全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第7期
针对传统生物脱氮工艺存在的问题，国内外研
究者发现了一类特殊的异养硝化好氧反硝化细菌，
这类细菌能够在单一好氧条件下将氨氮转化为气态
产物来实现氮素的去除，进而能够有效解决传统工
艺中自养硝化菌细胞产率低和硝化与反硝化必须分
级的难题［1，2］。一些异养硝化好氧反硝化细菌，如
收稿日期 ： 2013-12-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（51208007），高等学校博士点新教师类基金项目（20120001120101）
作者简介 ：陈倩，女，博士，工程师，研究方向 ：生物脱氮技术 ；E-mail ：chenqian@iee.pku.edu.cn
异养硝化好氧反硝化菌株 Agrobacterium tumefaciens
LAD9 羟胺氧化酶的分离纯化
陈倩  马涛  王婷
（北京大学环境工程系 水沙科学教育部重点实验室，北京 100871）
摘 要 ： 羟氨氧化酶（Hydroxylamine oxidase，HAO）的作用方式直接决定了异养硝化好氧反硝化细菌的代谢途径，分离得
到纯度较高的 HAO 也就成为研究这类细菌脱氮机制的重要环节。以异养硝化好氧反硝化细菌 Agrobacterium tumefaciens LAD9 为代表，
建立了该菌株 HAO 的分离纯化方法 ：首先采用渗透压休克法提取细胞周质液，然后采用 DEAE Sepharose CL-6B 离子交换层析和
Sephacryl S-100 凝胶过滤层析对细胞周质液进行分离纯化。结果表明，经过离子交换层析可得到分子量分别为 55.3、35.7 和 19.2
kD 的杂蛋白，进一步经过凝胶过滤层析即可得到电泳纯的 HAO，纯化倍数为 5.79，产率为 39.71%。对其酶学性质的初步研究表明，
该菌株 HAO 的分子量为 18.8 kD，能够将羟胺氧化为亚硝酸盐氮，且 Fe2+ 的加入可显著增强其酶活。
关键词 ： 脱氮 羟胺氧化酶 分离纯化 Agrobacterium tumefaciens LAD9 异养硝化好氧反硝化
Separation and Purification of Hydroxylamine Oxidase from
Agrobacterium tumefaciens LAD9
Chen Qian Ma Tao Wang Ting
（The Key Laboratory of Water and Sediment Sciences，Ministry of Education，Department of Environmental Engineering，
Peking University，Beijing 100871）
Abstract:  The metabolic pathway of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification bacteria was directly determined by the actions of
their hydroxylamine oxidase（HAO）. Isolating high-purity HAO from this kind of bacteria has become particularly important to explain the
mechanism of nitrogen removal. In this study, the separation and purification technic of HAO from a novel heterotrophic nitrification-aerobic
denitrification strain Agrobacterium tumefaciens LAD9 was established. Electrophoretic purity of HAO could be sucessfully purified through
DEAE Sepharose CL-6B ion-exchange chromatography and Sephacryl S-100 gel filtration from its periplasm. The final purification fold was
5.79 and the yield was 39.71%. SDS-PAGE eclectrophoresis results revealed that the molecular weight of HAO in the strain LAD9 was 18.8 kD.
Studies on enzymatic properties showed that the purified enzyme could oxidize hadroxylamine to nitrite and its activity could be enhanced by the
addition of Fe2+.
