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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
肝素酶（heparinase）是一类作用于肝素（hepa-
rin）或者硫酸乙酰肝素（heparan sulfate）的多糖裂
解酶，已发现存在于许多种微生物中，包括棒杆菌
（Corynebacterium sp.）［1］、鞘胺醇杆菌（Sphingobac-
terium sp.）［2］、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）［3］、
环状芽孢杆菌（Bacillus circulans） ［4］、解肝素拟杆菌
收稿日期 ：2012-11-27
基金项目 ： 国家自然科学基金重点项目（20836004），中国博士后科学基金项目（20100470140），北京电子科技职业学院院内重点课题
（YZKB20-11003）
作者简介 ：李晔，女，博士，讲师，研究方向 ：基因工程药物 ；E-mail ：liyeyashi@163.com
通讯作者 ：邢新会，教授，研究方向 ：生物过程工程，环境生物技术，生物能源 ；E-mail ：xhxing@tsinghua.edu.cn
肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因 hepC 的可溶表达体系构建及
酶学性质研究
李晔1，2  吴敬君2  叶逢春2  苏楠2  张翀2  邢新会2
（1. 北京电子科技职业学院，北京 100029 ；2. 清华大学化学工程系生物化工研究所，北京 100084）
摘 要 ： 肝素酶 III（HepC）是肝素结构分析及酶法制备低分子量肝素的重要生物催化剂。为实现 HepC 在大肠杆菌中的可
溶表达，通过 PCR 方法从肝素黄杆菌（Flavobacterium heparinum）的基因组中扩增得到 HepC 基因，采用融合蛋白方法构建了麦芽
糖结合蛋白（MBP）与 HepC 融合的表达载体和体系，并在低温（15℃）下诱导重组大肠杆菌，显著提高了 MBP-HepC 重组表达
的可溶性。通过摇瓶培养发酵液的 HepC 比酶活达到 46.41 IU/mg，超过目前报道的最高水平。通过 MBP 与直链淀粉的亲和吸附实
现了 MBP-HepC 的亲和分离和纯化，一步亲和纯化后蛋白的纯度即可达 95% 以上。该融合酶基本特性研究表明，融合肝素酶 III
（MBP-HepC）的最适作用 pH7.3，最适作用温度为 42℃-48℃。热稳定性较好，其 30℃时的稳定性高于融合肝素酶 I（MBP-HepA）。
关键词 ： 肝素酶 III 麦芽糖结合蛋白 重组表达 纯化 酶学性质
Clonging and Expression of Heparinase III Gene from Flavobacterium
heparinum and Characterization of the Recombinant Fusion Enzyme
Li Ye1，2 Wu Jingjun2 Ye Fengchun2 Su Nan2 Zhang Chong2 Xing Xinhui2
（1. Beijing Polytechnic，Beijing 100029 ；2. Institute of Biochemical Engineering，Department of Chemical Engineering，
Tsinghua University，Beijing 100084）
Abstract:  Heparinase III is an important enzyme for heparin structure analysis and low molecular weight heparin production. To achieve
the soluble expression of HepC with high activity in recombinant E. coli, the heparinase III gene（hepC）from Flavobacterium heparinum was
amplified by the PCR method, and the fusion expression vector and system of expressing fusion protein of a maltose binding protein（MBP）
and HepC were constructed. The results showed that the fusion strategy by using MBP was effective to enhance solubility of the MBP-HepC
when induced at low temperature of 15℃. By shake flask cultivation, the specific enzyme activity of MBP-HepC could reach about 46.41 IU/mg,
which was the highest among the values reported so far. By one-step affinity purification with amylose resin, the MBP-HepC fusion protein was
easily purified to more than 95% purity. The enzyme characteristic study showed that the optimum pH value of MBP-HepC was 7.3, the optimum
reaction temperature was 42℃-48℃ , and the thermal stability of MBP-HepC is better than Heparinase I（MBP-HepA）at 30℃.
