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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第11期
GDF-10（Growth differentiation factor 10，GDF-
10）基因最早是由骨形成蛋白 3 的简并寡核苷酸通过
PCR 反应发现的，主要与颅骨的发育和骨骼形态的
收稿日期 ： 2013-04-22
基金项目 ：科技部科技支撑计划（2012BAD13B05），甘肃省科技重大专项计划（1102NKDA027）
作者简介 ：李天科，男，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：litianke1987@163.com
通讯作者 ：阎萍，女，研究员，博士生导师，研究方向 ：动物遗传育种 ；E-mail ：pingyanlz@163.com
天祝白牦牛 GDF-10 基因 CDS 区的多态性及
生物信息学分析
李天科1，2，3 梁春年2，3 郎侠2，3 裴杰2，3 吴晓云2，3
刘建2，3 秦文1，2，3 阎萍1，2，3
（1. 甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070 ；2. 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050 ；
3. 甘肃省牦牛繁育工程重点实验室，兰州 730050）
摘 要 ： 采用 DNA 混合池测序法检测天祝白牦牛生长分化因子 -10（Growth differentiation factor 10，GDF-10）基因编码区
的多态性，应用生物信息学方法分析天祝白牦牛生长分化因子 -10 编码蛋白质特性。结果表明，天祝白牦牛生长分化因子 -10 基
因编码区序列存在 8 个突变位点，其中 90C → G、124C → G、1005G → A 和 1232G → C 为错义突变，导致了编码氨基酸的改变，
132T → C、822A → G、873G → T 和 888T → C 为同义突变 ；天祝白牦牛生长分化因子 -10 编码蛋白质的氨基酸序列没有明显的疏
水性区域和跨膜螺旋区 ；其存在信号肽，说明可能在细胞质中发挥生物学作用 ；天祝白牦牛生长分化因子 -10 编码产物二级结构
是以 α-螺旋和 β-折叠为主 ；氨基酸序列与普通牛的同源性为 99.4%，与人、小鼠、大鼠 4 个物种间同源性较高。
关键词 ： 天祝白牦牛 GDF-10 基因 多态性 生物信息学分析
Polymorphism and Bioinformatics Analysis of CDS in GDF-10 Gene in
Tianzhu White Yak
Li Tianke1，2 Liang Chunnian2，3 Lang Xia2，3 Pei Jie2，3 Wu Xiaoyun2，3 Liu Jian2，3
Qin Wen1，2，3 Yan Ping1，2，3
（1. College of Animal Science and Technolog，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070 ；2. Lanzhou Institute of Husbandry and
Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730050 ；3. Key Laboratory of Yak Breeding
Engineering，Lanzhou 730050）
Abstract: Mutation site in coding domain sequence of GDF-10（Growth differentiation factor -10）gene in Tianzhu white yak was
checked by DNA pooling method, and the polymorphism and the characters of amino acid sequence were analyzed by bioinformatics. The
results showed there were eight mutation（90C → G, 124C → G, 132T → C, 822A → G, 873G → T, 888T → C, 1005G → A, 1232G → C）
at sequence of CDS, four synonymous mutation（90C → G, 124C → G, 1005G → A, 1232G → C）and four missense mutation（132T → C,
822A → G, 873G → T, 888T → C）. NO obvious hydrophobic and transmembrane helical region, signal peptide was found in deduced amino
acid sequence. GDF-10 proteins would play biological function mainly in the cytoplasm. The putative secondary structure was mixed type
primarily composed of α-helix and β-extended. The deduce amino acid sequence of GDF-10 between yak and bovine, mouse and rat were high
homology, which was same as their genetic relationship.
