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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
转化生长因子 -β（TGF-β），是一种具有多种生
物学活性的多肽类细胞因子，由多种组织细胞合成，
调控细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转
移和凋亡，与肿瘤的发生、发展和转归密切相关［1 3］。
TGF-β 信号通路主要由 TGF-β 与其相应的受体和细
胞内信号转导分子组成。TGF-β 信号通路的胞内转
导分子主要由 Smads 蛋白构成。Smads 蛋白主要由
受体激活的 Smads（R-Smad）、通用型 Smads（Co-Smad）
和抑制型 Smads（I-Smad）构成。受体激活的 Smads
主 要 包 括 Smad2 和 Smad3， 通 用 型 Smads 只 包 括
收稿日期 ：2012-07-12
基金项目 ： 国家“973”计划项目 ( 2010CB912003)，高等学校博士学科点专项科研基金项目（20101107120015），北京市属高等学校人才强
教深化计划中青年骨干人才资助项目（PHR20110895），北京市优秀人才培养资助项目（2010D005018000010）
作者简介 ：梅竹，女，硕士研究生，研究方向 ：神经生物学 ；E-mail: paganinihermione@126.com
通讯作者 ： 杨予涛，博士，讲师，研究方向 ：神经生物学 ；E-mail: yutaoy@ccmu.edu.cn
徐志卿，博士，教授，研究方向 ：神经生物学 ；E-mail: zhiqingx@ccmu.edu.cn
GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化
梅竹  杨予涛  徐志卿
（首都医科大学基础医学院，北京 100069）
摘 要 ： 旨在原核表达 Smad4 基因，纯化获得 GST-Smad4 融合蛋白。以人表皮 HaCaT 细胞的 cDNA 为模板，利用 PCR 扩
增含有 BamH I 和 Sal I 酶切位点的 Smad4 基因 ；然后将其克隆到 pGEX-4T-1 原核表达载体中，将正确的重组载体转入大肠杆菌
BL21（DE3）；用 IPTG 诱导表达，再利用 MagneGST particles 亲和纯化 GST-Smad4 融合蛋白 ；最后通过 Western blot 鉴定此融合蛋
白。结果显示，成功构建 pGEX-4T-1-Smad4 原核表达载体 ；30℃条件下，0.2 mmol/L 的 IPTG 能诱导出大量的可溶性 GST-Smad4 蛋
白 ；经 MagneGST particles 纯化的 GST-Smad4 蛋白可被 Smad4 的抗体特异识别。纯化的 GST-Smad4 蛋白可用于后续的生物学研究。
关键词 ： Smad4 原核表达 蛋白纯化
Prokaryotic Expression and Purification of GST-Smad4 Protein
Mei Zhu Yang Yutao Xu Zhiqing
（School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069）
Abstract:  It was to express human Smad4 gene in prokaryotic cells and purify the GST-Smad4 fusion protein. The full-length Smad4 gene
was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1. The recombinant plasmid pGEX-4T-1-Smad4 was transformed
into E.coli BL21（DE3）and exogenous protein was induced by IPTG. After purification using MagneGST particles, the GST-Smad4 fusion
protein was further identified by Western blot. Results showed that the recombinant plasmid pGEX-4T-1-Smad4 was constructed successfully.
When BL21（DE3）cells transformed with pGEX-4T-1-Smad4 were cultured at 30℃ and induced with 0.2 mmol/L IPTG, GST-Smad4 protein
was obtained in a large quantity in supernatant. The purified GST-Smad4 was further identified specifically by Smad4 antibody. Therefore, it
proved that GST-Smad4 fusion protein was successfully expressed and purified, and could be used for further study of the function of Smad4.