Key words:  Nitrogen removal Hydroxylamine oxidase Purification Agrobacterium tumefaciens LAD9 Heterotrophic nitrification-
aerobic denitrification
Thiosphaera pantotropha［3］、Alcaligenes faecalis［4］、
Bacillus sp.［5］、Diaphorobacteria sp.［6］、Rhodococcus
sp.［7］和 Acinetobacter sp.［8］等，陆续从土壤和活性
污泥中被分离出来。通过分析参与异养硝化好氧反
硝化细菌的关键酶和功能基因来解析其代谢途径对
实现这类菌株的工程应用和新型生物脱氮工艺的开
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期70
发具有重要的指导意义。
关于异养硝化好氧反硝化细菌代谢途径尚无统
一定论，被普遍认可的途径有两种［9］：一种认为硝
化作用和反硝化作用的结合点在亚硝酸盐氮，氨氮
首先转化为羟胺，再由羟胺转化为亚硝酸盐氮，进
而经反硝化作用转化为氮气 ；另一种途径认为，氨
氮转化为羟胺后，直接被还原为气体产物，而不产
生亚硝酸盐的积累。这两条途径的根本差别在于由
羟胺氧化酶催化的羟胺转化途径的不同［10］。因此，
对于异养硝化好氧反硝化细菌代谢途径的研究核心
在于对羟胺氧化酶的研究，切实有效的羟氨氧化酶
提取方法也就成为研究异养硝化好氧反硝化代谢途
径的首要环节。但目前国内对羟氨氧化酶提取方法
和酶学特性的研究较少。
本 实 验 室 前 期 研 究 中 成 功 分 离 得 到 一 株 异
养 硝 化 好 氧 反 硝 化 细 菌， 经 16S rRNA 鉴 定 后 为
Agrobacterium tumefaciens LAD9 菌株［11，12］。本研究
建立菌株 LAD9 羟胺氧化酶分离纯化的方法，旨在
为从酶学角度研究该菌株的异养硝化好氧反硝化脱
氮过程提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 所 用 菌 株 及 其 放 大 培 养 基 本 试 验 所 用
菌 株 在 前 期 研 究 中 得 到， 经 16S rRNA 鉴 定 后 为
Agrobacterium tumefaciens LAD9 菌株，采用甘油冷冻
法于 -80℃保存。使用前采用 BIOTECH-5BG 型自动
发酵罐扩增培养，培养基组成如下（g/L）：NH4Cl 0.38；
琥 珀 酸 钠 4.78 ；KH2PO4 1.0 ；FeSO4·7H2O 0.006 ；
CaCl2·2H2O 0.2 ；MgSO4·7H2O 1.0，pH7.2-7.5。
1.1.2 试验仪器 自动发酵罐（BIOTECH-5BG，上
海保兴生物设备有限公司），数控层析柜（SL-2，北
京四环科学仪器厂），蛋白垂直电泳仪（DYCZ-24F，
北京市六一仪器厂），紫外可见分光光度计（UV-
1800，日本岛津公司），自动部分收集器（BS-100A，
上海沪西分析仪器厂）。
1.2 方法
1.2.1 HAO 的分离纯化 菌株 LAD9 的羟胺氧化酶
存在于细胞周质中［13］，因此首先提取菌株细胞周质，
以此为底物采用 DEAE Sepharose 离子交换层析初级
分离和 Sephacryl 凝胶过滤层析分离纯化得到 HAO，
对目标产物进行纯度鉴定和分子量确定。
1.2.2 细胞周质蛋白的提取 细胞周质蛋白的提取
采用渗透压休克法［14］。具体操作步骤如下 ：将 1 L
细菌发酵液在室温下离心，收集菌体，用去离子水
洗去残存的培养基成分 ；然后将其重新悬浮于 40
mL 含有 0.5 mol/L 蔗糖和 1.3 mmol/L EDTA 二钠盐的
Tris-HCl 缓冲液（20 mmol/L，pH8.0）中，室温下轻
轻震荡 15 min 后于 6 000 r/min 离心 15 min，移去上
清液 ；将沉淀重新悬浮于 40 mL Tris-HCl 缓冲液（20
mmol/L，pH8.0），室温下再次轻轻震荡 15 min 后于