Key words: Tuanzhu white yak GDF-10 gene Polyorphism Bioinformatic
建成有关［1］。在哺乳动物中，GDF-10 与骨形成蛋白
3b（bone morphogenetic protein 3b，BMP-3b）有 83%
的氨基酸序列是相同的，故 GDF-10 基因编码的蛋
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期80
白质也属于骨形成蛋白家族（BMP），该家族蛋白在
结构上共有的特性就是在水解后，可分裂为含有 7
个保守半胱氨酸的成熟蛋白质，在功能上的共有特
性是编码的蛋白质可以诱导并促进软骨的形成［2］。
Cunningham 等［3］最早研究发现 GDF-10 基因主要在
大脑中表达，Hino 等［4］研究人类 GDF-10 基因的转
录，通过 Northern blot 方法研究发现 GDF-10 基因的
转录过程发生的部位主要在肺、大脑、骨骼肌、胰
脏和睾丸中。Zhao 等［1］ 又在小鼠上对 GDF-10 基
因的生物学功能进行了研究，通过建立表达模型后
进行分析发现，胚胎期的小鼠 GDF-10 基因在颅骨
和脊椎骨中的表达差异显著，Hino 等［5］研究发现
GDF-10 基因的缺失将影响非洲爪蟾在胚胎期头骨的
发育。而后 Engene 和 Barbara［6］ 研究发现 GDF-10
基因的缺失可能是肢体产生畸形的原因，进一步的
研究中发现 GDF-10 也可能与细胞的程序化凋亡有
关。Adoligbe 等［7］研究 GDF-10 基因 6 个中国牛群
体多态性（SNP）并分析各基因型与体尺性状（Body
measurement traits，BMT）的相关性，研究发现 GDF-
10 基因对试验牛群体的体尺性状有显著影响，可作
为中国地方牛选育的候选分子标记。鉴于此，本研
究利用 PCR 产物混合样本 DNA 池法，快速检测天
祝白牦牛 GDF-10 基因编码区（CDS）多态性，应
用生物软件拼接天祝白牦牛 GDF-10 基因 CDS 区序
列并开展生物信息学分析，以期进一步阐明 GDF-10
基因分子的遗传特征，为牦牛生产性状候选基因研
究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为采自天祝白牦牛血样 208 份，用颈
静脉采血、ACD 抗凝的方法，采血 10 mL 带回实验
室后利用 RelaxGene 血液基因组 DNA 提取系统（天
根，北京）提取基因组 DNA，采用 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测 DNA 的质量，使用 NANO DROP 2000
（Thermo，美国）测量提取 DNA 的浓度。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据 GenBank 中普通牛的 GDF-
10 基因序列，采用交叉重叠原理［8］应用 Primer 5.0
设计 7 对引物（表 1）。分别扩增牦牛 GDF-10 基因
的 CDS 序列。引物由大连宝生物科技股份有限公司
合成。
表 1 鉴定牦牛 GDF-10 基因突变位点所用引物信息表
引物 引物序列（5-3） 退火温度（℃） 片段长度（bp）
GDF-1 F ：CCGCAGGGTCTGTTCTCA 56.0 354
R ：CCTTCGGCTGTATTTCTCA
GDF-2 F ：GTGCCCTCATCAGTTCAA
R ：GTGGCTCTGAGTAGAAGTG 57.0 271
GDF-3 F ：ACAGCCACATTCCACTTCT 57.0 378
R ：TCCCGTGTCCTTCTCCC
GDF-4 F ：GGAGAAGGACACGGGAGT 57.0 293
R ：TCGTGCTTGTGGTAGTGC
GDF-5 F ：CCAGCACTACCACAAGCA 55.0 299
R ：GGCATCGGGAACTCACA
GDF-6 F ：AGGACTCAGCCTGTAAGT 55.0 289
R ：TCATCTTGTCGGGAACG
GDF-7 F ：CTGCGTTCCCGACAAGA
R ：AATCACCAGCAATGAAAGA 55.5 298
1.2.2 PCR 扩增体系和条件 PCR 反应总体积 15 μL，
其中 2×Taq PCR MasterMix（内含 Taq DNA 聚合酶、
Mg2+、dNTPs 等 ）7.5 μL，DNA 模 板（ 约 50 ng/μL）
1 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.3 μL，超纯水 5.9
μL。扩增程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 30 s，
