全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-26
基金项目 ：国家星火计划项目 （2008GA860007），甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目 （GNSW-2010-16）
作者简介 ：肖啸，女，硕士研究生，研究方向 ：植物发育生物学 ; E-mail:houjia_human@163.com
通讯作者 : 李唯，男，教授，研究方向 ：植物发育生物学 ；E-mail:liwei@gsau.edu.cn
不同葡萄品种 CBF1 基因的克隆及序列分析
肖啸 王旺田 孙萍 张哲敏 李唯
（甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州 730070）
摘 要: 根据欧洲葡萄 CBF1 基因序列设计 1 对特异引物，采用 PCR 方法从山葡萄、贝达、SO4、Ln33 和黑比诺的基因组中
各扩增出 1 个 DNA 片段并克隆到 pMD18-T 载体中。经序列测定和分析，各片段均长 756 bp，与欧洲葡萄 CBF1 基因的核苷酸序
列及其推导的氨基酸序列分别具有 98 % 和 99 % 的同源性，而且推导的氨基酸序列中包含有同源性更高的 AP2/EREBP DNA 结合域，
以及 CBFs 蛋白的两段特征序列（PKK/RPAGRxKFxETRHP 和 DSAWR）。结果表明从 5 种葡萄中均可以克隆出 CBF1 基因。
关键词: 葡萄 CBF1 转录激活因子 CBF1 基因 克隆
Cloning and Sequence Analysis of CBF1 Transcription Factor
Gene in Five Varieties of Grape
Xiao Xiao Wang Wangtian Sun Ping Zhang Zhemin Li Wei
（College of Life Sciences and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）
Abstract: A DNA fragment was cloned from the genome of 5 varieties of grape，Vitis amurensis，Beta，Ln33，SO4 and Pinot noir by
polymerase chain reaction（PCR）using the primers designed following Vitis vinifera CBF1 genes. Sequence analysis showed that the 5 cloned
DNA fragments all were 756 bp and 98 % and 99% identical to the Vitis vinifera CBF1 genes in nucleotide and deduced amino acid sequences
respectively. Moreover，they showed one AP2/EREBP DNA binding domain and two signature sequences of the CBFs family proteins，PKK/
RPAGRxKFxETRHP and DSAWR in the deduced amino acid sequence.
Key words: Grape CBF1 transcriptional activator CBF1 gene Cloning
甘肃的河西地区，光热资源充足，昼夜温差较
大，植物病虫害发生较轻，十分有利于植物光合与
糖分的积累，为生产酿酒葡萄的最佳地区。但是该
地区冬季气温偏低（-20℃左右较长时间的低温）和
春季的晚霜，每年使大面积葡萄遭受不同程度的冻
根和寒害。近年来，低温诱导转录因子 CBFS 在植物
抗逆方面的作用引起人们的普遍关注，为葡萄的抗
寒抗冻分子改良提供了新思路与途径。CBFs 转录因
子是近几年从拟南芥（Arabidopsis thaliana）[1-4]、油
菜（Brassica napus）[5，6]、水稻（Oryza sativa）及大
麦（Hordeum vulgare）等多种植（作）物中分离和
鉴定出来的一类受低温诱导的反式作用因子。在逆
境条件下 CBFs 转录因子能有效地与多个冷诱导和
脱水诱导基因的启动子核心序列“CCGAC”的顺式
作用元件 CRT/DREB 结合，促进这些基因的表达，
从而激活植物体内的多种耐逆机制，引起植物体内
的多种生理生化变化 [7-9]，提高植物抗逆性。
山葡萄、贝达、SO4、Ln33（Ln33 为本实验室