Key words:  Heparinase III Maltose binding protein（MBP） Recombinate expression Purification Characterization
（Prevotella heparinolytica）［5］、粪便拟杆菌（Bacteroi-
des stercoris）HJ-15［6］和肝素黄杆菌（Flavobacterium
heparinum）［7］。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是目
前商业化的唯一来源。
来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有 3 种［8］，即
肝素酶Ⅰ（EC4.2.2.7）、肝素酶Ⅱ（No EC code）和
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期134
HepC（EC4.2.2.8）。肝素酶Ⅰ主要作用于肝素，分子
量 43 kD，肝素酶Ⅱ作用于肝素和硫酸乙酰肝素，分
子量 85 kD，而 HepC 主要作用于硫酸乙酰肝素，分
子量 73 kD。肝素酶具有重要的研究意义［7，9］，包
括 ：可用于研究肝素酶及其底物多糖肝素之间的相
互作用，有助于阐明多糖裂解酶的作用机制 ；用于
解析肝素等复杂黏多糖的结构及其生物学功能 ；用
于解析人体内的凝血和抗凝血机制 ；用作临床血液
肝素化的去除，防止手术后出血 ；用于 PCR 反应前
血液制品的处理 ；用于制备低分子的抗凝血药物等。
随着研究的深入，人们发现肝素酶Ⅲ能作用于胞外
基质中的类肝素，产生具有活性的肝素小分子，其
能抑制毛细血管上皮细胞的增殖，从而抑制肿瘤细
胞的生长并且减少癌细胞的转移和扩散［10］。而该项
功能是其他两种肝素酶所不具有的，并且研究显示
肝素酶 I 反而能够促进癌细胞的增殖和扩散。因此，
肝素酶Ⅲ也可以作为药物的主要成分，用于治疗肿
瘤等疾病。
HepC 通常是从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得
的，肝素黄杆菌生产 HepC 的同时产生肝素酶Ⅰ、
Ⅱ 和 4 种 软 骨 素 酶（chondroitinase B，C，ABC，
AC），使 HepC 的分离纯化变得复杂，通常需要经过
多步的色谱纯化，收率很低。肝素黄杆菌增长速度慢，
肝素酶的生产水平低、稳定性差，而且，产肝素酶
需要价格昂贵的肝素诱导，增加了酶的成本，因而
HepC 的高效重组表达技术具有重要的研究价值。
HepC 的异源重组表达研究进展缓慢，到目前为
止，文献检索发现，只有 Godavarti 和 Su 等对 HepC
进行了重组表达，但是结果都不理想。Godavarti［11］
研究结果表明重组 HepC 的活性非常低，几乎检测
不到可溶性酶的活性，且绝大部分都以不可溶形式
存在（80%-85% 为包涵体）；Su［12］的研究中表达的
HepC 活性有所提高，但是不能进行一步纯化，致使
纯化过程复杂，不利于工业化应用。麦芽糖结合蛋
白（MBP）是大肠杆菌中依赖 ATP 转运积累麦芽糖
系统中的一个重要蛋白质，与蛋白的融合可以显著
提高蛋白重组表达的可溶性［13，14］，而且 MBP 能够
与麦芽糖和直链淀粉特异性吸附，也能与马铃薯淀
粉进行亲和分离［15-19］，从而使与 MBP 融合的蛋白
亲和分离纯化成为可能。本研究小组利用融合蛋白
技术将 MBP 融合到肝素酶Ⅰ的 N 端并通过低温诱
导显著的提高了肝素酶Ⅰ重组表达的可溶性［20］。考
虑到 HepC 与肝素酶 I 的来源、性质存在一定的相似
性，构建 MBP 与 HepC 的融合表达体系具有研究价
值。综合分析 HepC 的结构及组成特点［11］，判断在
HepC 的 N 端进行 MBP 融合将不影响该酶的活性位
点，具有实施的可行性。因此，为了实现 HepC 在
大肠杆菌中的可溶表达，本研究构建了 MBP-HepC
融合蛋白的表达载体（pMAL-hepC）和大肠杆菌表
达体系，并通过直链淀粉（amylose）树脂实现 MBP-
HepC 的一步亲和分离，并对其酶学特性进行研究，