退火（表 1）20 s，72℃延伸 20 s，35 个循环 ；72℃
延伸 10 min，4℃保存。应用 DNA Engine Dyad® pei-
tier Thermal cyder PCR 仪进行 PCR 扩增。扩增产物
用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 PCR 产物混合样本 DNA 池构建 PCR 产物
混合样本 DNA 池参考刘文博等［9］报道的方法构建，
即以天祝白牦牛个体基因组 DNA 为模板，应用设计
的 7 对引物分别扩增 GDF-10 基因 CDS 序列，PCR
扩增产物用 1％琼脂糖凝胶电泳检测 ；从每对引物
的扩增产物中选取特异性好、产量高的 40 个 PCR
产物，每个样本取 1 μL 混合均匀构建总体积为 40
μL 的该对引物的 PCR 产物 DNA 池，用于测定各对
引物相应的扩增区序列。
1.2.4 序列测定与分析 将牦牛 GDF-10 基因 7 对
引物的相应的 PCR 产物混合样本 DNA 池送北京六
合华大基因科技股份有限公司测序（双向），应用
DNAMAN 和 Chromas 软件比对和拼接后获得该基因
CDS 区序列。GDF-10 基因 CDS 序列分析中，基因
2013年第11期 81李天科等 ：天祝白牦牛 GDF-10 基因 CDS 区的多态性及生物信息学分析
编码产物的理化特性采用 ProtParam 及 DNAStar 软
件分析，蛋白信号肽采用 SignalP 预测，亚细胞定
位［10］采用 PSORT Ⅱ预测，蛋白质二级结构［11］采
用 SSpro4.0 预测，序列同源性和系统发育分析采用
DNAMAN 及 MEGALIGN 软件分析。
2 结果
2.1 牦牛GDF-10基因PCR扩增结果
7 对引物分别扩增牦牛 GDF-10 基因 CDS 序列，
扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 扩增产
物琼脂糖电泳条带清晰，特异性良好，片段大小在
预期范围内（图 1），与设计扩增片段相符，可用于
构建 PCR 产物混合样本 DNA 池。
2.2 牦牛GDF-10基因CDS区序列比对分析
牦牛 GDF-10 基因 DNA 池测序后，应用 DNA-
MAN 软件分析测序结果，应用 Chromas 软件手工拼
1200
bp
900
700
500
330
100
M 654321 7
图 1 GDF-10 基因 7 对引物的 PCR 产物琼脂糖电泳结果
接 获 得 1 条 全 长 1 437 bp 的 DNA 序 列（ 图 2） 及
牦牛的 CDS 序列。由测序序列可知，牦牛 GDF-10
基因 CDS 序列有 90C → G、124C → G、132T → C、
822A → G、873G → T、888T → C、1005G → A、
1232G → C 的突变，由测序峰图（图 3）可知，牦
牛 GDF-10 基因 CDS 序列有 90C→G、873G→T 的多
态位点。
阴影部分碱基为突变碱基，方框中碱基为非 CDS 区
图 2 GDF-10 基因突变位点图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期82
2.3 牦牛GDF-10蛋白的生物信息学分析
2.3.1 牦牛 GDF-10 氨基酸序列推导 采用 NCBI 的
ORFFinder 程序对手工拼接获得的天祝白牦牛 GDF-
10 基因 CDS 区序列进行分析，找出 1 条长 1 434 bp
的 ORF，编码 478 个氨基酸。通过 DNAMAN 软件和
普通牛（GenBank NO ：NP_001069635）氨基酸序列
进行比对可知，天祝白牦牛与普通牛氨基酸序列在
90、124、1005 和 1232 处 存 在 差 异， 即 90C → G、
124C → G、1005G → A、1232G → C 为错义突变（表
2），其他位点为同义突变。
表 2 碱基突变位点对应的氨基酸改变
突变位点 引物 改变碱基 编码氨基酸的改变
90 GDF-1 C → G Asn → Gln
124 GDF-1 C → G Pro → Ala
1005 GDF-6 G → A Pro → Arg
1232 GDF-6 G → C Phe → Leu
2.3.2 牦牛 GDF-10 基因氨基酸序列理化特性预测
与分析 运用瑞士生物信息学研究所 ExPASy 服务
器上的 ProtParam 工具预测天祝白牦牛 GDF-10 基因
编码产物的理化性质，由氨基酸组成（图 4）可知，
GDF-10 基因编码的 478 个氨基酸中，Ala 和 Pro 所
占比例最高，分别为 10.5%，而 Trp 所占比例最低，
为 1.3% ；其分子式为 C2322H3690N688O672S21，分子质量