经过多年培育得到的优良抗冻砧木）为西北地区常
用的抗冻葡萄砧木品种，通过多年在河西地区的观
察发现，山葡萄的抗冻性极强（可长时间忍耐 -20℃
左右的低温）；贝达的抗冻性次之（能抗 -12℃左右
的低温）；SO4、Ln33 的抗冻性较弱（可抗 -9℃的低
温）。为了探讨采用 CBFs 转基因途径提高葡萄抗寒 /
冻性的可能性，本研究以山葡萄、贝达、SO4 及自
选的 Ln33 和营养系黑比诺为材料，拟从中克隆出
2011年第12期 83
与拟南芥 CBF1 基因同源的 DNA 片段，分析了这些
DNA 片段的序列特征，探讨不同葡萄的 CBF1 基因
是否存在差异，旨在为酿酒葡萄优良营养系的转基
因研究及抗冻性研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
抗 寒 葡 萄 砧 木 山 葡 萄（Vitis amurensis）、 贝 达
（Beta）、SO4、Ln33 及营养系黑比诺的幼叶（-70℃
保存备用）。pMD18-T 克隆载体、dNTP、限制性内
切酶和 DNA Marker 购自大连宝生物公司；Taq 酶购
自北京普博欣生物有限公司；多功能 DNA 纯化回收
试剂盒购自北京百泰克生物有限公司；其他常规化
学试剂均为国产分析纯。E.coli DH5α 菌株及质粒由
甘肃农业大学生命科学技术学院分子实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 基因组总 DNA 的提取 采用 CTAB 法提取基
因组 DNA[10]。
1.2.2 引物设计与 PCR 扩增 根据欧洲葡萄 CBF1
基因序列（登录号为 AY390372），应用 Oligo6.0 软
件 设 计 出 特 异 性 引 物 5-ATGGACTCGGACCACG
AAGAGTTT-3（forward）和 5-CTAATCATCATTCCAC
AAAGACAAG-3（reverse）。并委托北京华大基因公
司合成。
以 5 种葡萄的基因组 DNA 为模板，采用 25 μL
反 应 体 系 : 18 μL ddH20 ；2 μL dNTP（2.5 mmol/L
each）；2.5 μL 10 × PCR 缓 冲 液 ；上 下 游 引 物 各
0.5 μL ；1 μL 葡 萄 基 因 组 DNA ；0.5 μL DNA 聚 合
酶（2 U/μL）， 在 MJ Research PTC-200 DNA Engine
型 PCR 仪上进行扩增。循环参数为 ：95℃预变性
5 min ；94 ℃ 变 性 50 s ；47 ℃ 退 火 50 s ；72 ℃ 延 伸
80 s ；30 个循环。最后 72℃延伸 10 min ；4℃终止反
应。PCR 扩增产物在 1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.2.3 目的片段的回收与克隆 采用多功能 DNA 纯
化回收试剂盒纯化回收目的条带，按照一定比例与
克隆载体 pMD18-T 在 16℃水浴中连接过夜，连接产
物转化 E.coli DH5α 感受态细胞，在附加氨苄青霉素
（终浓度 0.05 mg/mL）的 LB 固体培养基上，37℃培
养 12-16 h，挑取白色单菌落活化培养，提取质粒，
通过 PCR 扩增以及 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ双酶切鉴定
获得重组质粒，选择 PCR 及 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ酶
切鉴定为阳性的质粒送北京华大基因公司测序。
1.2.4 生物信息学分析 生物信息学分析包括 ：
（1） 登 录 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov） 网 上
的 BLASTn 和 BLASTp 引擎，寻找与所克隆的 CBF1
基因相同源的核苷酸序列，分析它们在核苷酸与
氨基酸水平上的同源性 ；（2）采用 ProtParam 软件
（http://www.au.expasy.org/tools/protparam.html）分析克
隆基因编码蛋白质的分子量、等电点和不稳定系数
等 ；（3） 采 用 ProtScale 软 件（http://www.expasy.org/
cgibin/protscale.html）分析编码蛋白质的亲 / 疏水性；
（4）利用 SignalP 3.0 Server 软件（http://www.cds.dtu.
dk/services/SignalP）检测编码蛋白质的信号肽序列 ；
（5）采用 TMHMM Server V. 2.0 软件（http://www.cds.
