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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
杀镰孢菌素（Fusaricidins）为微生物产生的酯肽
类抗生素，其中 Fusaricidin A、B、C、D 由 Kajimura
等 1996 年 -1997 年首次从多黏芽孢杆菌（Bacillus
polymyxa，现为多黏类芽孢杆菌 Paenibacillus poly-
myxa）KT-8 中分离获得，对革兰氏阳性细菌和链格
孢（Alternaria spp.）、曲霉（Aspergillus spp.）、青霉
（Penicillium spp.）、尖镰孢（Fusarium oxysporum）等
病原真菌具有很强的抑菌活性［1-3］，此类抗生素在
植物病害的防治中已有许多成功的报道，尤其对世
收稿日期 : 2012-04-27
基金项目 : 北京市自然科学基金资助项目（6101001）, 北京市农林科学院科技创新专项（KJCX201101001）, 公益性行业（农业）科研专项
（200903049-07）
作者简介 : 于晓溪 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 分子生态学 ; E-mail: xiaoxiyuer@gmail.com
通讯作者 : 刘伟成 , 男 , 博士 , 研究员 , 研究方向 : 植物病害生物防治 ; E-mail: liuwc@126.com
具有杀镰孢菌素合成功能基因菌株的筛选与鉴定
于晓溪1，2 吴慧玲1 刘铭1 董丹1 张殿朋1 刘伟成1
（1 北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京 100097 ；2 首都师范大学生命科学学院，北京 100048）
摘 要： 在 NCBI数据库中搜索已知多黏类芽孢杆菌基因组中分别编码 Fusaricidin合成酶 3个 NRPS功能区段的核苷酸保
守序列，利用 Primer5.0软件设计 3对引物，对供试的 95个细菌菌株进行 PCR检测，筛选到 1株阳性菌株 T99，其 3对引物扩增
产物的测序结果表明，所得 3个功能片段核苷酸序列与多黏类芽孢杆菌 SC2和 M1的 Fusaricidin合成酶基因序列的一致性分别为
99%、97%和 99%，说明菌株 T99基因组中具有 Fusaricidin合成相关功能基因。结合形态特征及培养性状、生理生化特性和 16S
rDNA序列同源性分析的结果，将菌株 T99鉴定为多黏类芽孢杆菌。　
关键词： 杀镰孢菌素　合成相关基因　菌株筛选　分类鉴定　多黏类芽孢杆菌
Screening and Identification of the Strain with Fusaricidin
Biosynthesis Related Gene
Yu Xiaoxi1，2 Wu Huiling1 Liu Ming1 Dong Dan1 Zhang Dianpeng1 Liu Weicheng1
（1Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097；2College of Life
Science，Capital Normal University，Beijing 100048）
Abstract: Based on 3 conserved nucleotide sequences respectively encoding 3 function regions of NRPS involved in fusaricidin
biosynthesis, 3 pair primers were correspondingly designed using Primer5.0. PCR amplifications were performed with the designed primers for 95
bacterium strains. Among them, the positive amplicons were obtained only from one strain, T99, suggesting that the strain T99 has the fusaricidin
biosynthesis related genes. The PCR product sequencing showed that the identities between the 3 gene sequences amplified from the strain T99
and the fusaricidin biosynthesis gene of Paenibacillus polymyxa SC2 or M1 were 99%, 97% and 99%, respectively, indicating that strain T99
might be a potential fusaricidin producer. According to the morphological characteristics, culture performances, physiological and biochemical
reactions, and the 16S rDNA sequence analysis, the strain T99 was identified as Paenibacillus polymyxa.
