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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第6期
收稿日期 : 2011-12-08
基金项目 : 国家科技支撑计划课题（2012BAD03B02）
作者简介 : 赵上娟 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 分子生态学 ; E-mail: zsj_2008_5@163.com
通讯作者 : 陈智华 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 生物多样性保护与利用 ; E-mail: Chenzhihua_czh@sohu.com
西藏牦牛 SRAP遗传多样性及分类进化研究
赵上娟1 钟金城1 柴志欣1 张成福2 信金伟2 陈智华1
（1 西南民族大学 动物遗传育种学国家民委 - 教育部重点实验室，成都 610041 ；
2 西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，拉萨 850000）
摘 要： 用 4对 SRAP分子标记引物对西藏 11个牦牛类群和四川麦洼牦牛的 DNA进行扩增，研究其遗传多样性和分类关系。
结果表明，在 335头牦牛中，共得到 29个基因位点，其中有 19个多态位点，多态率占 65.52%。12个牦牛群体间的 Neis遗传多样
性和 Shannon多样性指数分别为 0.048 2和 0.073 4，遗传相似系数在 0.781 1-0.989 1。巴青牦牛和康布牦牛的遗传多样性指数较其他
类群高，分别为 0.095 5和 0.090 0；桑日牦牛类群的遗传多样性指数最低，仅为 0.008 5。这些结果表明，12个牦牛类群的 SRAP
遗传多样性较低。根据 Neis遗传距离，利用 UPGMAM构建聚类关系图结果显示，嘉黎牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、桑桑牦牛、
康布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、斯布牦牛和麦洼牦牛聚为一大类，然后依次才与桑日牦牛、工布江达牦牛和江达牦牛相聚在一起，
显示在 SRAP分子遗传标记所反映的牦牛基因组的遗传结构中，江达牦牛、工布江达牦牛和桑日牦牛与其他牦牛群体间的亲缘关
系较远，牦牛的这种亲缘关系与其地理分布也不一致，说明这 12个牦牛的起源、演化关系较复杂，有待于进一步研究分析。
关键词： 西藏牦牛 SRAP 遗传多样性 分类 遗传分化
Analysis of Genetic Diversity and Classification of Tibetan Yak
Breeds by SRAP Molecular Markers
Zhao Shangjuan1 Zhong Jincheng1 Chai Zhixin1 Zhang Chengfu2 Xin Jinwei2 Chen Zhihua1
（1Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding of State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Southwest University for
Nationalities，Chengdu 610041；2Institute of Animal Science and Veterinary，Tibet Academy of Agricultural and Animal
Husbandry Sciences，Lhasa 850000）
Abstract: To analyze the genetic diversity and phylogeny relationship, we used 4 pairs SRAP markers among 11 Tibetan yak populations
and Sichuan Maiwa yak. The results showed that the numbers of polymorphic loci were 19 and the percentage of polymorphic loci is 65.52 in all.
The indexes of Neis gene diversity and the Shannons information were 0.048 2, 0.073 4 respectively. The Genetic similarity coefficient is from
0.781 1 to 0.989 1. Genetic diversity showed that the highest populations were Baqing yak （0.095 5） and Kangbu yak （0.090 0）, and the lowest
one was Sangri yak （0.008 5）. All data indicated the genetic diversity of SRAP was low in 12 yaks’ populations. Based on the Neis genetic
distance, cluster diagram with UPGMAM, the tree showed Jiali yak, Pali yak, Leiwuqi yak, Sangsang yak, Kangbu yak, Baqing yak, Dingqing yak,
Sibu yak and Maiwa yak clustered into one category, and then followed it with Sangri yak, Gongbujiangda yak and Jiangda yak. The result show
the Sangri yak, Gongbujiangda yak and Jiangda yaks genome genetic structure different from others by used SRAP genetic markers. The genetic
relationship is unrelated with geographic distribution. Above all revealed that the origin and evolution of 12 yaks populations were complicated,
and to be further research.