4℃，15 000 r/min 下离心 20 min，上清液即为目标
细胞周质蛋白。
1.2.3 离子交换层析 将提取好的细胞周质溶液用
DEAE Sepharose CL-6B（Φ2.6×30 cm） 分 离 纯 化，
每次上样量为 8 mL。采用 5 mmol/L Tris-HCl 缓冲液
（pH8.0）和 0-80 mmol/L NaCl 线性梯度洗脱，流速 1.6
mL/min。洗脱结束后分别测定每管酶活性和蛋白质
含量，将酶活性峰部分合并，透析脱盐。
1.2.4 凝胶过滤层析 将离子交换层析得到的产
物用 Sephacryl S-100 继续分离纯化，采用 5 mmol/L
Tris-HCl 缓 冲 液（pH8.0） 进 行 洗 脱， 流 速 为 0.5
mL/min。分别测定每支收集管中酶活性和蛋白质含
量，将每个活性峰分别收集，经透析脱盐后冷冻干燥。
1.2.5 酶纯度分析及分子量测定 以 SDS-APGE 凝
胶电泳的方法确定提取物的纯度和分子量。分离胶
浓度为 10%，浓缩胶浓度为 3%。选用低分子量标
准蛋白质作为标记物，含有 6 种已知分子量标准蛋
白质，分别为兔磷酸化酶 B（97.4 kD）、牛血清白蛋
白（66.2 kD）、兔肌动蛋白（43.0 kD）、牛碳酸酐酶
（31.0 kD）、胰蛋白酶抑制剂（20.1 kD）和鸡蛋清溶
菌酶（14.4 kD）。
1.2.6 酶活测定 将所得酶液置入含 1 mmol/L 羟胺
的 Tris-HCl 缓 冲 液（12.5 mmol/L，pH8.0） 中， 在
30℃，150 r/min 培养后以亚硝酸盐氮的生成量来表
征 HAO 酶活。在上述反应体系中加入的 0.5 mmol/L
Fe2+ 来研究 Fe2+ 对羟胺氧化酶活性的影响。
1.2.7 分析方法 亚硝酸盐氮的测定采用 N-（1-萘
基）-乙二胺分光光度法。
2014年第7期 71陈倩等 ：异养硝化好氧反硝化菌株 Agrobacterium tumefaciens LAD9 羟胺氧化酶的分离纯化
2 结果
2.1 DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析
经离子交换层析后，测定每管收集液在 280 nm
下的吸光度值和 HAO 酶活得到洗脱曲线（图 1）。
结果显示，细胞周质蛋白粗酶液经 NaCl 盐梯度洗脱
分离后出现了 2 个明显的蛋白峰峰尖，其中第 2 个
蛋白峰与酶活峰重合，主要集中在第 40-55 管。收
集上述 16 管的液体进行 SDS-PAGE 电泳，结果（图
2）显示，出现了 3 条较为明显的条带，分子量分别
为 55.3、35.7 和 19.2 kD，表明该过程中得到的酶液
还含有少量其它不同分子量的杂蛋白，需要将所得
组分用其它方法进行进一步的分离纯化。
称，与蛋白峰重合。收集第一个峰所含组分（管
11-13）用 SDS-PAGE 电泳鉴定其纯度，电泳图谱
（图 4）显示，经离子交换层析和凝胶过滤层析后收
集得到的羟胺氧化酶只呈现一条带，说明已经达到
电泳纯。
60504030㇑ᮠ201000.020.040.060.08A 280nm 0.100.12 0.300.200.100.000.050.150.25 HAO䞦⍫U/L0.14 A280HAO䞦⍫
图 1 DEAE Sepharose CL-6B 阴离子交换层析洗脱曲线
Sample
97.4
66.2
43.0
31.0
20.1
14.4
kD
55.3
kD
19.2
Marker
35.7
图 2 SDS-PAGE 检测离子交换层析纯化产物
2.2 Sephacryl S-100凝胶过滤层析
离子层析产物在 Sephacryl S-100 柱上的层析图
谱及羟胺氧化酶的相对酶活力变化结果（图 3）显
示，离子层析产物进一步分离成 3 个峰，但仅有
第一个峰表现羟氨氧化酶活力，并且峰形较尖对
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
0 10 20 30 40 50 60