52.67 kD，理论等电点 9.51。GDF-10 基因编码产物
的不稳定指数 53.85，根据 Guruprasad 原则表明此编
码产物相对不稳定。
2.3.3 天 祝 白 牦 牛 GDF-10 基 因 氨 基 酸 序 列 亲 水
性 / 疏水性预测与分析 运用 ExPASy 服务器上的
Protscale 程序，对天祝白牦牛 GDF-10 蛋白进行亲 / 疏
水性分析。由图 5 可知，多肽链的第 23、24 位的赖
氨酸（Lys）具有最高的分值（3.289），疏水性最强；
第 341 位精氨酸（Arg）具有最低分值（-3.622），亲
水性最强，整条多肽链氨基酸序列表现为亲水性。
G
1776, 1218:1
2005, 1120:165
G G GCCCCCCA A AT
a b
图 3 两个突变位点的测序峰图
0
1
Ala Cys Asp Glu Phe Gly His lle Lys Leu Met
Amino Acid
Asn Pro Gln Arg Ser Thr Val Trp Tyr
2
3
4
5M
o
l
%
6
7
8
9
10
11
12
图 4 天祝白牦牛 GDF-10 基因编码氨基酸的组成
2.4
1.6
0.8
M
e
a
n
H
y
d
ro
p
h
o
b
ic
it
y
0
0.8
1.6
2.4
3.2
0 15 30 45 60 9075 105 135 165 195 225 255 285 315 345 375 405 435 465450420390360330300270240210180150120
Position
图 5 天祝白牦牛 GDF-10 基因编码蛋白的疏水性结果
2.3.4 天祝白牦牛 GDF-10 基因氨基酸序列跨膜区预
测与分析 利用 ExPASy 提供的在线跨膜区结构预
测软件 TMHMM-2.0 预测天祝白牦牛 GDF-10 氨基酸
序列的跨膜结构域，由图 6 可知，未发现跨膜螺旋区，
与其不存在明显的疏水区域的预测结果相一致。
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450
pr
ob
ab
ili
ty
transmembrane inside outside
颜色标识见电子版
图 6 天祝白牦牛 GDF-10 基因编码氨基酸序列跨膜区预测
2013年第11期 83李天科等 ：天祝白牦牛 GDF-10 基因 CDS 区的多态性及生物信息学分析
2.3.5 天祝白牦牛 GDF-10 氨基酸序列信号肽预测
与分析 运用简单模块构架搜索工具 SMART 和丹麦
科技大学（DTU）的 CBS 服务器共同对 ORF 处的天
祝白牦牛 GDF-10 进行蛋白质结构功能域分析。由
神经网络模型（NN）预测的信号肽结果（图 7）可知，
C 值为 0.800，Y 值为 0.839，都趋向于 +1，S 值为 0.926，
其切割点位于 33-34 位氨基酸之间，在剪切位点
之前高，而在剪切位点之后变低，故基本可以判定
GDF-10 基因编码产物的峰值曲线典型，存在信号肽。
1.0
0.8
0.6
0.4
Sc
or
e
0.2
0
0 10 20 30
Position
40 50 60 70
C-score
S-score
Y-score
图 7 天祝白牦牛 GDF-10 基因编码氨基酸序列信号肽分析
2.3.6 天祝白牦牛 GDF-10 的亚细胞定位预测与分
析 运用丹麦 Tekniske 大学生物学序列分析中心提
供的亚细胞定位工具 TargetP 预测天祝白牦牛 GDF-
10 基因编码产物亚细胞定位，结果显示，在线粒体
内存在的可能性为 6.3%，在细胞质中存在的可能性
为 72.2%，在其他细胞部位中可能有 7.2%。因此可
以推断，天祝白牦牛 GDF-10 主要在细胞质内发挥
生物学作用。
2.3.7 天祝白牦牛 GDF-10 二级结构预测与分析 天
祝白牦牛 GDF-10 的二级结构如图 8 所示，天祝白牦
牛 GDF-10 二 级 结 构 组 分 中 α-螺 旋（H） 占 39%>
30%，而 β-折叠（E）占 61%>20%，推测天祝白牦
牛 GDF-10 蛋白二级结构为 all-alpha-beta 型。
2.4 天祝白牦牛GDF-10氨基酸序列同源性及系统
发育分析
天祝白牦牛及普通牛、小鼠、大鼠、人、非洲
爪蟾等 6 个物种的 GDF-10 氨基酸序列进行同源性
分析，结果如表 3 所示，天祝白牦牛与普通牛 GDF-
10 氨基酸序列同源性最高为 99.4%，与小鼠、大鼠、
人的同源性分别为 82.5%、81.6%、85.3%，说明牦
牛与这些物种间氨基酸序列保守性较高 ；而与非洲
GDF-10≘ส䞨ᒿࡇ˖
GDF-10Ҽ㓗㔃ᶴ˖
C ：无规则卷曲，H ：α-螺旋，E ：β-折叠
图 8 天祝白牦牛 GDF-10 基因编码氨基酸序列二级结构预测
表 3 牦牛与 6 个物种 GDF-10 氨基酸序列间同源性比较（%）
