全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-08-08
基金项目 : 西藏自治区重点科研项目计划资助项目（20092-1）
作者简介 : 柴志欣 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 基因组与生物信息学 ; E-mail:chaizhixin2525@163.com
通讯作者 : 钟金城 , 男 , 教授 , 研究方向 : 动物遗传学 ; E-mail:zhongjincheng518@126.com
西藏牦牛 ADD1 基因第 2 外显子的 PCR-SSCP
检测及序列分析
柴志欣1 罗晓林3 赵尚娟1 姬秋梅2 张成福2 信金伟2 钟金城1
（1西南民族大学 动物遗传育种学国家民委 - 教育部重点实验室，成都 610041 ；
2西藏自治区农业科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850000 ；3四川省草原科学研究院，成都 611730）
摘 要： 利用 PCR-SSCP 和 DNA 测序方法对帕里牦牛、工布江达牦牛、类乌齐牦牛、康布牦牛、桑日牦牛、巴青牦牛、江达牦牛、
斯布牦牛、嘉黎牦牛、桑桑牦牛、丁青牦牛等西藏 11 个牦牛类群共 483 头牦牛的 ADD1 基因（被认为是极可能影响肉质的候选基
因）第 2 外显子序列进行遗传多态性分析。结果表明，66 bp 处碱基 T 缺失和 256 bp 处 A → G 突变，共有 AA、AB、BB 3 种基因型；
其中帕里牦牛只有 AA 基因型，江达牦牛只有 AB 基因型，康布牦牛、嘉黎牦牛、巴青牦牛、桑日牦牛、斯布牦牛均缺少 BB 基因型，
丁青牦牛、类乌齐牦牛缺少 AB 型，均存在严重偏态 ；桑桑牦牛、工布江达牦牛中存在 AA、AB、BB 3 种基因型。除江达牦牛外，
其它 10 个牦牛类群中 AA 为优势基因型，A 基因为优势等位基因，分布较高。除帕里牦牛、巴青牦牛外，其它 9 个牦牛类群均处
于中度多态（0.25 ＜ PIC ＜ 0.50），遗传变异较大。
关键词： 西藏牦牛 ADD1 基因 PCR-SSCP
PCR-SSCP Detection and Sequence Analysis on Exon2 of
ADD1 Gene in Tibetan Yak
Chai Zhixin1 Luo Xiaolin3 Zhao Shangjuan1 Ji Qiumei2 Zhang Chengfu2 Xin Jinwei2 Zhong Jincheng1
（1Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding，Southwest University for Nationalities，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of
Education，Chengdu 610041 ；2Institute of Animal Science and Veterinary , Academy of Agricultural sciences，Tibet Autonomous Region，
Lhasa 850000 ；3Academy of Grassland Science，Chengdu 611730）
Abstract: ADD1 gene is an important gene which involved in the affect of animal fleshy. In this research, PCR-SSCP and DNA
sequencing were used to analysis the polymorphism of ADD1 gene part exon2 in 483 Yak which comes from Pali Yak, Gongbujiangda Yak,
Leiwuuqi Yak, Kangbu Yak, Sangri Yak, Baqing Yak, Jiangda Yak, Sibu Yak, Jiali Yak, Sangsang Yak, Dingqing Yak. Two single polymorphism
sites were discovered in exon2 that is 66 bp T deletion and 256 bp A/G, and three genotype were founded which is AA, AB, BB. Pali Yak only
have AA. Jiangda Yak only have AB, there was the predominated genotype. BB genotype was not detected in Kangbu Yak, Jiali Yak, Sangri Yak,
Baqing Yak, Sibu Yak. AB genotype was not detected in Dingqing Yak and Leiwuqi Yak. AA, AB, BB genotypes present in Sangsang Yak and
Dongbujiangda Yak. AA was the predominated genotype and the allele A was the dominance allele, which was distribution higher. In addition
to Pali Yay and Baqing Yak, other nine groups of the polymorphism information contents were moderate polymorphisms （0.25 ＜ PIC ＜ 0.5）.
Genetic variation are larger.