Key words:  Smad4 Prokaryotic expression Protein purification
Smad4，抑制型 Smads 包括 Smad6 和 Smad7。
Smad4 基 因 共 有 11 个 外 显 子，10 个 内 含 子，
其转录子长 2 680 bp，编码由 552 个氨基酸组成的
蛋白质，主要由 MH1 结构域、MH2 结构域和连接
区所组成。MH1 结构域具有序列特异的 DNA 结合
能力，MH2 结构域是形成同 / 异源聚合物的结合位，
同时还具有转录激活和核定位功能［3］。Smad4 作为
一种抑癌基因，是 TGF-β 信号通路的重要调节因子，
广泛参与细胞分化、增殖、迁移和凋亡等多种生物
学过程［4］。
2013年第1期 135梅竹等 ：GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化
当细胞被 TGF-β 激活后，引起 R-Smads（Smad2
和 Smad3）的磷酸化，而磷酸化的 R-Smads 从受体
复合物上解离，迅速与 Smad4 形成异源复合物，然
后被转运进细胞后，与 Smad 结合元件（SBE）结合，
并在其它辅助因子的协同下，调节靶基因的表达［5］。
因此，在 TGF-β 信号通路中，Smad4 处于中枢地位。
鉴于 Smad4 在 TGF-β 信号通路中处于的关键地位，
本研究拟在体外表达并纯化 Smad4 蛋白，旨在分离
和鉴定与 Smad4 相互作用的蛋白，从而进一步丰富
TGF-β 信号通路的组成。
1 材料与方法
1.1 材料
pGEX-4T-1 质粒、大肠杆菌 DH5α、大肠杆菌
BL21（DE3）均为本实验室保存；高保真 Taq 聚合酶
购于 Roche 公司 ；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、
PCR 纯化试剂盒购于 MN 公司 ；反转录试剂盒购于
Invitrogen 公司 ；各种限制性内切酶购于 NEB 公司 ；
Smad4 抗 体 购 于 Milipore 公 司 ；MagneGST particles
购于 Promega 公司；异丙基 -β-D-硫代半乳糖（IPTG）、
考马斯亮蓝 R-250 购于北京普利莱公司 ；预染分
子量标准蛋白 marker 购于 Fermentas 公司 ；引物合
成与 DNA 测序由北京三博远志生物技术有限公司
进行。
1.2 方法
1.2.1 HaCaT 细胞总 RNA 的提取 将长满培养瓶
的 HaCaT 细 胞 用 PBS 洗 两 遍， 加 入 1 mL 的 Trizol
（Invitrogen），等细胞充分裂解后，将裂解液转移至无
RNase 的离心管中。加入 0.2 mL 的氯仿，震荡混匀，
室温放置 3 min。4℃，12 000×g 离心 10 min，将上
层水相转移至无 RNase 的离心管中。加入 0.5 mL 的
异丙醇，室温静置 20 min。4℃，12 000×g 离心 10
min，并用 75% 的乙醇洗涤 RNA 沉淀，等沉淀干燥
后，加入 50 μL 无 RNase 的水，用枪头洗打，使沉
淀充分溶解。利用紫外分光光度计测定总 RNA 的浓
度，用甲醛变性胶检测总 RNA 的质量。
1.2.2 HaCaT 细胞总 RNA 的反转录 在一个无 RN-
ase 的离心管中加入 5 μg 的总 RNA，1 μL 的 Oligo-
dT，并用无 RNase 的水调节体积到 12 μL。70℃水浴
变性 5 min 后，将离心管迅速放置在冰上。加入 4 μL
的 5×reaction buffer，1 μL 的 RNase inhibitor，2 μL
10 mmol/L dNTP 和 1 μL 的 SuperScript® III Reverse
Transcriptase，42℃水浴 60 min。加入 1 μL RNase H，
37℃温浴 10 min。将 RT 产物稀释到 200 μL，-20℃
保存。
1.2.3 质粒的构建 构建 pGEX-4T-1-Smad4 载体的
上 游 引 物 5-TACTCGGATCCATGGACAATATGTCTA