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3㇑ᮠA 280nm HAO䞦⍫U/LA280HAO䞦⍫
图 3 Sephacryl S-100 凝胶过滤层析
Marker
97.4
kD
66.2
43.0
31.0
20.1
14.4
18.8
kD
Sample
图 4 SDS-PAGE 检测凝胶过滤层析产物
2.3 HAO得率
羟胺氧化酶的主要分离纯化步骤及各步骤的参
数变化如表 1 所示，细胞周质蛋白粗酶液经过一系
列的纯化步骤后，最终得到了羟氨氧化酶单一组分，
其纯化倍数为 5.79，产率为 39.71%。
2.4 酶学性质
在凝胶上测量出标准蛋白质和前沿指示剂的迁
移距离，计算出标准蛋白质的相对迁移率（mR），
以标准蛋白质的相对迁移率对标准蛋白质相对分
子质量的对数作图，即可获得一条标准曲线（y=
-0.078x+5.0343，R2=0.9933），进而计算出该酶的分
子量为 18.8 kD。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第7期72
3 讨论
经过离子交换层析和凝胶过滤层析两个分离
纯化步骤，本研究获得了电泳纯度的 HAO，说明
菌株 LAD9 体内的 HAO 确实存在于细胞周质液中。
在经过第一个离子交换层析柱后，其酶活丧失了
60% 以上，说明这种酶很不稳定 ；Otte 等［15］在对
Alcaligenes faecalis TUD 的 HAO 研究中也发现其酶活
在第一个分离步骤后丧失了 80%。HAO 酶的不稳定
性可能是导致羟胺到亚硝酸盐氮的转化成为异养硝
化-好氧反硝化过程限速步骤的重要原因。
SDS-PAGE 结果表明，菌株 LAD9 体内的 HAO
分子量大小为 18.8 kD。Wehrfritz 等［13］分离纯化得
到 细 菌 Thiosphaera pantotropha 的 HAO 酶， 发 现 其
分子量为 20 kD ；Otte 等［15］采用 Western blot 分析
方法确定 Alcaligenes faecalis TUD 的 HAO 酶分子量
与 Thiosphaera pantotropha 相同，也在 20 kD 左右 ；
赵祖国等［16］通过现代分子生物学手段 RT-PCR 分析
Acinetobactor sp. YY-5 的 HAO 编码基因也发现其对
应氨基酸序列相对分子质量大小为 20.2 kD。本研究
所得 HAO 的分子量与文献报道的这类细菌的 HAO
酶分子量极为相近，说明异养硝化好氧反硝化细菌
内的 HAO 酶可能是一种分子量为 20 kD 的小分子酶。
这种特性与自养硝化细菌的 HAO 酶截然不同，传统
自养硝化细菌的 HAO 酶是一个分子量为 63 kD 的多
聚体，含有 7 个 c-血红素和一个血红素 P-460［17， 18］。
因此，异养硝化好氧反硝化细菌内的 HAO 与传统自
养硝化细菌的 HAO 酶相比，结构上可能更为简单。
铁元素是细胞色素、铁氧还蛋白和铁硫蛋白的
重要组成部分，既是氧化还原反应的载体，又是一
些酶（如脱羧酶）的辅助因子，作为电子传递链的
组成部分，对微生物的代谢有重要的影响作用。本
研究测定 HAO 酶活及其性质时，在反应体系中加
入了 Fe2+，发现菌株 LAD9 的 HAO 酶活性提高了
20%，这种特性与 Thiosphaera pantotropha 的羟氨氧
化酶性质相同。于大禹等［19］在研究异养硝化-好氧
反硝化菌异养硝化性能的影响因素时也发现 Fe2+ 对
异养硝化过程有显著地激活作用。Mior 等［18］对这
类细菌 HAO 生化性质的研究表明，异养硝化细菌的
HAO 是一个单体蛋白，含有 3-5 个非血红素和非铁
硫蛋白的 Fe 原子，并以其作为辅基。说明该类酶含
有易变铁离子并且对维持其酶活是必需的［20］，这可
能是加入 Fe2+ 能够促进 HAO 酶活的重要原因。
本研究中以亚硝酸盐氮的生成量来表征 HAO 酶
活时，测得了相应的活性，说明菌株 LAD9 的 HAO
能够在好氧条件下将羟胺氧化为亚硝酸盐氮。在自
养硝化过程中，羟胺氧化酶催化羟胺转化为亚硝酸
盐氮的过程中，分子氧未参与反应过程。对异养硝