dtu.dk/services/TMHMM）检测跨膜结构。
2 结果
2.1 CBF1基因的PCR扩增
以山葡萄、贝达、Ln 33、SO4 和黑比诺的基因
组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，在 750 bp 处均发现
有一条清晰的条带（图 1）。
M.DL2000; 1-5.分别为山葡萄、贝达、Ln 33、SO4与黑比诺的PCR产物
图 1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
2.2 CBF1基因的克隆及鉴定
对克隆到 pMD18-T 载体的目的基因片段进行
PCR 鉴定（图 2）后发现，扩增出来的片段大小也
约为 750 bp，与目的片段大小一致 ；对重组质粒进
行 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ双酶切后得到两个大小分别为
2.7 kb 和 750 bp 左右的片段，与预期的大小一致（图
3），初步断定克隆出的 CBF1 基因正确。
2.3 CBF1基因的序列测定与生物信息学分析
2.3.1 CBF1 基因的核苷酸序列分析 将 PCR 与酶
肖啸等 ：不同葡萄品种 CBF1 基因的克隆及序列分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期84
ATGGACTCGGACCACGAAGAGTTTTCAGCTTCGTCATCATCCTCTTCTTCTCAGACAAAC
M D S D H E E F S A S S S S S S S Q T N
CCTAATCCTTCTGATTCTTTGCTGCCTCTACAGTGCATTGGGCACAAGCGGAAAGCTGGG
P N P S D S L L P L Q C I G H K R K A G
AGAAAGAAGTTCCGGGAGACACGACACCCAATATACAGAGGCGTGCGGCAAAGAAATGGG
R K K F R E T R H P I Y R G V R Q R N G
AACAAATGGGTGTGTGAAGTGCGGGAACCCCTTAAGAAATCCAGGATATGGCTAGGCACC
N K W V C E V R E P L K K S R I W L G T
TTTCCTACCCCGGAAATGGCTGCTAGGGCTCATGATGTGGCTGCCCTAGCGCTTAGAGGC
F P T P E M A A R A H D V A A L A L R G
CGCTTTGCTTCCCTCAATTTCCCCGATTCGGCTTGGCGCCTTCCACGGCCCAAGTCGTCC
R F A S L N F P D S A W R L P R P K S S
TCTGCAGAAGACATACAAGTAGCAGCGCTTGAAGCCACCAAGGCTTTCAACCCAACTGCA
S A E D I Q V A A L E A T K A F N P T A
CCATCTTCGTCCTCCTTGGCCTCTGCATTGGATAATATGTCAGGAGTTGCAGACTCGAAG
P S S S S L A S A L D N M S G V A D S K
AAGGTACTAGAAACTTCACCAAATGTGGAGTCGCCTAAGTTAAAGAGCCAAAGGATGGTT
K V L E T S P N V E S P K L K S Q R M V
CTGGAAGTTTCTCCGGTGGATACTAAGAGGTCAGAGAAGGTTGGAGATGGTTCAACGACA
L E V S P V D T K R S E K V G D G S T T
GTGTTCATGGATGAGGAGGCAATGTTCAATATGCAAGGTTTAATTAACAGCATGGCTGAG
V F M D E E A M F N M Q G L I N S M A E
GGTTTGCTCCTTACTCCACCTGCTATGTGTAAAGGATTCAGCTGGGATGATGCAACTGAT
G L L L T P P A M C K G F S W D D A T D
TCCCACATTGACTTGTCTTTGTGGAATGATGATTAG
S H I D L S L W N D D *
切鉴定符合预测结果的 5 种葡萄的重组质粒全部
测序，并利用 DNAMAN 软件进行分析表明，克隆
到的 DNA 片段均具有起始密码子 ATG 和终止密码
子 TAG，表明均具有完整的开放阅读框（ORF）。
该 ORF 长 756 bp， 编 码 由 251 个 氨 基 酸 组 成 的
多 肽， 并 且 都 具 有 典 型 的 CBFs 转 录 因 子 家 族 蛋
白 结 构（PKK/RPAGRXKFXETRHP 和 DSAWR） 和
AP2/EREBP 结 构 域。 利 用 DNAMAN 软 件 对 所 克
隆 的 5 个 CBF1 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 推 导 的 氨 基