Key words: Tibetan Yak ADD1 基因 PCR-SSCP
牦牛（Bos grunniens）是分布在海拔 3 000 m 以
上的青藏高原及其毗邻高寒地区的稀有牛种，具有
独特的生物学特性和经济特性，耐粗、耐寒且有一
整套独特的体质体态结构和生理适应机制。因其生
2012年第1期 125柴志欣等 ：西藏牦牛 ADD1 基因第 2 外显子的 PCR-SSCP 检测及序列分析
活在环境污染少、未施过化肥和农药的天然牧场，
且在饲养过程中未添加任何添加剂和饲料，故其畜
产品为名符其实的“绿色食品”。牦牛肉作为牦牛的
主要产品之一，具有蛋白质含量高，脂肪含量低等
特点。近年来，牦牛的选育大多集中在对其生长速度、
产乳量以及产肉量方面的选育提高，对其肉质的选
育研究相对不够深入。
1993 年 Briggs 等［1］利用 DNA 亲和层析、离子
交换层析和凝胶过滤等方法，从人类宫颈癌细胞核
中提取的一组能和固醇调节元件蛋白 1 结合的蛋白
并命名为固醇调节元件结合蛋白（Sterol regulatory
element binding protein，SREBPs），该结合蛋白中的
3 个 组 分 SREBP-1a，SREBP-1b，SREBP-1c， 因 剪
切方式、结构不同而功能相同得名 ；其中 SREBP-
1c 又 称 脂 肪 细 胞 定 向 和 分 化 因 子 1（adopocyte
determination and differentiation on factor-1，ADD1），
是脂肪细胞分化过程中一种重要的核转录调控因子，
在脂质合成和葡萄糖代谢过程中起主要作用［2, 3］。
相关研究显示，ADD1 基因在体内外的表达水平与
脂肪细胞的分化及肝脏等非脂肪组织中脂肪的沉积
有着直接的连锁关系。同时在脂肪组织的形成过程
中肥胖基因（ob）起重要作用，该基因的表达产物
是瘦蛋白，ADD1 基因与瘦蛋白呈负调控作用［4］。
脂质性状是动物生长发育和肉质的主要参评指标之
一，肌肉中脂肪的多少对肉质会产生很大的影响，
ADD1 基因被认为是极可能影响肉质的候选基因。
猪 ADD1 基因的第 2 外显子在第 90 和 99 位氨
基酸密码子的第 3 位碱基中出现多态［5］，但是应
用 PCR-SSCP（polymerase chain reaction-single-strand
composition polymorphism）方法对牦牛 ADD1 基因序
列突变研究尚属空白，鉴于 ADD1 基因在脂肪细胞
分化过程中具有重要的调控作用。本研究利用 PCR-
SSCP 技术对西藏 11 个牦牛类群 ADD1 基因第 2 外
显子进行遗传变异研究，筛查该基因第 2 外显子的
SNP 位点，以期为全面揭示牦牛 ADD1 基因的功能
提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 从 11 个西藏类群中，选取健康成
年的牦牛 483 头（表 1），采集耳组织，75% 乙醇保
存带回实验室，存于 -80℃保存备用。
1.1.2 主要试剂和仪器 试剂主要有 Taq DNA 聚合
酶、DNA Marker DL2000、pMD19-T、dNTP、MgCl2
均 购 自 TaKaRa，30% 丙 烯 酰 胺、TEMED、APS、
OMEGA 胶回收试剂盒、菌株 JM109 购自天跟生化
科技有限公司。仪器包括 PCR 仪、电泳仪、垂直板
电泳槽、转移脱色摇床、凝胶成像仪。
类群 代码 样品数量 采样地点
桑桑牦牛 SS 50 桑桑县
帕里牦牛 PL 50 帕里县
康布牦牛 KB 50 康布县
嘉黎牦牛 JL 50 嘉黎县
巴青牦牛 BQ 50 巴青县
丁青牦牛 DQ 10 丁青县
类乌齐牦牛 LWQ 25 类乌齐县
江达牦牛 JD 50 江达县
桑日牦牛 SR 50 桑日县
工布江达牦牛 GD 50 工布江达县
斯布牦牛 SB 48 斯布县
表 1 供试牦牛类群、数量及采样地点
1.2 方法
