5%、2%、3% 和 4% 的甲醇诱导
产酶，每道点样 25 μL
图 6 不同浓度甲醇诱导 144 h 葡萄糖氧化酶的表达量
图 4 温度对葡萄糖氧化酶表达量的影响
图 5 不同浓度甲醇诱导葡萄糖氧化酶表达动力学
20
18
16
14
12
32
28
24
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
U/m
L
Enzyme activity
20
1610
0 8
Induction timeh
16 24 32 40
A
60
0
nm
A 600 nm
0.24
0.20
0.16
0.12
0.08
20
16
12
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
U/m
L
Enzyme activity
8
5 6
pH
7 8
Pr
ot
ei
n
co
nt
mg
/m
L
Protein cont
1A
B
2 3 4 5 6
2.2 发酵罐培养结果
采用分批诱导培养的方法诱导葡萄糖氧化酶的
表达，结果（图 7 和图 8）显示，发酵罐培养 14 h 时，
检测葡萄糖消耗为 0，OD600 为 17，开始甲醇诱导培
18
15
12
9
21 24
Temperature℃27 30
O
D
60
0/E
nz
ym
e
ac
tiv
ity
U/m
L
OD600
Enzyme activity
120
100
80
60
40
20
0
2 3
Timed4 5 6
En
zy
m
e
ac
tiv
ity
U/m
L
0.5% methanol
1% methanol
1.5% methanol
2% methanol
3% methanol
4% methanol
1 2 3 4 5 6
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期140
得了较大的生物量（OD600 在 30 以上），但诱导产酶
速率降低。诱导培养 24 h 后生物量和酶活性趋于稳
定，OD600 为 41，发酵液上清酶活性仅 18 U/mL，远
低于分批诱导培养的表达水平。怀疑缺乏氮源，故
配置了酵母膏蛋白胨浓缩液，灭菌后补加进发酵罐，
继续培养 30 h，目的蛋白表达量未见增长，甲醇也
未被利用。调节补料培养时长为 4 h，然后诱导培养
39 h 后获得了最高产酶量，发酵液上清酶活性为 68
U/mL，但仍不及分批诱导培养效果。
16、24 和 36 h，分别对应于菌体生长延滞期、对数
生长初期、对数生长中期、对数生长末期和稳定期。
稳定期之前，产酶量随着初始培养时间的增长而增
加。在对数生长末期，菌体生物量大，且细胞活力强，
诱导产酶效果最好。菌体进入稳定期后，发酵液中
营养消耗，代谢产物积累，菌体活力受到抑制，在
此条件下诱导，产酶量降低。毕赤酵母生长 pH 范
围较广，在 pH4-8 均能生长，而诱导阶段最适 pH
因表达的外源蛋白的稳定性而异。在 pH5-8 诱导
表达葡萄糖氧化酶，表达量随着 pH 的增大而增高，
但酶活性在 pH6.0-6.5 时最高。这可能与葡萄糖氧
化酶的酸碱稳定性有关，当 pH>6.5 时葡萄糖氧化酶
结构可能受到了一定的损害，导致酶活性的损失。
据 Jahic 等［12］报道，毕赤酵母诱导产酶阶段，
一定范围内降低培养温度可提高 AOX 的活力，增强
甲醇利用速率。本研究不同温度诱导产酶的试验结
果与之相符，在 25℃条件下诱导培养获得了最高产
酶量。诱导阶段，甲醇浓度影响外源蛋白的表达速
率和酵母细胞的活力。浓度过低，限制酵母的生长
与产酶 ；浓度过高，则对细胞产生毒害作用，抑制
细胞产酶。甲醇浓度为 1% 时葡萄糖氧化酶表达量
最高，浓度高于 1% 时，酵母细胞受到不同程度的
毒害，产酶量随甲醇浓度的增大而下降。溶氧是酵
母生长所需的重要营养成分之一，可直接影响酵母
的生长和代谢。本试验根据 Jahic［13］在发酵罐培养
过程中选择了控制溶氧在 30% 的培养条件，酵母生
长正常。接种量也是影响发酵的因素之一，在前期
已通过摇瓶培养研究了接种量对毕赤酵母诱导产酶
的影响，在本研究中没有讨论，而是直接选用了 5%
接种量。
采用分批诱导培养方法进行 50 L 发酵罐扩大化
培养，获得了较好效果，在相同诱导培养时间内是
摇瓶发酵水平的 5 倍。采用分批补料式培养方法，
在诱导表达之前虽然获得了高密度菌体，但诱导阶
段甲醇利用率低，产酶效果差。可能是补料培养导
致菌体浓度增长迅速，消耗了大量营养物质，同时
产生过多代谢废物，抑制了酵母对甲醇的利用。
4 结论
采用重组 Pichia pastors GS115 mut+ 发酵生产重
1-7 ：分别代表甲醇诱导培养 9 h、18 h、27 h、36 h、45 h、
54 h 和 60 h，每道点样 25 μL
图 8 甲醇诱导不同时间的 SDS-PAGE 分析
OD520 变化曲线代表葡萄糖的消耗
图 7 50 L 发酵罐培养毕赤酵母结果
50
40
30
20
10
0
120 24
Timeh36 48 60 72
0
20
40
60
80
100
O
D
52
0/E
nz
ym
e
ac
tiv
ity
U/m
L
A
60
0
nm
A 600 nm
Enzyme activity
OD520
1 2 3 4 5 6 7
3 讨论
有效控制生产成本是实现大规模生产葡萄糖氧
化酶的重要因素。朱华等［11］曾通过摇瓶试验筛选
了产葡萄糖氧化酶工程菌的培养基，用豆粕粉代替
酵母膏蛋白胨作为氮源，降低了发酵成本。而本研
究采用的 YEPD 培养基所用成分均为国产，生产成
本也较低，且进行了 50 L 发酵培养，在较短的培养
周期内获得了高产酶量。初始培养毕赤酵母 2、8、
2013年第9期 141王帅坤等 ：毕赤酵母表达重组葡萄糖氧化酶的发酵条件
组葡萄糖氧化酶，通过摇瓶培养，最适发酵培养基
为 YEPD 培养基，最适诱导 pH 范围为 6-6.5，最适
诱导温度 25℃，甲醇诱导最佳时机为菌体对数生长
末期，最佳诱导浓度为 1%。
采用分批式培养方法和分批补料式培养方法进
行了 50 L 发酵罐扩大化培养。采用分批式培养方法，
初始培养 14 h，诱导培养 48 h，获得最高产酶量，
为 105 kU/L。在相同诱导培养时间内是摇瓶发酵水
平的 5 倍。而采用分批补料式培养方法，在诱导表
达之前虽然获得了高密度菌体，但产酶量不及分批
式诱导培养结果。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）