TTACG-3（下划线处为 BamH I 酶切位点），下游引
物 5-ATCACGTCGACCAGTCTAAAGGTTGTGGGTCT
-3（下划线处为 Sal I 酶切位点）。以 HaCaT 细胞的
cDNA 为模板，利用上述引物，进行 PCR 扩增。扩
增条件为 ：94℃预变性 2 min ； 94℃ 30 s，50℃ 30
s，72℃ 1 min 30 s ；30 个循环。将扩增到的 PCR 产
物和 pGEX-4T-1 载体分别用 Sal I 内切酶和 BamH I
内切酶进行双酶切，并将酶切后的 PCR 片段与剩
余载体片段用 T4 DNA 连接酶连接，转化大肠杆菌
DH5α，菌落 PCR 验证阳性克隆，并将阳性克隆送
往北京三博远志生物技术有限公司进行测序。
1.2.4 GST-Smad4 融 合 蛋 白 的 诱 导 表 达 将 构 建
成功的 pGEX-4T-1-Smad4 载体转化大肠杆菌 BL21
（DE3）表达菌中，37℃培养至 OD600=0.6 时，分别
加入 1 mol/L 的 IPTG，至终浓度分别为 0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0 mmol/L。30℃诱导 4-5 h，同时设未经 IPTG
诱导的菌液做对照。取 1 mL 诱导后的菌液，10 000
r/min 离心 2 min，收集菌体，然后加入 40 μL 的 1×
SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 min，然后 10 000 r/min
离心 2 min，取上清用于 SDS-PAGE 凝胶电泳和考马
斯亮蓝染色，检测 GST-Smad4 融合蛋白的表达情况。
1.2.5 GST-Smad4 融合蛋白的纯化 收集 1 mL 诱导
后的细菌，加入 200 μL 的裂解液，枪头混匀，室温
摇动 30 min。同时，在另一个离心管中加入 20 μL
的 MagneGST particles，利用磁架，将上清吸去，再
加入 250 μL Binding/Washing buffer，悬浮磁粉，利用
磁架，吸去上清，平衡磁粉。将平衡好的 MagneGST
particles 加 入 100 μL 的 Binding/Washing buffer， 再
加入 100 μL 的细菌裂解液，室温摇动 30 min。利用
磁 架， 吸 去 上 清， 加 入 250 μL 的 Binding/Washing
buffer 洗 涤 3 次， 吸 取 上 清。 用 30 μL 的 0.1 mol/L
谷胱甘肽洗脱融合蛋白，并在洗脱液中加入 8 μL 的
5×SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 min，10 000 r/min 离
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期136
心 2 min，利用 SDS-PAGE 凝胶电泳检测融合蛋白的
纯化效果。
1.2.6 GST-Smad4 融合蛋白的鉴定 将纯化后 GST-
Smad4 融合蛋白和 HaCaT 细胞总蛋白经 SDS-PAGE
凝胶电泳后，电转至 PVDF 膜上。用 5% 的脱脂牛
奶封闭 2 h，按 1∶1 000 的比例加入 Smad4 单克隆
抗体，孵育 3 h 后，洗去一抗，再加入辣根过氧化
物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗，孵育 40 min 后，洗去
二抗，再利用 ECL 显色发光试剂盒并结合胶片显影
观察试验结果。
2 结果
2.1 Smad4基因的PCR扩增
提 取 HaCaT 细 胞 总 RNA， 电 泳 检 测 RNA 完
整性良好，可用于反转录试验。以 HaCaT 细胞的
cDNA 为模板进行 PCR 扩增。扩增产物用 1% 的琼
脂糖凝胶电泳检测，观察到 1 700 bp 左右的扩增产
物，与 Smad4 基因的预期大小一致（图 1）。
M ：DNA marker III ；1 ：Smad4 基因 PCR 扩增产物 ；2 ：对照