旨在为肝素酶Ⅲ的高效生产技术研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质 粒 与 菌 株 大 肠 杆 菌［Escherichia coli
DH5α、Escherichia coli TOP10、Escherichia coli BL21
（DE3）、Escherichia coli BL21（DE3）（plysS）、Esch-
erichia coli JM109］购自北京全式金生物技术有限公
司，大肠杆菌（Escherichia coli TB1）、肝素黄杆菌
（Flavobacterium heparinum）为本实验室保存。
质粒 pMAL-c2x 购自 New England Biolabs 公司，
质粒 pMDTM19-T Simple 购自 TaKaRa 公司，pMD-19-
hepC、pMAL-hepC 为本试验构建（构建流程见图 1）。
1.1.2 培 养 基 对 大 肠 杆 菌 的 培 养 采 用 LB 培 养
基，肝素黄杆菌的培养采用 B1 培养基。LB 培养基
（L-1）：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，氯化钠 10 g，
固体培养基在此基础上再加 15 g 琼脂粉，必要时可
以往其中加入相应浓度的抗生素溶液 ；用于菌种短
期保藏、活化培养及基因工程操作。
B1 培养基（L-1）：氯化钠 3 g，牛肉膏 3 g，蛋
白胨 10 g，固体培养基在以上的基础上再加 15 g 琼
脂粉。
1.2 方法
1.2.1 HepC 基因（hepC）的克隆 将肝素黄杆菌接
入 B1 培养基中，30℃培养 48 h，菌体经离心收集
后，利用天根公司的 Bacteria DNA mini kit 试剂盒提
取基因组，并采用 Pfu DNA 聚合酶对 hepC 进行 PCR
扩 增。 以 Flavobacterium heparinum 的 基 因 组 为 模
板，根据已知的 hepC 序列设计 PCR 引物。上游引
2013年第6期 135李晔等 ：肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因 hepC 的可溶表达体系构建及酶学性质研究
物 P1F ：5-CAAAGCTCTTCCATTACCAGG-3 ；下 游
引物 P1R：5-TTACTAAGGAACCAACACAAGCTG-3。
PCR 条件筛选采用北京全式金生物技术有限公司的
2×TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMix，PCR
反应体系中加入 ：两种引物（10 μmol/L）各 1 μL，
基因组模板 50 ng，2×TransTaq（HiFi）PCR Super-
Mix 12.5 μL，最后无菌水补足至总体积 25 μL。
PCR 反应条件为 ：94℃预变性 5 min ；94℃ 60 s，
56℃ 60 s，72℃ 90 s，共 30 个循环 ；72℃延伸 10
min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，回收 PCR
扩增的 hepC 基因序列，将其与克隆载体 pMDTM19-T
Simple（TaKaRa 公司）连接，得到的重组质粒 pMD-
19-hepC，测序验证后备用。
1.2.2 MBP-HepC 融合蛋白表达用质粒 pMAL-hepC
的构建 采用 Omaga 质粒提取试剂盒提取 pMD-19-
hepC 质粒，以 pMD-19-hepC 为模板，根据 GenBank
报道的序列设计 PCR 引物，通过 PCR 获得 hepC 基因。
在 hepC 序列的两端分别设计了 BamH I 和 Pst I 酶切
位点。经双酶切后，将 hepC 序列定向插入到 pMAL-
c2x 的多克隆位点，构建得到质粒 pMAL-hepC。
1.2.3 转化子的验证
1.2.3.1 菌落 PCR 验证 将上步构建的质粒 pMAL-
hepC 转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，涂于含 100