酸序列分别进行了多重比对分析，核苷酸和氨基
酸的相似性均为 99.4%。经过 NCBI 分析进一步发
现， 从 山 葡 萄、 贝 达、Ln33、SO4 和 黑 比 诺 克 隆
到的序列与 CBF1 基因（AY390372）的核苷酸序列
相 似 性 为 98.28%-99.21%， 氨 基 酸 序 列 相 似 性 为
98.39%-98.8%，表明该基因已被成功地克隆（图 4）。
2.3.2 蛋白一级结构理化性质分析 ProtParam 软件
M.DL2000; 1-5. 分别为山葡萄、贝达、Ln33、SO4 与黑比诺
重组质粒 PCR 产物
图 2 重组质粒 PCR 检测电泳
M1.DL 2000; M2.15000; 1-5.分别为山葡萄、贝达、Ln33、SO4
与黑比诺Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切检测电泳
图 3 重组质粒双酶切电泳
图 4 山葡萄 CBF1 基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
斜体部分为 CBFs 家族蛋白特征序列 PKK/RPAGRXKFXETRHP 和 DSAWR ；划线部分为 AP2/EREBP DNA 结构域
1
1
61
21
121
41
181
61
241
81
301
101
361
121
421
141
481
161
541
181
601
201
661
221
721
240
（http://www.au.expasy.org/tools/protparam.html）预测表
明，从山葡萄、贝达、Ln33、SO4 及黑比诺克隆到
的 CBF1 基因编码的蛋白质的分子式为 C1191-1202H1899-
1908N347-350O378-380S12，分子量为 27.57-27.69 kD ；理论
等电点为 6.97-8.41 ；带负电荷的氨基酸残基数（Asp
+ Glu）为 31-32，带正电荷的氨基酸残基数（Arg
+ Lys）为 32-33 ；不稳定系数为 48.34-52.22，均为
不稳定蛋白（标准 40 以下为稳定蛋白），理论推导
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半衰期大约为 30 h，脂肪系数平均为 65.74-66.14。
含 量 较 高 的 氨 基 酸 依 次 为 Ala（9.2%）、Arg
（6.4%%-6.8%）、Asp（6.4%-6.8%）、Glu（6.0%）、
Leu（8.4%）、Lys（6.4%）、Pro（6.4%-7.2%）及 Ser
（13.1%-13.9%）。亲水性平均数为 -0.576 至 -0.564，
预测该蛋白均为亲水性蛋白。
2.3.3 氨基酸序列疏水性 / 亲水性预测和分析 利
用在线的 ProtScale 软件（http://www.expasy.org/cgibin/
protscale.pl）进行疏水性 / 亲水性分析，即可描绘蛋
白质的疏水性图谱。图 5 是对 5 种葡萄 CBF1 基因氨
基酸疏水性的预测结果。结合 ProtParam 软件分析结
果（亲水性平均数为 -0.576 至 -0.564），表明山葡萄、
贝达、Ln33、SO4 和黑比诺 CBF1 基因编码的蛋白质
均属于亲水性蛋白，但疏水性不强。
2.3.4 氨基酸序列信号肽的预测和分析 应用 Signa
lP 3.0 Server 软件（http://www.cds.dtu.dk/services/Signa
lP）检测氨基酸序列信号肽，只有当 C、Y 和 S 值的
计算结果均为“YES”，平均值在 0.5 以上时，才可
能存在信号肽。从山葡萄的预测结果（图 6）可以
看出，氨基酸序列结果均为“NO”且所有值都普遍
远低于 0.5。蛋白质 N 端的氨基酸区域的平均值低
且没有显著的可能性。因此可以认为这个蛋白很有
可能不具备信号肽，这说明葡萄 CBF1 蛋白为非分泌
性蛋白。
图 5 CBF1 蛋白质疏水性分析
2.3.5 氨 基 酸 序 列 跨 膜 结 构 域 预 测 用 TMHMM
Server V. 2.0 软 件（http://www.cds.dtu.dk/services/
TMHMM）对 CBF1 蛋白进行蛋白质跨膜区段预测，
结果（图 7）显示，5 种葡萄的蛋白整条肽链均不
位于细胞膜上，且都没有明显的跨膜区域。这表明
CBF1 发挥功能的部位并非在生物膜上，而是在细胞
质或细胞核内起作用。
3 讨论
CBF1 基因首先是在拟南芥中发现的，研究结
果证明，CBFs 冷反应途径的组成因子在开花植物
中是高度保守的，而且不只局限于能够冷驯化的植
物中。转基因试验表明，CBFs 基因超表达可以使
植物在非冷驯化状态下提高冷调节基因（COR）蛋
白、脯氨酸和可溶性糖的含量，产生胚胎发育晚期
图 6 山葡萄 CBF1 蛋白质信号肽分析
肖啸等 ：不同葡萄品种 CBF1 基因的克隆及序列分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期86