图 1 Smad4 基因的 PCR 扩增结果
2.2 pGEX-4T-1-Smad4原核表达载体的构建
将扩增的 Smad4 基因片段和 pGEX-4T-1 载体分
别用 Sal I 内切酶和 BamH I 内切酶进行双酶切，电
泳并回收酶切后的 Smad4 基因片段和 pGEX-4T-1 载
体的大片段，通过 T4 DNA 连接酶将 Smad4 基因定
向插入到 pGEX-4T-1 载体的多克隆位点中。将菌落
PCR 鉴定为阳性的 2 个重组子再进行酶切鉴定，2
个重组子经酶切鉴定后均得到两条目的带，大约为
1 700 bp 和 4 900 bp（图 2），初步证明重组载体构建
正确。将 2 个重组子进行测序。经过与 GenBank 的
序列对比后，证明 Smad4 基因已经成功插入 pGEX-
4T-1 载体，pGEX-4T-1-Smad4 构建成功。
M ：DNA marker III ；1 ：重组子 1 的酶切结果 ；2 ：重组子 2 的酶切结果
图 2 重组质粒 pGEX-4T-1-Smad4 的鉴定
2.3 GST-Smad4融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
将 重 组 载 体 pGEX-4T-1-Smad4 转 化 大 肠 杆 菌
BL21（DE3），收集细菌进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，
并用考马斯亮蓝染色。试验结果（图 3）显示，5 个
GST-Smad4 诱导组在 80 kD 处均出现明显条带，与
预期结果相符，而未诱导的 GST-Smad4 表达菌在相
应位置无蛋白条带出现，说明融合基因在大肠杆菌
中得到有效的表达。但是，随着 IPTG 浓度的增高，
融合蛋白的表达量并未增强。同时，将 0.2 mmol/L
的 IPTG 诱导下的 GST-Smad4 表达菌裂解，收集上
清和沉淀，再利用 SDS-PAGE 凝胶电泳检测其可溶
性。从图 4 中可以看出，GST-Smad4 的融合蛋白主
要在上清中表达，说明在 30℃培养下，0.2 mmol/L
IPTG 诱导的 GST-Smad4 融合蛋白主要以可溶性的形
式存在。
2.4 GST-Smad4融合蛋白的纯化
将 0.2 mmol/L IPTG 诱 导 的 GST-Smad4 表 达 菌
M ：Protein weight marker S1181 ；1 ：未诱导对照 ；2-6 ：分别为 0.2，0.4，0.6，
0.8，1.0 mmol/L IPTG 诱导的产物
图 3 不同浓度 IPTG 诱导下 GST-Smad4 融合
蛋白的表达分析
4500
2000
1200
500
1659
bpbp
M 1 2
bpbp
M 1 2
4500
2000
1200
500
1659
4900
M 1 2 3 4 5 6
250
kD
95
72
55
36
28
2013年第1期 137梅竹等 ：GST-Smad4 融合蛋白的表达与纯化
在 -80℃放置 1 h，将其融化，加入裂解液，超声破
碎后，收集上清，加入 MagneGST particles，通过结合、
洗涤等步骤后，用 0.1 mmol/L 的谷胱甘肽洗脱 GST-
Smad4 融合蛋白，并将纯化的 GST-Smad4 融合蛋白
进行 SDS-PAGE 电泳，然后考马斯亮蓝染色。如图
5 所示，GST-Smad4 融合蛋白得到较好的纯化，纯
度较高。
M ：Protein weight marker S1181 ；1 沉淀总蛋白 ；2 ：上清总蛋白
图 4 0.2 mmol/L IPTG 诱导下 GST-Smad4 融合
蛋白在上清和沉淀中的对比
M ：Protein weight marker S1181 ；1 ：纯化后的 GST-Smad4 融合蛋白
图 5 GST-Smad4 融合蛋白的纯化
2.5 GST-Smad4融合蛋白的鉴定
分别将 HaCaT 细胞总蛋白和纯化的 GST-Smad4
融合蛋白进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，再将其转移到
PVDF 膜上，通过 Western blot，检测融合蛋白能否