μg/L 氨苄青霉素的 LB 抗性培养平板进行蓝白斑筛
选。37℃培养 12 h。挑选白斑并以此为模板，用引
物 P1F、P1R 进行菌落 PCR 鉴定，PCR 反应体系及
反应条件与“1.2.1”相同。反应结束后，对扩增产
物进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，以验证含转化子
的阳性克隆。
1.2.3.2 酶切验证 对重组质粒 pMAL-hepC 进行 Pst
I 和 BamH I 双酶切，0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测酶切
产物。双酶切反应体系：质粒6 μL，10×buffer 2 μL，1%
BSA 0.2 μL，Pst I 0.5 μL，BamH I 0.5 μL， 灭 菌 水
10.8 μL，总体积 20 μL。酶切条件为 ：37℃，1-3 h。
酶切结束后进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3.3 测序 将酶切鉴定后初步正确的转化克隆
交由 Invitrogen 生命技术公司，进行 DNA 测序。
1.2.4 酶活及比酶活测定 使用 232 nm 光吸收法，
底物硫酸乙酰肝素钠购自 Sigma 公司。采用上海棱
光技术有限公司的 GOLDS54 紫外可见分光光度计，
测定吸光度随时间的变化曲线。扫描波长定为 232
nm，时间为 3 min。取反应缓冲液（20 mmol/L Tris，
200 mmol/L NaCl，充分溶解后用 1 mol/L 的盐酸调节
pH 值至 7.4，4℃保存）与一定量的酶溶液共 1 000
μL，500 μL 底 物 溶 液（17 mmol/L Tris，44 mmol/L
NaCl，3.5 mmol/L CaCl2，25 g/L 硫酸乙酰肝素钠，充
分搅拌后用 1 mol/L 的盐酸调节 pH 值至 7.0，4℃保存）
于石英比色皿，混匀后立即放入分光光度计开始扫
描［21］（混匀前反应缓冲液与底物溶液均在 30℃水浴
中预热至恒温），结束后求出曲线的斜率 k（min-1），
则 HepC 酶活（IU/L）计算公式及推导过程如下。
根据比尔定律，吸光度，其中 ε=3800/M·cm［22］，
故 1 500 μL 反应体系中酶的总活力为 IU，若 1 500
μL 反应体系中加入酶溶液体积为 V（μL），则所加
酶溶液的酶活计算如下 ：
pMAL-c2x
rop
pMB l
M13 on
bh lacZa
ৼ䞦࠷
MCS
MBP
Ptac
lac 1q
6.6 kb
pMAL-c2x
rop
pMB l
M13 on
Pst IBamH I
HepC
ৼ䞦࠷
PCRᢙ໎
ተ䜘⎸ॆ
T4 DNA䞦䘎᧕
bh lacZa
Pst I
BamH I
MBP
Ptac
lac 1q
6.6 kb
pMAL-hepC
rop
pMB l
M13 ori
bla
HepC
MBP
Ptac
lac 1q
8.5 kb
图 1 重组质粒 pMAL-hepC 的构建流程示意图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期136
酶活（IU/L）=［15k（min-1）/38V（μL）］×106
比酶活即为酶活与总蛋白浓度的比值。
1.2.5 重组酶的纯化 培养菌体用反应缓冲液重悬
（重悬后菌浓为 4 g 菌体湿重 /L 左右），重悬液中加
入苯甲基磺酰氟 PMSF，使其终浓度为 1 mmol/L ；往
重悬液中加入终浓度为 0.2-0.4 mg/mL 的溶菌酶，混
匀后冰浴 30 min ；将细胞重悬液用低温超高压细胞
破碎机（JN-3000PLUS，广州聚能生物科技有限公
司）进行破碎，破碎液离心后收集上清，并用 0.22
μm 滤膜过滤后置于冰上备用 ；用 5 mL 去离子水冲
洗购自 GE Healthcare 的 MBPTrap HP（1 mL）亲和
柱，然后对上述破碎液进行融合蛋白亲和纯化，具
体操作步骤按照其说明书进行。
1.2.6 重组融合酶的酶学特性
1.2.6.1 重组酶的最适温度测定 测定重组酶最适