化细菌 HAO 的代谢而言，Mior 等［18］的研究表明在
不提供分子氧的情况下，HAO 的催化产物为 N2O 而
不是亚硝酸盐氮，说明异养硝化细菌的 HAO 催化反
应过程需要分子氧的参与。也有研究表明一些异养
硝化好氧反硝化细菌的 HAO 在将羟胺氧化为亚硝酸
根的同时还能够催化亚硝酸盐与羟胺合成 N2O
［21］。
因此，需要对菌株 LAD9 的羟胺氧化代谢过程和特
性进行更为深入的研究，为从深层次上揭示其脱氮
机理奠定基础。
4 结论
本研究建立了异养硝化好氧反硝化细菌 LAD9
羟胺氧化酶的提取方法 ：首先采用渗透压休克法
提取细胞周质液，然后采用 DEAE Sepharose CL-6B
离 子 交 换 层 析 和 Sephacryl S-100 凝 胶 过 滤 层 析 进
行分离纯化。使用该方法可分离纯化出电泳纯度
的 HAO，纯化倍数为 5.79，产率为 39.71%。SDS-
PAGE 电泳结果表明，该菌株 HAO 的分子量为 18.8
kD，能够将羟胺氧化为亚硝酸盐氮，且 Fe2+ 的加入
可显著增强其酶活。
参 考 文 献
［1］Bouchez T, Patureau D, Delgenes JP, Moletta R. Successful bacterial
incorporation into activated sludge flocs using alginate ［J］.
表 1 菌株 LAD9 羟胺氧化酶的分离纯化
总蛋白（mg） 总酶活（mU） 比酶活（mU/mg） 纯化倍数 产率（%）
细胞周质蛋白 1.63 0.068 0.042 1 100
DEAE CL-6B 0.15 0.036 0.237 5.68 52.94
Sephacryl S-100 0.11 0.027 0.241 5.79 39.71
2014年第7期 73陈倩等 ：异养硝化好氧反硝化菌株 Agrobacterium tumefaciens LAD9 羟胺氧化酶的分离纯化
Bioresource Tech, 2009, 100（2）：1031-1032.
［2］Yao YC, Zhang QL, Liu Y, Liu ZP. Simultaneous removal of organic
matter and nitrogen by aheterotrophic nitrifying-aerobic denitrifying
bacterial strain in a membrane bioreactor ［J］. Bioresource Tech,
2013, 143 ：83-87.
［2］Anderson IC, Poth M, Homstead J, Burdige D. A comparison of
NO and N2O production by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas
europaea and the heterotrophic nitrifier Alcaligenes-faecalis ［J］.
Appl Environ Microbiol, 1993, 59（11）：3525-3533.
［3］Robertson LA, Kuenen JG, Kleijntjens R. Aerobic denitrification and
heterotrophic nitrification by Thiosphaera pantotropha ［J］. Antonie
Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, 1985, 51（4）：445-
445.
［4］Joo HS, Hirai M, Shoda M. Improvement in ammonium removal
efficiency in wastewater treatment by mixed culture of Alcaligenes
faecalis no. 4 and L1 ［J］. J Biosci Bioeng, 2007, 103（1）：66-73.
