全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
收稿日期 ：2012-11-08
基金项目 ：云南 2007 年度产业化重大关键技术开发项目［ 云发改高科（2007）1718 号］，中南林业科技大学校级学科重点建设项目（066）
作者简介 ：郭川，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：102852239@qq.com
通讯作者 ：曹福祥，男，教授，博士生导师，研究方向 ：植物学和生物化学与分子生物学 ；E-mail ：csfucao@163.com
生物碱（alkaloid）是存在于自然界中的一类含
氮的碱性有机化合物，多数具有复杂的含氮杂环，
有光学特异性和显著的生理效应［1］。生物碱按其结
构分类，可分为吡啶衍生物类、吡咯啶衍生物类、
吲哚衍生物类和嘌呤衍生物类等 16 个大类［2］。目
前已分离出的生物碱约有 1 万多种。而且不断有新
的生物碱被发现［3］。同时许多生物碱具有显著的药
用作用，集中在调控心血管系统、抗肿瘤作用、降
云南萝芙木 pnae 基因全长克隆及其序列分析
郭川  曹福祥  刘继科  冯延芝  李猛
（中南林业科技大学生命科学与技术学院，长沙 410004）
摘 要 ： 根据已知的其他物种 PNAE 酶 cDNA 序列设计引物，采用 RT-PCR 技术从云南萝芙木叶片中扩增获得 pnae 基因部
分 cDNA 序列即 PNAE 酶基因中间大片段，再用 RACE 技术获得其两端序列。序列拼接得到完整的 1 004 bp 的 PNAE 酶基因，根
据获得的序列，分析得到 795 bp 的开放阅读框，编码 264 个氨基酸。序列分析显示，云南萝芙木中 PNAE 酶氨基酸序列与蛇根木
中的该酶氨基酸序列同源性高达 90%，但和其他植物物种中的 PNAE 酶氨基酸序列，以及其他物种间的 PNAE 酶氨基酸序列同源
性都不高，在 40%-60% 之间，表明不同物种中 PNAE 酶氨基酸序列不具有全序列的高度同源性。进一步序列分析发现，在各植物
的 PNAE 酶氨基酸序列中都存在两个高度保守的氨基酸区域，表明不同物种中 PNAE 酶存在共同的高度保守区段。
关键词 ： 云南萝芙木 PNAE 酶基因 RT-PCR RACE 序列分析
Cloning and Analysis of the Polyneuridine Aldehyde Esterase in
Rauvolfia yunnanensis
Guo Chuan Cao Fuxiang Liu Jike Feng Yanzhi Li Meng
（Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract:  According to some identified cDNA sequence of the polyneuridine aldehyde esterase（PNAE） gene in plant species on the
NCBI，pairs of primers were designed，and the partial intermediate sequence of the PNAE cDNA was obtained using RT-PCR technique in
Rauvolfia yunnanensis’ fresh leaves，and then by the technique called rapid-amplification of cDNA ends（ RACE），the sequence in both
two flanks of the known sequence was acquired. The full length sequence of the cDNA of PNAE in Rauvolfia yunnanensis was 1 004 bp and
that included an open reading frame（ORF）which encoded 264 amino acids. Sequence analysis showed that for PNAE gene the homologies of
amino acid sequence among each species was a little low ranging from 40% to 60%，demonstrating PNAE gene wasn’t a gene that its complete
sequence is relatively conservative. The further analysis of all the known PNAE in plant species found that there are two conservative domains in
amino acid sequence，revealing that PNAE gene has two highly conserved domains among different plant species.
Key words:  Rauvolfia yunnanensis PNAE gene RT-PCR RACE Sequence analysis
血糖作用、抗炎作用等［2，4］。其中阿吗灵和利血平
都具有较好的药用价值 .