温度试验中，共选取了 14 个温度梯度，具体温度分
别为 21℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃、
42℃、45℃、48℃、51℃、54℃、57℃和 60℃。将
融合蛋白在以上每个梯度温度中分别测量酶活，确
定最适作用温度。
1.2.6.2 重组酶的最适 pH 测定 测定重组酶最适
pH 试验中，共选取了 10 个梯度，pH 分别为 5.8、6.1、
6.4、6.7、7.0、7.3、7.6、7.9、8.2 和 8.5。在测定酶
活过程中通过两种溶液控制反应的 pH 值，分别为 ：
反应缓冲液（20 mmol/L Tris，200 mmol/L NaCl，充
分溶解后用 1 mol/L 的盐酸调节 pH 值至以上的 10
个梯度，4℃保存）；底物溶液（17 mmol/L Tris，44
mmol/L NaCl，3.5 mmol/L CaCl2，25 g/L 硫酸乙酰肝
素钠，充分搅拌后用 1 mol/L 的盐酸调节 pH 值至以
上的 10 个梯度，4℃保存）。将融合蛋白在以上每个
pH 值下测量酶活，确定最适作用 pH。
1.2.6.3 重组酶的稳定性测定 考察 MBP-HepC 在
30℃条件下的热稳定性 ：将酶液以及酶的反应缓冲
液和底物溶液分别放到 30℃条件下保温，若干时间
后取出样品测量残存酶活，确定酶的热稳定性。
考察 MBP-HepC 在 48℃条件下的热稳定性 ：将
酶液以及酶的反应缓冲液和底物溶液分别放到 48℃
条件下保温，每分钟取出样品测量残存酶活，确定
酶的热稳定性。
2 结果
2.1 PCR验证
将 hepC 分别进行 AT 克隆后，挑选白斑并以此
为模板，用引物 P1F、P1R 进行菌落 PCR 鉴定，结
果（图 2）显示，箭头所指处为 hepC 条带，与 DNA
Marker 相比大小一致，故可初步判定所挑选的 1、2
号克隆为阳性转化子。
M ：DNA Marker ；1，2 ：HepC PCR 扩增产物
图 2 pMD-19-hepC 转化子 PCR 验证电泳图
8000
800
6000
5000
4000
10000
bp
3000
2000
1500
1000
500
2M 1
300
2.2 酶切验证
构建好的 pMAL-hepC 通过BamH I 和Pst I 双酶切
验证后进行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳，结果如图 3 所示。
2000
bp
M 1 2 3 4
M ：DNA Marker ；1 ：pMAL-hepC 表达质粒经 BamH I 和 Pst I 双酶切 ；
2 ：pMAL-hepC 表达质粒经 Kpn I 酶切 ；3 ：pMAL-hepC ；4 ：pMAL-c2x
图 3 pMAL-hepC 转化子双酶切验证电泳图
2.3 测序
测序结果在 GenBank 数据库使用 BLAST 程序进
行序列比对和分析，并使用软件 DNAMAN 对 hepC
的测序结果进行分析。序列对比分析发现，得到的
hepC 有 1 个碱基发生了变化，并导致了一个氨基酸
2013年第6期 137李晔等 ：肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因 hepC 的可溶表达体系构建及酶学性质研究
发生了变化，由原始报道的 Lys（K）变为 Glu（Q）。
本研究发现两次独立的扩增的测序结果完全一致。
2.4 重组酶的表达及纯化
结果（图 4）表明，amylose 柱能够有效地吸附
MBP-HepC 融合蛋白，通过一步亲和分离纯化，目
标蛋白的纯度即可达 95% 以上。
2.7 重组酶的最适pH测定
如图 6 所示，MBP-HepC 的最适作用 pH 为 7.3。
MBP-HepC 的最佳作用 pH 范围很窄，与此类似的是
在其他细菌中发现的肝素酶的最佳 pH 作用范围也
很窄，推断这种变化可能跟融合肽 MBP 或着 MBP
与 HepC 之间的连接肽有关。
M1 2
M ：蛋白质 Marker ；1，2 ：融合蛋白 MBP-HepC 的纯化 ；箭头所指为目标蛋白