Key words: Fusaricidin Synthesis related gene Strain screening Taxonomic identification Paenibacillus polymyxa
界公认的老大难病害镰刀菌枯萎病，Raza 等［4］利
用产 Fusaricidin A-D 的菌株 SQR21 与有机肥混合施
用防治西瓜枯萎病（F. oxysporum f. sp. nevium），使
发病率降低 70%，植株干重增加 113% ；利用其防
治黄瓜枯萎病（F. oxysporum f. sp. cucumerinum）也
取得了较好的效果［5］，表现了良好的应用前景。
Fusaricidins 通过非核糖体途径合成，其生物合成基
因簇全长 32.4 kb，含有 8 个开放阅读框，其中一个
大的开放阅读框 fusA 基因约 23.7 kb，编码具有 6 个
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期218
组件的非核糖体肽合成酶（NRPS），阻断 fusA 基因
可导致菌株合成 Fusaricidins 能力的丧失，表明 fusA
是参与 Fusaricidins 生物合成的关键基因［6-8］。目前
多黏类芽孢杆菌 PKB1、E681、SC2、M-1 等菌株
的 Fusaricidins 生物合成基因簇已经得到鉴定和分
析［7-10］，为含有该基因菌株的分子检测和筛选提供
了序列信息。本研究根据已报道的 Fusaricidins 合成
基因相关序列设计引物，利用 PCR 技术检测筛选了
本室保藏的部分细菌菌株，并对阳性菌株进行了分
类鉴定和活性测定，旨在探索 Fusaricidins 产生菌的
快速筛选途径，获得该类抗生素生产菌株，为发掘
镰刀菌枯萎病优良生防菌种质资源提供支撑。
1　材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 供试菌株共 95 株，均为北京市农
林科学院植物保护环境保护研究所分离保存的细菌
菌株，其中 NM1-60、NM91-105、NM107-123 分离
自内蒙古干旱沙漠地区土壤，MHC16 和 MHC23 分
离自黑龙江漠河森林永冻层土壤，T99 分离自北京
郊区蔬菜田耕作土壤。
1.1.2　培养基 CM0002（营养肉汁琼脂）培养基和
PDA 培养基分别按文献［11］和［12］的方法配制，
CM0002 液体培养基在原配方中去掉琼脂制备而成。
1.1.3　主要试剂和仪器 Taq DNA 聚合酶、2×Taq
PCR Master Mix、Taq Reaction Buffer、DL2000TM DNA
Marker、250 bp DNA Ladder Marker、超纯 dNTP Mix-
ture，均购自天根生化科技（北京）有限公司；6×loading
Buffer 购自宝生物工程有限公司 ；琼脂糖凝胶 DNA
快速纯化回收试剂盒购自原平皓（天津）生物技术
有限公司。
Mastercycler ep gradient S 智能型梯度 PCR 仪（德
国 Eppendorf 公司）、Sigma 3K30 型台式高速冷冻离
心机（德国 Sigma 公司）、Gel Doc XR+ 凝胶成像分
析系统（美国 Bio-Rad 公司）、DK-80 电热恒温水槽
（上海一恒科技有限公司）、DYY-10C 电泳仪（北京
市六一仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1　菌体培养与收集 供试菌株在 CM0002 斜面
培养基上活化培养后接种于 CM0002 液体培养基，
37℃，200 r/min 振荡培养过夜 ；吸取 1 mL 菌液加入
1.5 mL的离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清，
加入 20 μL 灭菌去离子水，轻缓振摇混匀，菌体悬
液 4℃贮存备用。
1.2.2　基因组模板样品制备 采用冻融法，将装有
菌体悬浮液的离心管快速放入液氮中，待菌悬液完
全冻结后取出迅速放入 37℃水浴，熔化后取出再放
入液氮中，如此反复操作 3-4 次，4℃、6 000 r/min