丰富的蛋白和亲水性多肽，改变细胞质膜组分，从
而提高植物的抗逆性 [11]。蛋白质和核酸数据库的搜
索结果也显示，许多植物中均潜在有 CBF1 同源基因。
CBF1 转录激活因子的一级结构中含有 AP2 DNA 结
合域，在植物中高度保守，说明 CBF1 基因在植物抗
逆反应中的调控机理可能广泛地存在于双子叶及单
子叶植物中 [8,12]。已有报道，拟南芥 [13]CBF1 基因的
阅读框架中没有内含子，这一点也在许多植物，例
如高羊茅（tall fescue）[7]、马蔺（Iris lactea）[14]、沙
冬 青（Ammopiptanthus mongolicus）[15]、 月 季（Rosa
chinensis）[16]、 山 葡 萄 [17] 及 柑 橘（Citrus）[18] 中 得
到证实。这表明 CBFs 转录因子基因转录后不需要
mRNA 剪辑过程，可能起着快速调控下游基因表达，
从而在短时间内对环境变化作出反应的作用 [15]。
本研究以山葡萄、贝达、Ln33、SO4 和黑比诺
的基因组 DNA 为模板，克隆到的 5 个 CBF1 基因经
序列分析表明，它们的核苷酸序列与已报道的葡萄
的 CBF1 基因 [19] 的相似率达到 98.28%-99.21%，编
码的蛋白质均存在 AP2 DNA 结合域以及位于该结
合 域 两 端 的 特 征 序 列 PKK/RPAGRxKFxETRHP 和
DSAWR。通过一系列生物信息学分析，5 个 CBF1 基
因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列并无明显差异，
但是它们的抗冻性却存在一定差异，估计这种差异
性除与 CBF1 基因有关外，可能还与其他因素有关，
有待于进一步证实。除此以外，5 个 CBF1 基因编码
的蛋白质可能都不具有信号肽，与沙冬青 [15] 报道的
结论一致。说明本试验克隆的 CBF1 基因具有 CBF1
转录因子的结构特征，因而推测葡萄中也存在 CBF1
耐逆机制，这为利用 CBF1 基因进行葡萄耐寒性的
基因工程改良提供了依据和前提条件。等电点分析
表明，贝达、Ln33、SO4 和黑比诺的 CBF1 基因编
码的蛋白质偏碱性（等电点为 7.74-8.41）； 山葡萄
的 CBF1 基因编码的蛋白质偏中性（等电点为 6.97），
与已报道的 CBF1 转录因子（AAR28671、AAR28672
以及 AAR28673）的性质相似 [19]，但是与山葡萄 [17]
的 CBF1 转录因子性质不同（山葡萄的 CBF1 基因编
码的蛋白质为偏酸性 [17]），可能是与山葡萄有不同
变种有关 [20] ；其次可能与生长环境相关，本研究中
的山葡萄成长在西北地区的碱性土质中，而山葡萄
的材料取自吉林长春 [17]，土质偏酸性，从而导致这
种差异的存在。
据报道，CBF1 转录因子可能通过介导冷信号传
导并激活相关 COR 基因的表达，从而提高植株的抗
寒性 [9,11]。在此研究的基础上，分离启动子等调控序
列和相应的上游原件，以及它们所作用的靶基因和
顺式元件，研究葡萄中 CBF1 转录因子介导的冷驯化
途径，可望为今后培育抗寒性较强的葡萄品种奠定
理论基础。
4 结论
从 5 种葡萄中克隆了 CBF1 基因，编码的多肽都
具有 AP2 DNA 结构域及典型的 CBFs 转录因子家族
蛋白结构 PKK/RPAGRXKFXETRHP 和 DSAWR，分
别位于 AP2 DNA 结构域的上下游 ；与 CBF1 基因
（AY390372）的核苷酸序列相似性为 98.28%-99.21%，
氨基酸序列相似性为 98.39%-98.8%。表明不同葡萄
的 CBF1 基因在组成与结构上基本相同，无明显差
异存在。
5 种葡萄 CBFl 蛋白均为不稳定、亲水性、非分
泌蛋白，无信号肽及跨膜结构域存在。表明不同葡
萄的 CBF1 蛋白在特性上基本相同。5 种葡萄 CBF1
基因无明显差异存在，但抗寒性却存在差异，说明
葡萄的抗寒性除与 CBF1 基因有关外，CBFs 家族的
其他成员及其他基因对葡萄抗寒性也有重要的作用。
葡萄的抗寒性是一个多基因控制的性状。
参 考 文 献
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CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that
binds to the C-repeat/DRE，a cis-acting DNA regulatory element
图 7 CBF1 蛋白质跨膜区分析
2011年第12期 87肖啸等 ：不同葡萄品种 CBF1 基因的克隆及序列分析
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（责任编辑 李楠）
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（责任编辑 狄艳红）
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