物种 牦牛 普通牛 人 大鼠 小鼠 非洲爪蟾
牦牛 100
普通牛 99.4 100
人 85.3 86.0 100
大鼠 82.5 83.1 84.0 100
小鼠 81.6 82.3 83.8 95.2 100
非洲爪蟾 49.5 50.0 49.3 49.0 49.0 100
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第11期84
爪蟾的同源性为 49.5%，说明牦牛与其的氨基酸序
列保守性高。
从 GenBank 中获得除牦牛以外其他 6 个物种的
GDF-10 氨基酸序列，利用 DNAMAN 软件构建系统
发育树（图 9）。系统树总体分为两支，牦牛、普通牛、
人、大鼠和小鼠为一支，而非洲爪蟾为另一独立大
分支。其中，牦牛和普通牛的亲缘关系最近，与人
次之，与其他哺乳动物的亲缘关系依次变远，遗传
距离亦随之增加。
疏水性氨基酸在保持蛋白质三级结构的稳定中
起着重要作用，疏水性 / 亲水性的分析可以为蛋白
质高级结构的预测及功能分析提供理论参考［16］。试
验中通过对 GDF-10 蛋白的一级结构的生物信息学
分析没有发现明显的疏水性区域，也没有跨膜螺旋
区，这可能说明 GDF-10 蛋白是位于细胞内的蛋白，
其二级结构、结构域、三级结构等都有可能是不稳
定的。信号肽位于分泌蛋白的Ｎ端，一般由 15-30
个氨基酸组成［17］，其作用是将分泌蛋白质引导进入
内质网。含有信号肽的蛋白质一般能够分泌到细胞
外作为重要的细胞因子起作用，从而具有潜在的应
用价值，天祝白牦牛 GDF-10 蛋白分析发现有信号肽，
因此我们推测 GDF-10 蛋白主要在细胞质中发挥作
用。牦牛、普通牛、人、小鼠、大鼠、非洲爪蟾等
6 个物种 GDF-10 氨基酸序列同源性分析显示，物种
间的同源性在 49.5%-99.4% 之间，其中牦牛与普通
牛同源性为 99.4%，从系统发育树可以看出物种的
分化与同源性分析一致，天祝白牦牛和普通牛首先
聚在一起，再与人聚在一起，符合物种遗传距离远
近的现实情况。
4 结论
通过 DNA 混合池测序初步筛查出了天祝白牦
牛 GDF-10 基因 CDS 区的 8 个突变为点（90C → G、
124C → G、132T → C、822A → G、873G → T、
888T → C、1005G → A、1232G → C）。GDF-10 蛋
白没有明显的疏水性区域和跨膜螺旋区，存在信号
肽，二级结构是以 α-螺旋和 β-折叠为主 ；氨基酸序
列与普通牛的同源性为 99.4%。
参 考 文 献
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［3］ Cunningham NS, Jenkins NA, Gilbert DJ, Copeland NG. Growth
differentiation factor-10 ：a new member of the transforming growth
Yak ⢖⢋
Bos_taurus Პ䙊⢋
Human Ӫ
Rat བྷ啐
Mouse ሿ啐
Xenopus_lelevis 䶎⍢⡚㸮
0.05
图 9 六个物种 GDF-10 氨基酸系统发育树
3 讨论
试验所用的方法是 DNA 混合池测序法，即提取
某一共同特征群体的部分个体 DNA 并定量稀释成一
定浓度后，按比例或等量混合构成包含多个个体的
DNA 池。在相同试验条件下，PCR 产物混合样本池
的检测精度要优于基因组 DNA 样本混合池［9］。应
用 DNA 池直接测序检测突变位点，具有简单、快速、
准确的特点，理论上的 SNPs 检出率高达 100%［12］。
利用选择性 DNA 池筛查突变位点的应用研究已有报
道［13］，此外，也有应用 DNA 池结合基因分型技术
估算基因频率和结合测序技术开展生物信息学分析
的研究［14］。
通 过 DNA 混 合 池 测 序 得 到 天 祝 白 牦 牛 牦 牛
GDF-10 基因编码区 8 个突变位点，其中 90C → G、
124C → G、1005G → A、1232G → C 为 错 义 突 变，
导致编码氨基酸的改变，这有可能影响编码氨基酸
的结构和序列，使多肽链结构功能发生变换 ；虽其
他位点的突变是未导致氨基酸序列变化的同义突变，
但同义突变可能引起外显子的拼接增强，从而影响
mRNA 本身的翻译速度和寿命，进而可能改变蛋白
质的表达量，甚至可能改变蛋白质的空间结构，从
而影响其正常功能［15］。因此，推测天祝白牦牛的碱
基突变可能影响 GDF-10 基因所编码蛋白质在细胞
代谢中的生物学作用。
2013年第11期 85李天科等 ：天祝白牦牛 GDF-10 基因 CDS 区的多态性及生物信息学分析
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（责任编辑 李楠）