离心 10 min，收集上清液作为模板，-20℃保存备用。
1.2.3　菌株筛选
1.2.3.1　fusA 基因功能片段扩增引物的设计　通过
NCBI（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中多黏
类芽孢杆菌 Fusaricidin 合成酶序列分析，选择其结
构中的 3 个 NRPS 功能区段分别进行 Blastp 比对，
发现菌株 SC2（YP003944314.1、ADO54073.1）的这
3 个区段氨基酸序列与菌株 M-1（CCC83015.1）的
完全相同（分别由 153、152 和 146 个氨基酸组成），
为高度保守序列，因此根据菌株 SC2 和 M-1 基因组
（GenBank 登录号分别为 HE577054.1 和 CP002213.1）
中对应这 3 个区段的编码序列，利用 Primer5.0 软件
分别设计引物，所得 3 对引物的序列为 ：第一对 ：
fus1A ：5-TCAAGTCTGTGAAAGAGGGG-3；fus1B ：
5-CAATACTCAGTCCCTTGGCA-3。第二对 ：fus2A ：
5-GTGAGGTTCCGCACAAAG-3；fus2B ：5-GAACA-
GAACATCACTTGG-3。第三对：fus3A：5-GCGTCG-
TATCCCGAACAA-3；fus3B：5-TCGCTTGGTGTAAG-
TTCG-3。
1.2.3.2　PCR 扩增　分别应用 3 对引物对制备的供
试菌株基因组样品进行扩增，反应体系（25 μL）为：
10× PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上游
引物（10 μmol/μL）1 μL，下游引物（10 μmol/μL）
1 μL，模板样品 2 μL，5 U/μL Taq 酶 0.5 μL，ddH2O
11.5 μL。扩增程序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变
性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，25 个循环 ；
72℃延伸 10 min。扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳
检测。
1.2.3.3　目的片段序列分析　对阳性菌株进行重复
PCR 扩增，回收扩增产物送北京三博远志测序部测
序。测序结果在 NCBI 上进行在线 Blast 检索，分析
与其相近序列的同源性。
2012年第10期 219于晓溪等 ：具有杀镰孢菌素合成功能基因菌株的筛选与鉴定
1.2.4　阳性菌株鉴定
1.2.4.1　菌体形态和培养性状观察　T99 菌种于
CM0002 斜面培养基上培养 24-36 h，挑取活化的菌
落进行美蓝染色、芽孢染色和革兰氏染色［12］，光
镜下观察菌体和芽孢形态及革兰氏染色特性，并对
CM0002 和 PDA 平板上培养一定时间的菌落形状、
边缘、表面隆起、透明度和颜色等进行观察。
1.2.4.2　生理生化特性测定　按文献［12］和［13］
的方法测定菌株 T99 的生理生化特性。
1.2.4.3　16S rDNA 序列分析　利用细菌 16S rDNA 扩
增通用引物 27F/1492R，序列如下：27F：5-AGAGTT-
TGATCCTGGCTCAG-3，1492R ：5-GGTTACCTTGT-
TACGACTT-3。采用上述相同的 25 μL 反应体系，扩
增程序为：94℃预变性 5 min；94℃变性 1 min，55℃
退火 1 min，72℃延伸 2 min，30 个循环 ；72℃延伸
8 min。扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，回收
目标条带送北京三博远志测序。所得序列在 NCBI
上在线 Blast 比对，选择与其 16S rDNA 序列相似性
高的模式菌株利用 Mega5 软件构建系统发育树［14］。
2　结果
2.1 具有杀镰孢菌素合成相关功能基因菌株的筛选
利用设计的 fusA 基因功能片段扩增引物对供试
的 95 个菌株 PCR 检测的结果，3 对引物对菌株 T99