被 Smad4 抗 体 特 异 识 别。 由 于 GST-Smad4 蛋 白 比
Smad4 蛋白多了一个 GST 标签（约 20 kD），其分子
量预计在 80 kd 左右。如图 6 所示，GST-Smad4 融
合蛋白的条带出现在预期位置，说明 Smad4 的特异
性抗体可以识别 GST-Smad4 融合蛋白，暗示 GST-
Smad4 融合蛋白可用于后续的研究。
1 ：HaCaT 细胞总蛋白 ； 2 ：纯化后的 GST-Smad4 融合蛋白
图 6 GST-Smad4 融合蛋白的鉴定
3 讨论
Smad4 是 Smads 基因家族的成员，最早被称为
DCP4，位于人类染色体 18q21.1 上［6］。Smad4 作为
一种抑癌基因，主要通过与其它 Smads 蛋白的相互
作用而参与 TGF-β 的信号转导。如果 Smad4 发生
缺失或突变，则 TGF-β 信号转导网络就会被破坏，
TGF-β 信号途径在肿瘤发展中的抑制效应就会失［7］。
Smad4 除了参与肿瘤的发生和发展外，还具有
其它的生物学功能。研究发现，乙肝病毒编码的癌
蛋白 pX 通过促进 Smads 蛋白的核转运和稳定 Smad4
蛋白的复合体而增强 TGF-β 信号通路，从而参与肝
脏的纤维化［8］。同时，Smad4 还参与睾丸、小脑、
心瓣膜和早期胚胎的发育过程［9-12］。 因此，Smad4
在生命过程中起到十分重要的调节作用。
鉴于 Smad4 在 TGF-β 信号途径中的中枢地位，
发现和鉴定 Smad4 的共调节因子具有重要的意义。
目前，已经发现了几个 Smad4 的共调节因子，如
Bcl6，v-ErbA。Bcl6 主要通过直接与 Smad4 的相互
作用来抑制 Smad4 的转录活性，从而使 B 淋巴瘤细
胞产生 TGF-β 抗性［13］。v-ErbA 通过与 Smad4 相互
作用而干扰 Smad4 复合体向细胞核的转移，从而抑
制了 TGF-β 信号通路的正常功能，进而使 HD3B 红
白血病细胞产生 TGF-β 抗性［14］。因此，进一步的鉴
定和发现 Smad4 的共调节因子对完善复杂的 TGF-β
信号网络具有重要的意义。
Biacore 是一种基于表面等离子共振（SPR）的
新型技术，利用该技术可以实时跟踪生物分子间的
相互作用，分离与目的蛋白相互作用的蛋白，我们
实验室拟利用这种技术分离与 Smad4 相互作用的蛋
白。在 Biacore 试验中，获得 Smad4 蛋白是试验顺
利进行的关键。为此，将 Smad4 基因克隆到原核表
达载体 pGEX-4T-1 载体，通过 IPTG 诱导，得到带
M 1 2
250
kD
95
72
55
36
28
M 1
250
kD
95
72
55
36
28
1 2
80
kD
60
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期138
有 GST 标签的 Smad4 融合蛋白，再通过亲和层析纯
化，得到了 GST-Smad4 融合蛋白，本研究为 Biacore
试验奠定了基础。
以往的研究发现，IPTG 的浓度对外源蛋白的表
达有着重要的影响，但是过高浓度的 IPTG 往往对
细胞产生毒性，同时也影响蛋白的表达量和蛋白表
达的形式。本试验探索了不同浓度的 IPTG 对 GST-
Smad4 融合蛋白表达的影响。研究发现，随着 IPTG
浓度的增加，GST-Smad4 融合蛋白表达几乎没有变
化。因此，选择 0.2 mmol/L 为 IPTG 诱导的浓度。同
时， 分 别 检 测 了 在 0.2 mmol/L IPTG 诱 导 下，GST-
Smad4 融合蛋白在 BL2（DE3）表达菌裂解液的上清
和沉淀的分布发现，低浓度的 IPTG 诱导下，GST-
Smad4 融合蛋白主要以可溶性的形式存在，主要分
布在上清，而在沉淀中的分布很低。
4 结论
本研究成功构建了 pGEX-4T-1-Smad4 原核表达
载体，摸索了 GST-Smad4 融合蛋白诱导表达的适宜
条件，并获得了具有 Smad4 免疫活性的 GST-Smad4
融合蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）