1995 年 Stockigt 等［5，6］利用他们自己团队在蛇
根木的细胞悬浮培养体系上所取得的突破性进展，
获得了大量研究材料，首次对阿吗灵代谢步骤进行
了详细的说明。目前作为少数几个已被较详细描述
了的生物碱代谢途径之一，阿吗灵代谢包含超过 10
个不同的步骤，而 PNAE 酶恰恰处在该酶系系列的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期76
中间部分，是催化 polyneuridine aldehyde（PNA）转
化为 epi-vellosimine 的关键步骤，PNAE 的反应速率
对阿吗灵的合成代谢起到了一个关键的调控作用。
2000 年，Dogru 等［7］首次在蛇根木中获得了 PANE
基因 cDNA 全长序列，并进行了原核表达验证，同
时氨基酸比对发现其氨基酸序列中存在 a/b 水解酶
超家族的保守氨基酸序列，两年后其团队又利用定
点突变技术证明了该氨基酸保守序列是该酶的活性
中心［8］。迄今为止，除蛇根木外，已在多种高等植物，
如玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、
粳稻（Oryza sativa japonica）和葡萄（Vitis vinifera）等，
以及多到几十种的微生物中克隆到了 PNAE 的 cDNA
全长。但有关云南萝芙木中 PNAE 基因的研究尚未
见报道。本研究旨在帮助人们进一步了解吲哚生物
碱阿吗灵合成代谢的调控原理，也为云南萝芙木
（Rauvolfia yunnanensis Tsiang）——我国云南地区的
这一丰富植物资源的开发和利用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
取云南萝芙木种子，在智能型育种温室播种，
在成株后取新鲜叶片进行总 RNA 提取。药品与试剂：
RNA 提取试剂盒购自康为世纪公司 ；反转录试剂盒
购自 Fermentas 公司 ；RACE 试剂盒和相应的高保证
PCR 扩增试剂盒购自 Clontech 公司 ；胶回收试剂盒、
Taq 聚合酶、DNA Marker 及其他试剂均购自康为世
纪有限公司。
1.2 方法
1.2.1 云南萝芙木叶片总 RNA 提取及纯化 云南
萝芙木叶片总 RNA 提取，按照康为世纪公司植物
RNA 提取试剂盒说明书进行，对比发现冰上操作能
获得更高质量的 RNA。电泳检测结果显示存在微量
DNA 污染，但考虑到后续试验对微量 DNA 的敏感性，
需要进行 DNA 消化。经对比多种 DNA 消化方式后，
采用 Promega 公司的 RQ1 RNase-Free DNase 在 RNA
提取过程中消化 DNA，即用下列步骤代替 RNA 提
取中的第六步 ：
（1） 向 吸 附 柱 中 加 入 350 μL Buffer RW1，
10 000 r/min 离心 15 s，弃废液，将吸附柱重新放
回收集管中。（2）向吸附柱中直接加入 20 mL RQ1
DNase 10× Reaction Buffer 和 10 mL RQ1 RNase-Free
DNase，室温孵育 10-15 min。（3）向吸附柱中加入
350 μL Buffer RW1，10 000 r/min 离心 15 s，弃废液，
将吸附柱重新放回收集管中。
1.2.2 云南萝芙木叶片 PNAE 中间保守区的克隆
cDNA 的合成采用 Fermentas 公司的 RevertAidTM First
StrandcDNA Synthesis 反转录试剂盒进行，操作按照
说明说进行，注意冰上缓慢操作。RT-PCR 扩增（康
为世纪 2×Taq MasterMix），其体系为 50 μL ：25 μL
2×Taq MasterMix，20 mmol/L 上下游引物各 2.0 μL，
以稀释 10 倍后的 2.0 μL 反转录产物为模板，加双蒸
水至 50 μL。PCR 扩增程序为 ：94℃预变性 2 min，
94℃变性 30 s，52℃退火 30 s（经过 46、48、50、
52、54 和 56℃ 6 组温度梯度 PCR 后确定 52℃为最
适退火温度），72℃延伸 30 s，30 个循环 ；72℃终延
伸 2 min，4℃保存。反应结束，经电泳检测，确认
PCR 产物，凝胶成像仪拍照。
1.2.3 3RACE 和 5RACE 采用 Clontech 公司的 SM-
ARTerTM RACE cDNA Amplification Kit 进行，按照试
剂盒操作说明严格进行试验操作。
3RACE 反应体系为 50 μL ：34.5 μL PCR-Grade
Water，5.0 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，1.0 μL