均扩增出了目的片段，大小在250-500 bp之间（图1）；
其它菌株均未得到目的片段。
M. DL2000 DNA Marker ；1-24. 分别为菌株 NM25-30、MHC16、MHC23、NM 91-105 和 T99 基因组样品 PCR 扩增产物
图 1 部分供试菌株 fusA基因功能片段 PCR扩增产物的电泳检测结果
2.2　阳性菌株目的片段序列分析
3 对引物对初筛获得的阳性菌株 T99 重复扩增
的 3 个片段序列结果如图 2 所示。扩增产物测序所
得序列的 NCBI 在线 Blast 比对结果表明，3 个功能
片段核苷酸序列均与多黏类芽孢杆菌菌株 SC2 和
菌株 M1 的 Fusaricidin 合成酶基因序列的一致性最
高，分别为 99%、97% 和 99%，说明其均为要寻
找的目的片段 ；据此推断菌株 T99 基因组中具有
Fusaricidin 合成相关功能基因。
2.3　菌株T99的分类鉴定
2.3.1　形态特征和培养性状　光镜下可见菌体杆状，
（2-5×0.6-0.8） μm（图 3）；革兰氏染色阳性 ；芽孢
膨大，呈椭圆形，位于菌体的末端或次末端（图 4）。
菌落在 CM0002 平板上呈薄层、似变形虫的移动扩
散状；在 PDA 平板上为大型黏液状，乳白至浅黄色，
表面光滑，中央常有小突起（图 5）。
2.3.2　生理生化特性　菌株 T99 的生理生化特性测
定结果，如表 1 所示。
2.3.3　16S rDNA序列分析　菌株T99的16S rDNA扩
增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测获得了约 1 500 bp
的条带（图 6），测序结果表明其长度为 1 463 bp ；
经在线 Blast 比对，与其序列相似性较高的前 23 个
菌株中，除枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株 RZ（EU-
220428.1） 和 4 个 Paenibacillus sp. 菌 株（HQ3171-
56.1、GU328695.1、GU979221.1 和 GU328690.1）外，
包括前 8 个菌株在内的其余 18 个菌株均为多黏类
芽孢杆菌 ；而枯草芽孢杆菌的模式菌株 DSM 10T
（NR_027552.1）16S rRNA 基因序列与 T99 的相似性
却相距较远，应用两序列比对程序比对的结果仅为
87%，由此推测枯草芽孢杆菌菌株 RZ 与 T99 的相似
性尚不能代表枯草芽孢杆菌与 T99 的亲缘关系。选
择 Blast 结果中与 T99 相似性在 97% 以上的 6 个种
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期220
及枯草芽孢杆菌的模式菌株与 T99 一起构建的基于
16S rDNA 序列的 NJ 系统发育树（图 7）。
由图 7 可见，菌株 T99 与多黏类芽孢杆菌的 2
个模式菌株 IAM 13419T 和 DSM 36T 聚为同一分支，
与其另一模式菌株 NRS-1105T 的距离也较近 ；而枯
草芽孢杆菌的模式菌株 DSM 10T 与所有菌株的遗传
距离均最远，成为该发育树的外群。
根据上述形态特征及培养性状、生理生化特性
和 16S rDNA 序列同源性分析结果，将菌株 T99 鉴定
为多黏类芽孢杆菌（P. polymyxa）。
3　讨论
植物病害生防微生物菌种的筛选传统上注重其
生物活性的考察，经室内离体生物活性测定、温室
植株接种和田间防效试验，最终筛选出可应用于生
产的生防菌［15］。此过程历时长，工作量大，且筛选
出的菌株在后续开发过程中对其活性成分的分离鉴
定难度较大 ；更重要的是，经过多年的活性筛选，
传统的方法在常规的生态环境中已很难获得具有新
活性或产生新物质的菌株，所以往往是对已知活性
M. DL2000 DNA Marker ；1，2. 引物 fus1A/fus1B 扩增产物 ；3，4. 引物 fus2A/fus2B 扩增产物 ；5，6. 引物 fus3A/fus3B 扩增产物
图 2　菌株 T99 fusA 基因 3个功能片段的序列（A）及 PCR扩增图（B）