1.2.1 基 因 组 DNA 的 制 备 基 因 组 DNA 的 提 取
采用常规酚 - 氯仿抽提法，用 1% 琼脂糖凝胶电泳
和紫外分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度，并置
于 -20℃保存备用。
1.2.2 引物及 PCR 扩增 试验针对 ADD1 基因第 2
外显子，参照 GenBank 中提供的牛 ADD1 基因序列
（登录号 ：NC-007304），利用 Primer5.0、Oligo6 软件
设计引物，引物由上海英维捷基（Invitrogen）生物
技术有限公司合成。
设 计 的 引 物 预 期 扩 增 目 的 片 段 长 度 为
282 bp，退火温度为 58℃，引物序列 ：上游引物 ：
5-GTTGATCTGTGTGATAGTGAGCCTT-3 ；下 游 引
物 ：5-GACCTGGAAAACGGCAGAGC-3。PCR 反 应
体 系 为 25 μL， 其 中 包 括 10×buffer 2.5 μL、dNTP
2.0 mmol/L、MgCl2 2.0 mmol/L、 引 物 2 μmol/L、Taq
DNA 聚合酶 1 U、模板 DNA 100 ng、ddH2O 15.2 μL。
PCR 扩增程序：95℃预变性 2 min；然后 95℃变性 30 s，
58℃复性 30 s，72℃延伸 45 s，共 35 个循环 ；最后
72℃再延伸 8 min，8℃保存。PCR 产物用 1% 琼脂
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期126
糖凝胶电泳，98 V 恒压电泳 40 min，EB 染色，自动
凝胶成像系统拍照检测。
1.2.3 PCR 产 物 SSCP 分 析 采 用 10%（Arc Bis=
29 1，缓冲液为 1×TBE）的非变性丙烯酰胺凝胶电
泳检测：取 PCR 产物 3 μL，加入 2 μL 上样缓冲液（95%
去离子甲酰胺、0.025% 二甲苯菁、0.25% 溴酚蓝），
98℃变性 10 min，立即置于冰上，放置 10 min 后上样；
250 V 电压电泳 10 min 后 180 V 恒压电泳 2 h，银染
显带，观察结果。
1.2.4 测序分析 PCR 产物经 SSCP 分型后，挑选
扩增效果好的 AA、AB、BB 基因型个体各 2 个进行
克隆测序，测序反应由上海英潍捷基（Invitrogen）
生物技术有限公司完成。运用 DNAMAN 软件对测序
结果进行校正对比。
1.2.5 数据统计分析 运用 Genepop 软件对各品种
的不同基因型等位基因及基因频率进行统计，同时
进行多态信息含量（PIC）、群体杂合度（He）的计算。
其中，基因频率 =Pi（［2（ii）（（ij1）（ij2）（ijn）］/2N，
其中 Pi 为第 i 个等位基因频率；i 为纯和复等位基因；
j1，j2，……，jn 为与 i 共显性的第 n-1 个等位基因，
N 为所测群体或类群的个体总数。
基因型频率 = 每种基因型的个体数 / 所测群体
的个体数
多态信息含量（PIC）计算按 Botstein 等［10］的
公式计算 ：
PIC=1- p2i - 2p2i p2jm mm-1i=1 j=i+1i=1
PIC ＞ 0.5 为高度多态，0.5 ＞ PIC ＞ 0.25 为中
度多态，PIC ＜ 0.25 为低度多态。
2 结果
2.1 PCR扩增
PCR 扩增产物用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测，
结果（图 1）显示，均无杂带，特异性好。扩增片
段大小为 282 bp，与预期结果相符。可以进行后续
的 SSCP 分析及克隆测序。
M.Marker DL2000 ；1-17.ADD1 基因的 PCR 产物
图 1 牦牛 ADD1 基因第 2 外显子 PCR 产物电泳结果
2.2 SSCP检测和序列测定