dNTP Mix（10 mmol/L），1.0 μL 50×Advantage 2 Poly-
merase Mix，2.5 μL 3-RACE-Ready cDNA，5.0 μL
10×UPM，1.0 μL 3GSP1（20 mmol/L）。
PCR 扩 增 程 序 为 ：94 ℃ 变 性 45 s，72 ℃ 延 伸
2 min，5 个循环。94℃ 变性 45 s，70℃退火 45 s，
72℃ 延伸 2 min，5 个循环 ；94℃ 变性 45 s，68℃退
火 45 s，72℃ 延伸 2 min，25 个循环。4℃保存。反
应结束，经电泳检测，确认 PCR 产物，凝胶成像仪
拍照。
5RACE 反应体系为 50 μL ：34.5 μL PCR-Grade
Water，5.0 μL 10×Advantage 2 PCR Buffer，1.0 μL
dNTP Mix（10 mmol/L），1.0 μL 50×Advantage 2 Poly-
merase Mix，2.5 μL 5-RACE-Ready cDNA，5.0 μL
10×UPM，1.0 μL 5GSP2（20 mmol/L）。
PCR 扩增程序同 3RACE，反应结束，经电泳
检测，确认 PCR 产物，凝胶成像仪拍照。
1.2.4 PCR 产物胶回收及 TA 克隆 PCR 产物经 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测后，紫外灯下切胶后，利用
2013年第4期 77郭川等 ：云南萝芙木 pnae 基因全长克隆及其序列分析
康为世界公司的普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回
收目的片段，严格按操作说明书进行。回收目的片
段经琼脂糖凝胶电泳检测后，连接 T 载体，转化大
肠杆菌 DH5α 随机挑取 5 个阳性转化子做菌落 PCR
鉴定，测序由铂尚生物技术有限公司完成。
1.2.5 序列分析 用 Vector NTI Advance 10 进行序列
拼接和开放阅读框（Open Reading frame ORF）寻找，
拼接后的序列进行 BLAST 相似性比较，用 VectorNTI
Advance 10 进行序列比对分析。
2 结果
2.1 云南萝芙木叶片总RNA提取及纯化检测
经添加 DNA 消化步骤改良后提取的云南萝芙木
叶片总 RNA，经核酸蛋白测定仪测定、分析，所提
取总 RNA 的 OD260/OD280=1.94，OD260/OD230=2.19，说
明 RNA 样品中，已没有蛋白质、酚类，DNA 及其
他小分子物质的污染，纯度较高。取 5 μL 经 RNA-
free 的琼脂糖电泳检测显示结果，如图 1 显示 28S、
18S 的带型边缘清楚条带整齐，且 28S rRNA 的亮度
大约是 18S rRNA 的 2 倍。说明分离得到的总 RNA
较完整，没有发生降解。可以满足后续 RT-PCR、
RACE 试验要求。
图 1 云南萝芙木叶片总 RNA 电泳检测图
28S
18S
1200
bp
M 1 2 3 4 5 6
900
700
500
300
100
图 2 萝芙木 pnae 基因 cDNA 保守区 PCR 产物
M ：marker ；1-6 ：保守区 PCR 产物
2.3 云南萝芙木叶片pnae基因cDNA序列末端的
扩增
根据获得的中间片段，设计 3RACE PCR 扩增
特异性上游引物 3GSP1 ：5-TTACGGGACTACTCCG-
AGCCCTTGATGG-3、3GSP2 ：5-TGCCTGACCCTA-
ACCATCCACTAACT-3，5-RACE PCR 扩 增 特 异 性
下 游 引 物 5GSP1 ：5-ATCAAGGGCTCGGAGTAGTC-
CCGTAATG-3、5GSP2 ：5-TTATCCGCTCCCACAGC-
CTCAACAAACC-3，3RACE 的下游引物和5RACE 的
上 游 引 物 UPM ：Long ：5-CTAATACGACTCACTAT-
AGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，Short：
5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3， 由 试 剂 盒 提
供，分别得到长约 750 bp、800 bp 的两条特异性
条 带（ 图 3， 图 4）， 经 测 序， 长 度 分 别 为 736 bp
和 808 bp。采用 Vector NTI Advance 10 序列拼接功
能，得到 1 004 bp 的云南萝芙木叶片 pnae 基因全长