Key words: Tibetan yak SRAP Genetic diversity Classification Genetic differentiation
牦牛（Bos grunniens）是分布在海拔 3 000 m 以
上，以我国青藏高原为中心及其毗邻的高山、亚高
山地区的具有独特种质特性的牛种［1］。近年来，国
内外学者利用形态学遗传标记、细胞遗传标记、生
化遗传标记［2-4］以及 RFLP［5］、SSCP［6］、RAPD［7］、
AFLP［8, 9］、SSR［10, 11］和 SNP［12］等多种分子遗传标
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期78
记，从形态结构、细胞核基因组和线粒体基因组［13-15］
等方面研究了牦牛的遗传多样性及其起源、演化
和分类。相关序列扩增多态性（sequence-relatated
amplified polymorphis，SRAP）是由美国加州大学蔬
菜作物系 Li 和 Quiros 博士［16］于 2001 年从芸薹属作
物中开发出来的。该标记是一种新型的基于 PCR 的
分子标记技术，通过独特的双引物设计对基因开放
阅读框（open reading frames，ORFs）特定区域进行
扩增。基于 SRAP 分子标记的诸多优点，自开创到
现在已在植物，特别是农作物［17-21］、果树［22, 23］及
药用植物［24-26］研究中得到广泛的应用 ；但动物研究
中，如鱼［27-29］、虾［30］、鸡［31］、北极狐［32］和扬子
鳄［33］等少数物种鲜见报道。西藏约有 500 万头牦牛，
占全国牦牛总数的 35%，位居全国第二。为了解西
藏牦牛遗传多样性和资源现状，以及西藏牦牛品种
或类群的起源、演化和分类，探讨今后牦牛遗传资
源保护和利用的方向，本研究采用 SRAP 分子标记
技术，旨在分析西藏的 11 个牦牛类群和四川麦洼牦
牛的遗传多样性及这 12 个牦牛品种或类群间的系统
进化关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 从 11 个西藏牦牛类群和麦洼牦牛
类群中，采集 335 头健康成年牦牛的耳样组织（表
1），75% 乙醇保存带回实验室，存于 -80℃的冰箱
中备用。
1.1.2 试验试剂 DNA 提取试剂盒（Tiangen 生物技
术公司）、琼脂糖、乙二胺四乙酸（EDTA）、丙烯酰
胺、硝酸银、APS、TEMED 等试剂均购自成都飞克
生物公司，Taq聚合酶（Tiangen 生物技术公司）购
自成都博瑞克生物公司。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 的提取及检测 采用动物组织基
因组 DNA 提取试剂盒提取牦牛基因组 DNA。用 1%
的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计双重检测 DNA
的纯度和浓度，-20℃保存备用。
1.2.2 引物合成与 PCR 扩增及检测 根据 Li 和 Qui-
ros 博士发表的论文［16］，引用并自行设计合成上、
下游引物各 15 个（表 2），自由组合成 225 对引物。
由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
表 1 供试牦牛品种（类群）、数量及采样地点
品种（类群） 代码 样品数量 采样地点
桑桑牦牛（Sangsang yak） SS 30 桑桑镇
帕里牦牛（ Pali yak） PL 30 帕里镇
康布牦牛（Kangbu yak） KB 30 康布乡
嘉黎牦牛（Jiali yak） JL 30 嘉黎县
巴青牦牛（Baqing yak） BQ 30 巴青县
丁青牦牛（Dingqing yak） DQ 10 丁青县
类乌齐牦牛（Leiwuqi yak） LWQ 25 类乌齐县
江达牦牛（Jiangda yak） JD 30 江达县
桑日牦牛（Sangri yak） SR 30 桑日县
工布江达牦牛（Gongbujiangda yak） GB 30 工布江达县
斯布牦牛（Sibu yak） SB 30 拉萨市