［5］Kim JK, Park KJ, Cho KS, et al. Aerobic nitrification-denitrification
by heterotrophic Bacillus strains ［J］. Bioresource Tech, 2005, 96
（17）：1897-1906.
［6］Khardenavis AA, Kapley A, Purohit HJ. Simultaneous nitrification
and denitrification by diverse Diaphorobacter sp. ［J］. Appl
Microbiol Biotechnol, 2007, 77（2）：403-409.
［7］Chen PZ, Li J, Li QX, et al. Simultaneous heterotrophic nitrification
and aerobic denitrification by bacterium Rhodococcus sp. CPZ24 ［J］.
Bioresource Tech, 2012, 116 ：266-270.
［8］Yao S, Ni JR, Ma T, Li C. Heterotrophic nitrification and aerobic
denitrification at low temperature by a newly isolated bacterium,
Acinetobacter sp. HA2 ［J］. Bioresource Tech, 2013, 139 ：80-86.
［9］Richardson DJ, Wehrfritz JM, Keech A, et al. The diversity of redox
proteins involved in bacterial heterotrophic nitrification and aerobic
denitrification ［J］. Biochem Soc Trans, 1998, 26（3）：401-408.
［10］黄珏 , 何义亮 , 赵彬 , 等 . Providencia rettgeri strain HNR 菌株
羟胺氧化酶超声波法提取的研究［J］. 生物技术通报 , 2008
（S1）：384-388.
［11］Chen Q, Ni JR. Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification
by novel isolated bacteria ［J］. J Ind Microbiol Biot, 2011, 38（9）：
1305-1310.
［12］Chen Q, Ni JR. Ammonium removal by Agrobacterium sp. LAD9 c
apable of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification ［J］. J
BIOSCI BIOENG, 2012, 113（5）：619-623.
［13］Wehrfritz JM, Reilly A, Spiro S, Richardson DJ. Purification of
hydroxylamine oxidase from Thiosphaera pantotropha. Identification
of electron accepters that couple heterotrophic nitrification to
aerobic denitrification ［J］. Febs Lett, 1993, 335（2）：246-250.
［14］Shaw JG, Kelly DJ. Binding-protein dependent transport of C4-
dicarboxylates in Rhodobacter capsulatus ［J］. Arch Microbiol,
1991, 155（5）：466-472.
［15］Otte S, Schalk J, Kuenen JG, Jetten MSM. Hydroxylamine oxidation
and subsequent nitrous oxide production by the heterotrophic
ammonia oxidizer Alcaligenes faecalis ［J］. Appl Microbiol Biot,
1999, 51（2）：255-261.
［16］赵祖国 , 孔庆鑫 , 王景峰 , 等 . 一种羟胺氧化酶基因序列的
PCR 扩增及其生物信息学分析［J］. 应用与环境生物学报 ,
2009, 15（1）：100-105.
［17］ 杨 航 , 黄 钧 , 刘 博 . 异 养 硝化-好 氧 反 硝 化 菌 Paracoccus
pantotrophus ATCC35512 的研究进展［J］. 应用与环境生物学
报 , 2008, 14（4）：585-592.
［18］Moir JWB, Wehrfritz JM, Spiro S, Richardson DJ. The biochemical
characterization of a novel non-haem-iron hydroxylamine oxidase
from Paracoccus denitrificans GB17 ［J］. Biochem J, 1996, 319
（3）：823-827.
［19］于大禹 , 张琳颖 , 高波 . 异养硝化-好氧反硝化菌异养硝化性
能的影响因素［J］. 化工进展 , 2012（12）：2797-2800.
［20］宋琴 , 许雷 . 异养硝化作用酶学研究进展［J］. 生物技术通报 ,
2008（5）：60-66.
［21］Robertson LA, Kuenen JG. Combined heterotrophic nitrification
and aerobic denitrification in Thiosphaera pantotropha and other
bacteria ［J］. Antonie Van Leeuwenhoek, 1990, 57（5）：139-
152.
（责任编辑 马鑫）