cDNA 序列。
2.4 云南萝芙木cDNA全长序列中ORF的预测
根据获得的 pnae 基因全长 cDNA 核苷酸序列，
2.2 云南萝芙木叶片PNAE基因中间部分同源片段
的克隆
根据 NCBI 网站上获得的 PNAE 酶相关同源基
因数据，选取了蛇根木的 PNAE 全长 cDNA 序列为
模板，根据高度保守序列设计引物 F2 ：5-GCAAA-
CGCCAAGCAACAA-3、R2 ：5-TGCGAAAGCATTC-
CCATA-3，以萝芙木反转录产物为模板进行 RT-
PCR，电泳检测获得 700 bp 左右的特异性扩增条带
（图 2），经测序，片段长 745 bp。
1200
bp
M 1 2 3 4
900
700
500
300
100
图 3 云南萝芙木 pnae 基因 3RACE 的 PCR 扩增产物
M ：marker ；1，3 ：引物 3GSP1 ；2，4 ：引物 3GSP2
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期78
登录 NCBI 使用 ORF Finder，将核苷酸序列翻译成
氨基酸序列（图 5），结果表明，ORF 片段大小为
795 bp，编码 264 个氨基酸残基的多肽，推测的蛋
白分子量约为 29.5 kD，pI 为 5.31。利用 NCBI 中的
BLAST 软件和 DNAMAN 软件，对该片段与已知的 7
个植物 PNAE 基因进行序列分析显示，云南萝芙木
与其他 7 个植物物种的已知 pnae 基因的 cDNA 序列
具有 65%-70% 左右的同源性，特别与蛇根木的同
源性高达 90%，氨基酸的同源性则更高（图 6），推
测该获得的序列为云南萝芙木中的 PNAE 基因 cDNA
序列。
3 讨论
PNAE 是生物碱——阿吗灵合成代谢途径中的
一种关键酶，是 a/b 水解酶超家族中的一员 . 该家
族还包括稻米中的防御相关基因 Pir7b 等。水解酶
一般存在一个由 4 个疏水氨基酸和一个甘氨酸包围
一个组氨酸所组成的严格保守区域，这个疏水氨基
酸 - 疏水氨基酸 - 疏水氨基酸 - 疏水氨基酸 -His-
Gly 组成的高度保守区域，在该试验获得云南萝芙
木 PNAE 序列中与 FVLVHG 序列相对应，又根据云
南萝芙木与其他植物 PNAE 基因的氨基酸对比发现，
PNAE 中 FVLVH 相当保守，且大多数的 PNAE 的后
6 位氨基酸是完全相同的 ；根据蛇根木中的 PNAE
研究发现，其 PNAE 存在 a/b 水解酶超家族的活性
中心所具有的的保守区段 pho-pho-pho-Sm-X-Nu-X-
Sm-Sm （Sm = 小分子氨基酸，Nu = 亲核中心，pho=
疏水氨基酸），对应云南萝芙木 pnae 基因 mRNA 序
列 中 的 Val-Leu-Leu-Gly-His-Ser-Phe-Gly-Gly，（ 小 分
子氨基酸所包围的 Ser 能形成一个弯管，而这个空间
结构就是 a/b 水解酶超家族亲核中心的典型特征），
根据氨基酸序列对比发现该氨基酸序列在 7 种植物
中均高度保守，除 Ser 后的一个氨基酸存在一定的
突变外，其他的氨基酸均完全相同，据上分析可以
推断上述两个序列均为 PANE 的保守区域，后一个
氨基酸保守序列（Val-Leu-Leu-Gly-His-Ser-Phe-Gly-
Gly）为 PNAE 的催化中心，总的来说就目前了解，
PNAE 氨基酸序列 N 末端较保守，C 末端保守性较低，
存在两个 N 末端的保守氨基酸序列。
在 RACE（末端 cDNA 扩增）试验方面，本试
验采用了 Clontech 公司的新 SMARTerTM RACE cDNA
Amplification Kit，与旧版本不同，该方案在反转录
合成第一链 cDNA 时，为末端完整的 5RACE 第一
链 cDNA 添加了一段接头序列，从而既能够保证
所得片段的完整性，又能够在 5RACE PCR 时使用
试剂盒内配套的 long 引物（该引物与接头序列互
图 4 云南萝芙木 pnae 基因 5RACE 的 PCR 扩增产物
M ：marker ；1，3 ：5GSP1 引物 ；2，4 ：5GSP2 引物
1200
bp
M 1 2 3 4
900
700
500
300
100
938
893
848
803
758
713
668
623
578
533
488
443
398
353
308
263
218
173
图 5 萝芙木 pnae 基因 ORF 及其编码的氨基酸序列
* 为终止密码子
2013年第4期 79郭川等 ：云南萝芙木 pnae 基因全长克隆及其序列分析
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