对 11 个牦牛类群的 PCR 扩增产物用 8% 非变性
聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检测（图 2），发现引物对
扩增片段有多态性，根据条带不同将其分为 AA、AB、
BB 3 种基因型。该位点克隆产物送 Invitrogen 公司
测序，序列与 NCBI 公布的原始序列对比发现 66 bp
处碱基 T 缺失，256 bp 处 A → G 突变，各基因型对
应的碱基突变及序列对比见图 3。
2.3 ADD1基因第2外显子的遗传多态性分析
ADD1 基因第 2 外显子多态位点的遗传多态性
1-4,8,10.AB 型 ；5-7.AA 型 ；9.BB 型
图 2 ADD1 基因第 2 外显子 PCR-SSCP 凝胶电泳图
2012年第1期 127柴志欣等 ：西藏牦牛 ADD1 基因第 2 外显子的 PCR-SSCP 检测及序列分析
指标见表 2。由表 2 可知，优势等位基因在 11 个牦
牛类群中存在差异，帕里牦牛只有 AA 基因型，江
达牦牛只有 AB 基因型，均存在严重偏态；康布牦牛、
嘉黎牦牛、巴青牦牛、桑日牦牛、斯布牦牛缺少 BB
基因型；丁青牦牛、类乌齐牦牛缺少 AB 型，桑桑牦牛、
工布江达牦牛中均存在 AA、AB、BB 3 种基因型。
除江达牦牛外，AA 基因型在其它类群表现为优势基
因型，而且 A 等位基因为优势等位基因。桑桑牦牛、
类群 样本数
基因型频率 基因频率
多态信息含量（PIC） 杂合度（He）
AA BB AB A B
SS 50 0.200 0.060 0.740 0.570 0.430 0.370 0.490
PL 50 1.000 0 0 1.000 0 0 0
KB 50 0.560 0 0.440 0.780 0.220 0.284 0.343
JL 50 0.260 0 0.740 0.630 0.370 0.358 0.385
BQ 50 0.720 0 0.280 0.860 0.140 0.212 0.466
DQ 10 0.600 0.400 0 0.600 0.400 0.365 0.480
LWQ 25 0.680 0.320 0 0.680 0.320 0.341 0.435
JD 50 0 0 1.00 0.500 0.500 0.375 0.500
SR 50 0.620 0 0.380 0.810 0.190 0.260 0.308
GD 50 0.340 0.160 0.500 0.590 0.410 0.367 0.484
SB 48 0.542 0 0.458 0.771 0.229 0.291 0.353
图 3 牦牛 ADD1 基因 AA、AB、BB 型的序列对比
表 2 ADD1 基因第 2 外显子的基因型频率和等位基因频率
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期128
康布牦牛、嘉黎牦牛、丁青牦牛、类乌齐牦牛、江
达牦牛、桑日牦牛、工布江达牦牛、斯布牦牛 9 个
类群均处于中度多态（0.25 ＜ PIC ＜ 0.50），遗传变
异较大 ；帕里牦牛则无多态 ；且所研究的 11 个牦牛
类群的杂合度较高。
3 讨论
ADD1 基因作为影响肉质的一个候选基因，其
相关研究在猪、山羊等［4-6］小家畜方面开展的较多，
研究的较全面。ADD1 基因多态性与肉质性状的关
联研究在动物遗传育种领域有很大的进展。李长龙
等［4］发现，不同猪群中 ADD1 基因多态性有可能应
用到提高肌内脂肪（MF），同时不影响背膘厚（BF）
的育种实践中 ；陈杰等［5］ 采用 PCR-SSCP 技术对
猪 ADD1 基因座位的多态性进行检测，发现在基因
第 347 和 374 位点出现单核苷酸多态性，分别位于
ADD1 基因第 90 和 99 位氨基酸密码子的第 3 位碱基，
并认为该基因的多态性可能作为选择肌内脂肪含量，
而不影响背膘厚的一个辅助选择标记 ；朱吉等［6］在