麦洼牦牛（Maiwa yak） MW 30 红原县
合 计 335
表 2 试验引物
序号 上游引物序列（5-3） 序号 下游引物序列（5-3）
Me1 TGAGTCCAAACCGGATA Em1 GACTGCGTACGAATTAAT
Me2 TGAGTCCAAACCGGATG Em2 GACTGCGTACGAATTAAG
Me3 TGAGTCCAAACCGGATC Em3 GACTGCGTACGAATTAAC
Me4 TGAGTCCAAACCGGATT Em4 GACTGCGTACGAATTTGC
Me5 TGAGTCCAAACCGGAGC Em5 GACTGCGTACGAATTGAC
Me6 TGAGTCCAAACCGGAAT Em6 GACTGCGTACGAATTTCA
Me7 TGAGTCCAAACCGGAAG Em7 GACTGCGTACGAATTGCA
Me8 TGAGTCCAAACCGGACC Em8 GACTGCGTACGAATTCAA
Me9 TGAGTCCAAACCGGTAA Em9 GACTGCGTACGAATTCTG
Me10 TGAGTCCAAACCGGTCC Em10 GACTGCGTACGAATTCGA
Me11 TGAGTCCAAACCGGTTC Em11 GACTGCGTACGAATTCAG
Me12 TGAGTCCAAACCGGTGA Em12 GACTGCGTACGAATTATG
Me13 TGAGTCCAAACCGGTGT Em13 GACTGCGTACGAATTCCA
Me14 TGAGTCCAAACCGGCTA Em14 GACTGCGTACGAATTGTC
Me15 TGAGTCCAAACCGGGGT Em15 GACTGCGTACGAATTACG
PCR 扩增反应体系 ：总体积 15 μL，其中，上、
下游引物（10 pmol/μL）各 1 μL，DNA 模板 1 μL（50-
100 ng/μL），2×long Taq DNA 预 混 酶 7 μL， 灭 菌
ddH2O 5 μL。
PCR 扩增程序 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性
1 min，35℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，5 个循环；
94℃变性 1 min，52℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，
35 个循环 ；最后 72℃延伸 5 min，8℃保存。
2012年第6期 79赵上娟等 ：西藏牦牛 SRAP 遗传多样性及分类进化研究
PCR 产物变性后用 12% 聚丙烯酰胺凝胶在
1×TBE 缓冲液中 280 V 高压 6 min 后恒压 250 V 分
离 50 min（不同的引物稍作调整）。银染后于凝胶成
像系统中成像保存。参照 Sanguinetti 等［34］的方法。
1.2.3 数据处理 采用 popgen 32 软件处理分析，计
算各位点等位基因频率，Neis 遗传多样性（Neis
（1973） gene diversity，h），shannon 多 样 性 指 数
（Shannons Information index ［Lewontin （1972）］，I）
及 Neis 遗传一致性指数和遗传距离，并就 Neis 遗
传距离基于 UPGMAM（unweighted pair group method
with arithmatic mean）法构建系统进化树。
2 结果
2.1 12个牦牛类群 SRAP-PCR扩增
经筛选得 4 对（Me1/Em3、Me4/Em4、Me15/Em7
和 Me15/Em8）多态性较好的引物，对 335 头牦牛总
DNA 进行 PCR 扩增（图 1），共扩增出 29 个清晰可
辨认位点，平均扩增位点为 7.25 个。
图 1 引物Me4/Em4扩增总 DNA电泳图
2.2 西藏牦牛的SRAP遗传多样性
对试验结果进行量化统计构建 0、1 矩阵，经
popgen 32 软件处理得 11 个西藏牦牛类群及麦洼牦
牛类群内的遗传多样性指数（表 3）。29 个位点共有
多态位点数 19 个，占 65.52%，遗传多样性指数平