Ӂই㩍㣉ᵘབྷ䉶ᤏই㣕⦹㊣に㊣㤌㬯㪑㨴㳷ṩᵘ
Consensus
59
57
144
159
57
54
57
59
99
97
184
199
97
94
97
99
139
137
223
238
136
134
137
139
178
172
263
278
175
169
176
178
218
212
301
316
215
209
216
218
257
251
340
355
254
248
256
257
264
260
348
387
263
258
265
264
19
18
104
119
17
14
17
19
v l v h g
V L V H GF
v w k
y
p k f a
d l
dyr
q
l
d h s h
p l e
E K V - - - G H S - G G
k v g h s g g a e
l g d g
图 6 云南萝芙木与其他植物 pnae 基因的氨基酸比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期80
补，且 Tm 值很高）使退火温度能够高达 72℃，有
效地避免了低退火温度时常发生的弥散和扩增条带
过多的情况。在试验过程中发现，由于使用了一条
与基因特异性无关的接头引物，虽然很好地避免了
RACE 试验中容易产生的弥散或扩增出过多片段的
情况，但同时也增加了出现无目的条带和扩增出非
目的条带的机会，并且因为自行设计的另一条基因
特异引物也需要同样高的退火温度（>70℃），从而
使该基因特异引物的设计成为一个难点。对于解决
该问题，本试验认为 RACE 实验前获取的中间片段
序列的准确性和长度是关键，较好的中间片段序列
能帮助试验者在这一步准确设计出高 Tm 值的基因
特异引物，同时在测序方面，采用 PCR 后直接测序
和 TA 克隆后测序相结合的方法，以期增加测序所
得序列的可靠性。
4 结论
试从云南萝芙木新鲜叶片中分离得到了 PNAE
基因的全长 cDNA 序列，其序列全长 1 004 bp，其
中开放阅读框长 795 bp，编码 264 个氨基酸，推测
的蛋白分子量约为 29.5 kD，pI 为 5.31，序列分析表
明它与蛇根木的同源性相当高，推测这两种植物的
亲缘性关系很近。
参 考 文 献
［1］ 南京大学化学系有机化学教研室 . 有机化学（下册） ［M］. 北
京 ：高等教育出版社 , 1988.
［2］ 杨秀伟 . 生物碱（ 实用天然产物手册丛书） ［M］. 北京 ：化学
工业出版社 , 2005.
［3］ 唐传核 . 植物生物活性物质［M］. 北京 ：化学工业出版社 ,
2005.
［4］ 吴立军 . 天然药化学［M］. 第 4 版 . 北京 ：人民卫生出版社 ,
2003.
［5］ Stöckigt J . Biosynthesis in Rauwolfia serpentina, modern aspects
of an old medicinal plant［J］. The Alkaloids ：Chemistry and
Pharmacology, 1995, 47 ：115-172.
［6］ Stockigt J. Alkaloid metabolism in plant cell culture［M］//. In
Natural Product Analysis （Schreier P, Herderich M, Humpf HM.,
eds）, Vieweg, Braunschweig, Wiesbaden, Germany, 1998 ：313-
325.
［7］ Dogru E, Warzecha H, Seibel F, et al. The gene encoding
polyneuridine aldehyde esterase of monoterpenoid indole alkaloid
biosynthesis in plants is an ortholog of the a/b hydrolase super
family［J］. Eur J Biochem, 2000, 267（5）：1397-1406.
［8］ Mattern-Dogru E, Ma X, Hartmann J, et al. Potential active-site
residues in polyneuridine aldehyde esterase, a central enzyme
of indole alkaloid biosynthesis, by modeling and site-directed
mutagenesis［J］. Eur J Biochem, 2002, 269（12）：2889-2896.
（责任编辑 狄艳红）