图 3　菌株 T99的菌体形态 图 4　菌株 T99的芽孢形态
A
B
2012年第10期 221于晓溪等 ：具有杀镰孢菌素合成功能基因菌株的筛选与鉴定
近年来新的筛选方法不断涌现，应用较多的是将药
物或其特异基团作为靶标进行定向检测而建立的靶
标定向筛选和高通量筛选［16，17］，基于抗病作用机制
相关基因或酶类等生物大分子检测技术的分子筛选
方法也逐渐得到应用，如基于 I 型 PKS 合成酶基因
检测的大环聚酮类化合物产生菌 ［18］和烯二炔类抗生
素产生菌［19］的基因筛选体系、几丁质酶活力检测的
生化筛选体系［20］等 ；这些生物大分子正逐步取代传
统的药物筛选方法，发展成为药物初筛的主要靶标。
本研究根据杀镰孢菌素 Fusaricidin 生物合成
酶 NRPS 功能片段的编码基因序列设计引物，通
过 PCR 扩增筛选到了基因组中含有 Fusaricidin 合
成相关功能基因的阳性菌株 T99，由此说明 T99 具
有产生 Fusaricidin 类抗生素的潜能，这一筛选过程
在完成了目的菌株筛选的同时明确了其可能产生的
抗菌活性物质，为后续的功能基因克隆、菌种选育
及工程菌株构建、发酵过程的代谢调控等奠定了基
础，将大大提高从菌株筛选到产品开发整个过程的
研究效率。迄今为止，已报道的 Fusaricidin 产生菌
多为多黏类芽孢杆菌，本研究获得的 fusA 基因阳性
菌株 T99 经鉴定亦为多黏类芽孢杆菌，与前人的报
道一致。多黏类芽孢杆菌为非致病菌，对植物和哺
乳动物安全性极高，可产生肽类、蛋白质类、核苷
类、吡嗪类和酚类等抗菌物质和酶、植物激素等生
理活性物质，具有防病和促生双重作用［21］。本课题
组前期研究表明［22］，菌株 T99 活性产物对甘蓝枯萎
病菌（F. oxysporum f. sp. conglutinans）、桃褐腐病菌
（Monilinia fructicola）、苹果轮纹病菌（Botryosphaeria
berengeriana f. sp. piricola）等真菌和蜡状芽孢杆菌
（B. cereus）、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌及根癌
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、黄瓜角斑病菌
图 5　 菌株 T99在 CM0002（A）和 PDA（B）
平板上的菌落形态
图 7　菌株 T99基于 16S rDNA序列的系统发育树
表 1　菌株 T99的生理生化特性
试验项目 结果 试验项目 结果
接触酶 ＋ 利用甘露醇产酸 ＋
氧化酶 － 利用葡萄糖产气 ＋
厌氧生长 ＋ 利用柠檬酸盐 －
VP 试验 ＋ 硝酸盐还原 ＋
VPVP>pH7 － pH5.7 生长 ＋
甲基红试验 ＋ 7%NaCl 生长 －
利用葡萄糖产酸 ＋ 淀粉水解 ＋
利用木糖产酸 ＋ 明胶液化 ＋
利用 L-阿拉伯糖产酸 ＋ 分解酪素 ＋
图 6　菌株 T99 16S rDNA 扩增产物电泳检测结果
M. 250 bp DNA Ladder Marker ；1, 2. 16S rDNA PCR 产物
菌株的重复性试验，很少有创新性的突破。鉴于此，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期222
（Pseudomonas lachrymans）等革兰氏阴性细菌均具抑
菌活性，其抗菌谱较 Fusaricidin 更广 ；另外其发酵
滤液中的活性物质可用硫酸铵沉淀法提取，100℃加
热处理 30 min 后抑菌活性消失，认为其具有蛋白质
类的特性。因此，菌株 T99 除具有合成 Fusaricidin
类抗生素的潜能外，是否还会产生其它的抗菌物质
有待于进一步研究。
4 结论
采用基于功能基因 PCR 检测的方法筛选出了
基因组中含有 Fusaricidin 合成相关基因片段的菌
株 T99，其目的片段与已知的 Fusaricidin 合成酶
基因序列一致性高达 97%-99%，表明其具有合成
Fusaricidin 的潜能。经多项分类鉴定，T99 为多黏类
芽孢杆菌。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）