均为 0.130 0，Shannon 指数平均为 0.217 2 ；12 个类
表 3 西藏牦牛和麦洼牦牛类群内遗传多样性
牦牛类群 多态性位点 多态性比率（%） Neis 遗传多样性指数（h） Shannons 指数（I）
斯布牦牛 5 17.24 0.0698 0.1020
麦洼牦牛 2 6.90 0.0246 0.0367
巴青牦牛 8 27.59 0.0955 0.1455
江达牦牛 5 17.24 0.0496 0.0791
桑日牦牛 1 3.45 0.0085 0.0142
嘉黎牦牛 5 17.24 0.0646 0.0963
帕里牦牛 5 17.24 0.0610 0.0926
桑桑牦牛 4 13.79 0.0458 0.0690
康布牦牛 8 27.59 0.0900 0.1393
工布江达牦牛 2 6.90 0.0231 0.0357
类乌齐牦牛 2 6.90 0.0212 0.0319
丁青牦牛 2 6.90 0.0255 0.0380
平均 4.083 14.082 0.0482 0.0734
群牦牛间的遗传多样性指数为 0.048 2，Shannon 指
数为 0.073 4，遗传相似系数范围是 0.781 1-0.989 1。
巴青牦牛和康布牦牛遗传多样性指数较其他类群高，
分别为 0.095 5 和 0.090 0，桑日牦牛类群的遗传多
样性指数最低，仅为 0.008 5，但结果表明 12 个类
群的牦牛遗传多样性偏低。经计算，群体总遗传多
BQ11-BQ20. 引物 Me4/Em4 扩增巴青牦牛 ；GB15-GB24. 引物 Me4/Em4 扩增工布江达牦牛
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第6期80
样性 Ht 为 0.126 1，群体内遗传多样性 Hs 为 0.048 3，
基因分化系数 Fst 为 0.617 1，说明有 61.71% 的变异
存在于家系间，家系内的遗传变异占总遗传变异的
38.29%，基因流 Nm 为 0.310 2，说明西藏牦牛间存
在 31.02% 的基因交流。
2.3 西藏牦牛类群的聚类关系
通过 popgene 32 软件计算 12 个牦牛类群的
Neis 遗传距离（表 4），基于 Neis 遗传距离采用
UPGMAM 聚类法构建 12 个牦牛类群的进化关系遗
传图谱（图 2）。从表 4 可以看出，12 个牦牛类群的
相似度较高 0.781 1-0.989 1，有一定的差异性，相
似度大于 0.950 0 的占 23%。其中，帕里牦牛除了与
江达牦牛的相似度为 0.879 9 外，与其他类群牦牛的
相似度均大于 0.910 0，且与类乌齐牦牛相似度高达
0.990 0，桑日牦牛和江达牦牛相似度最低为 0.781 1。
Neis 遗传距离在 0.010 0-0.247 1 范围内。聚类结果
表明，嘉黎牦牛、帕里牦牛、类乌齐牦牛、桑桑牦牛、
康布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、斯布牦牛和麦洼
牦牛聚为一大类，然后依次才与桑日牦牛、工布江
达牦牛和江达牦牛相聚在一起，并未显示同一地理
区域的牦牛聚在一起，说明起源进化与地理分布呈
不相关性。
表 4 西藏牦牛和麦洼牦牛遗传一致性指数和遗传距离
类群 SB MW BQ JD SR JL PL SS KB GB LWQ DQ
SB **** 0.9519 0.8842 0.8292 0.8671 0.9686 0.9478 0.9285 0.9439 0.8355 0.9399 0.8989
MW 0.0493 **** 0.9395 0.8793 0.8492 0.9337 0.9394 0.8972 0.9164 0.8817 0.9088 0.9384
BQ 0.1231 0.0625 **** 0.8773 0.8917 0.9200 0.9471 0.8991 0.9202 0.8989 0.9268 0.9573
JD 0.1873 0.1286 0.1309 **** 0.7811 0.8699 0.8799 0.8090 0.8517 0.8131 0.8411 0.8711