对山羊 ADD1 基因部分序列进行克隆分析中发现，
在 exon 6 的第 42 处和 intron 6 的第 82 处存在碱基突
变和碱基缺失；同时，发现牛、人序列长度存在差异，
碱基变异率分别为 3.86% 和 16.18%，有两处较明显
的碱基突变 / 碱基插入，且 3 个物种在转录调控元
件的碱基突变及不同位点的插入和缺失，可能影响
基因的转录调控，从而造成肌内脂肪的含量不同。
通过本研究对 ADD1 基因第 2 外显子 SNPs 的
筛查得出，ADD1 基因第 2 外显子存在 2 个多态位
点，66 bp 处碱基 T 的缺失，256 bp 处 A → G 突变。
多态信息含量和群体杂合度都是对品种或群体内遗
传变异大小进行衡量的指标，3 个指标在数值上有
一定的相关性，对于一个品种或群体来说，PIC 越
高，杂合度越大，表明该位点遗传变异程度也越
高［7］，有较大的选择利用潜力，那么该位点就有可
能成为辅助标记。试验结果表明，11 个牦牛类群
PCR-SSCP 存在多态性，在 66 bp 和 256 bp 处基因座
处于中度多态，杂合度较高，有可能作为分子标记
研究该位点与牦牛肉质的相关性。测序研究从 DNA
角度证实试验结果正确 ；与猪该基因座存在 SNP 位
点的结论一致。从多态信息含量来看，具有西藏东
部牦牛类群多态信息含量较高，而西部牦牛类群多
态性信息含量相对较低的趋势 ；且就杂合度而言，
西藏西部牦牛类群的杂合度较大，其遗传变异程度
较高，而东部牦牛类群较低，预示着西藏东部可能
是牦牛的起源地，且东部地区的牦牛品种或类群更
适合作为肉质相关性状研究的样本选择。由于本试
验涉及的样品种类及数量较多，分部的地域较广，
且活体采样存在较多的困难，所以并未得到与肉质
相关的性状数据，只是通过 PCR-SSCP 技术对牦牛
ADD1 基因第 2 外显子进行了 SNP 位点筛查，为后
续 ADD1 基因与肉质性状等相关功能的研究提供了
一定的理论依据。试验结果表明，西藏地区 11 个牦
牛类群的遗传资源较丰富，在以后的生产实践中应
加强保护并合理利用这一稀有资源。
ADD1 基 因 影 响 脂 肪 的 形 成， 相 关 性 状 已 经
在人类和鼠上得到了验证。Tontonoz 等［8］ 研究发
现，ADD1 基因对脂肪细胞的分化有着显著的影响 ；
Kakuma 等［9］发现 ADD1 基因的表达与非脂肪组织
中脂肪的沉积有关 ；Ding 等［10］利用猪的血管基质
细胞研究了与脂肪形成相关的一些影响因子。目前
该基因在大家畜方面的研究仅局限在猪和山羊上，
且在影响猪的肉质方面进行了较多的研究，并发现
ADD1 基因多态性与猪肌肉脂肪含量，皮脂率和屠
宰率［11］有显著关联，并将其列为影响猪肉质和胴
体性状的候选基因。在养殖业上，脂肪性状也是衡
量动物生长发育和肉质的重要指标之一，因此未来
对 ADD1 基因相关性状的研究应扩大到更多的大家
畜上，提高其肉质质量，获得更多的经济效益。另外，
由于 ADD1 基因对动物肌内脂肪含量的多少有一定
影响，所以今后应该进行 ADD1 基因与生产性状及
肉质性状相关性的研究，为进一步揭示 ADD1 基因
的功能、探讨其生产性状之间的联系确定分子遗传
标记进而实现标记辅助选择提供理论基础。
4 结论
本试验研究了西藏 11 个牦牛类群的 ADD1 基因
第 2 外显子遗传多态性，显示 66 bp 处碱基 T 缺失
和 256 bp 处 A → G 突 变， 共 有 AA、AB、BB 3 种
基因型 ；其中部分种群存在严重偏态 ；A 基因为优
势等位基因，分布较高 ；除帕里牦牛、巴青牦牛外，
2012年第1期 129柴志欣等 ：西藏牦牛 ADD1 基因第 2 外显子的 PCR-SSCP 检测及序列分析
其它 9 个牦牛类群均处于中度多态，遗传变异较大，
对进一步研究西藏牦牛的遗传多样性及起源、演化
和分类具有重要的意义。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）