SR 0.1426 0.1634 0.1146 0.2471 **** 0.9227 0.9194 0.8907 0.9343 0.8233 0.9200 0.8791
JL 0.0319 0.0686 0.0834 0.1394 0.0805 **** 0.9799 0.9532 0.9788 0.8763 0.9841 0.9446
PL 0.0536 0.0625 0.0543 0.1279 0.0841 0.0203 **** 0.9602 0.9808 0.9031 0.9900 0.9686
SS 0.0742 0.1085 0.1064 0.2120 0.1158 0.0479 0.0406 **** 0.9891 0.8577 0.9621 0.9221
KB 0.0577 0.0874 0.0832 0.1605 0.0680 0.0215 0.0194 0.0110 **** 0.8720 0.9795 0.9388
GB 0.1797 0.1259 0.1066 0.2069 0.1944 0.1320 0.1019 0.1535 0.1369 **** 0.8888 0.9306
LWQ 0.0620 0.0956 0.0761 0.1730 0.0834 0.0160 0.0100 0.0387 0.0207 0.1179 **** 0.9632
DQ 0.1066 0.0636 0.0436 0.1380 0.1288 0.0570 0.0319 0.0811 0.0632 0.0719 0.0375 ****
Neis 遗传一致性指数（上三角）和遗传距离（下三角）
图 2 12个牦牛类群 UPGAMAM聚类图谱
2012年第6期 81赵上娟等 ：西藏牦牛 SRAP 遗传多样性及分类进化研究
3 讨论
3.1 关于西藏牦牛的SRAP遗传多样性
SRAP 分子标记是 2001 年新开发出的基于 PCR
的新型标记，因其具有简便、高效、产率高、高共
显性、重复性好、易测序及便于克隆目标片段等优
点而广泛应用于植物和少数动物的研究。本研究采
用 4 对多态性较好的引物对 12 个类群共 335 头牦牛
DNA 进行 PCR 扩增检测，共检测到 29 个基因位点，
其中多态位点 19 个，多态率占 65.52%。从 Neis 遗
传多样性指数和 Shannon 指数显示结果来看，12 个
牦牛类群的遗传多样性较低，与肖玉萍［7］、郭松
长［13］、马志杰等［15］高遗传多样性的研究结果存在
一定的差异，而与白晶晶等［12］研究甘南牦牛所得
的低遗传多样性的结果相接近。其原因可能是 SRAP
分子标记不是研究牦牛遗传多样性最好的分子技术，
也有可能是西藏牦牛的遗传多样性较其他牦牛品种
或类群低。
3.2 关于西藏牦牛类群间的亲缘关系
家畜品种聚类分析对遗传资源的合理利用具有
重要意义，近年来，学者们先后对牦牛品种亲缘关
系进行研究，但由于各自采用的研究对象和研究方
法不同，导致研究结果存在一定差异，加之受分布
地区自然条件限制，西藏牦牛品种或类群间亲缘关
系和分类一直没有进行过系统研究。在本研究中，
以麦洼牦牛为外群，结果表明嘉黎牦牛（JL）、帕里
牦牛（PL）、类乌齐牦牛（LWQ）、桑桑（SS）牦牛、
康布牦牛（KB）、巴青牦牛（BQ）、丁青牦牛（DQ）、
斯布牦牛（SB）与麦洼牦牛（MW）聚为一大类，
然后依次才与桑日牦牛（SR）、工布江达牦牛（GB）
和江达牦牛（JD）相聚在一起，显示在 SRAP 分子
遗传标记所反映的牦牛基因组的遗传结构中，江达
牦牛、工布江达牦牛和桑日牦牛与其他牦牛群体间
的亲缘关系较远，牦牛的这种亲缘关系与其地理分
布也不一致，可能与牦牛的单一起源有关［13］，且与
本课题 PARD、CO Ⅲ基因和细胞色素 b 的研究均存
在一定的差异，这可能与各个分子标记的特性有关。
说明这 11 个牦牛的起源、演化关系较复杂，有待于
进一步研究分析。
4 结论
SRAP 分子标记研究结果表明，西藏牦牛遗传
多样性较低，聚类结果显示在牦牛基因组的遗传结
构中，江达牦牛、工布江达牦牛和桑日牦牛与其他
牦牛群体间的亲缘关系较远，体现出牦牛的这种亲
缘关系与其地理分布也不一致的特性。
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（责任编辑 马鑫）