图 4 融合蛋白 MBP-HepC 经直链淀粉树脂亲和分离图
2.5 酶活测定
目前市场上 HepC 的主要销售公司为加拿大的
IBEX 公司，所以与其 HepC 产品的酶活参数比较具
有代表性。由表 1 数据可知，重组表达并经过亲和
纯化后的 MBP-HepC 比酶活稍高于 IBEX 的产品，
超过目前报道的最高水平，产生的 MBP-HepC 酶活
为 1 776.3 IU/L 发酵液。
表 1 MBP-HepC 与 IBEX 公司产品酶活比较
酶 酶活力（IU/L） 比酶活（IU/mg）
IBEX product — 45
MBP-HepC 1776.3 46.41
20
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
Temperature℃
30 40 50 60
图 5 MBP-HepC 的最适作用温度
2.8 重组酶的稳定性测定
考虑到肝素酶的组合使用，故以肝素酶 I 的最
适 作 用 温 度（30 ℃） 为 基 础 考 察 了 MBP-HepC 在
30℃条件下的热稳定性，结果（图 8）显示，MBP-
HepC 保 存 80 h 左 右， 剩 余 酶 活 为 50% ；该 酶 的
稳定性明显优于 MBP-HepA 和融合肝素酶 II（MBP-
HepB）（28℃时 MBP-HepA 保存 2 h，剩余酶活约为
50% ；30℃时 MBP-HepB 保存 40 h 左右，剩余酶活
为 50%），因此从稳定性角度来看，MBP-HepC 最佳，
对其工业应用有利。
2.6 重组酶的最适温度测定
HepC 特异性降解硫酸乙酰肝素，故以下以硫酸
乙酰肝素为底物分析 MBP-HepC 的酶学性质。
MBP-HepC 的 最 佳 作 用 温 度 为 一 个 范 围 区 间
42℃-48℃（图 5）。然而以往的研究显示从肝素黄
杆菌中纯化的 HepC 的最佳作用温度为 35℃，过
高或过低都会影响酶活。由此可见 ：该性质 MBP-
HepC 与从肝素黄杆菌中纯化的 HepC 有很大的区别。
可能是由于融合肽 MBP 或着 MBP 与 HepC 之间的连
接肽，他们的加入使得 HepC 的最适温度发生了变化。
5.5
0
20
40
60
80
100
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
pH
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5
图 6 MBP-HepC 的最适作用 pH
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期138
结果相比，本研究获得的融合酶可溶性得到了显著
提高，发酵获得 MBP-HepC 酶活达到 1 776.3 IU/L 发
酵液，且一步纯化后得到的融合酶活性超过了目前
IBEX 产品的比酶活。
麦芽糖结合蛋白 MBP 可以与 amylose 结合，从
而吸附在 amylose 柱上，再利用亲和力更强的麦芽糖
（maltose）将 MBP-HepC 融合蛋白洗脱，利用此特性
实现 MBP-HepC 融合蛋白的亲和纯化。本研究表明
amylose 柱能够有效地吸附 MBP-HepC 融合蛋白，通
过一步亲和分离纯化，目标蛋白的纯度即可达 95%
以上，大大缩减了纯化步骤并降低了分离纯化成本。
亲和纯化酶的酶学特性研究表明，MBP-HepC
的最佳作用温度在 42℃-48℃之间，该性质与从肝
素黄杆菌中纯化的 HepC 有很大的区别 ；MBP-HepC
的最佳作用 pH 为 7.3，与从肝素黄杆菌中纯化的
HepC 略有变化（肝素黄杆菌中纯化的 HepC 的最佳
pH 为 7.6）［19］。对于导致该变化的原因目前还不清
楚，初步推断这种变化可能是由于 MBP 或着 MBP
与 HepC 之间的连接肽，他们的加入使得原始蛋白
的一些性质发生了变化。另外，融合酶的热稳定性
试验表明 MBP-HepC 热稳定性较好，但是随着温度
升高酶的稳定性降低。30℃时的稳定性远高于融合
肝素酶 I（MBP-HepA），该特性更适合应用于酶催
化反应。
4 结论
从肝素黄杆菌中有效扩增得到 HepC 的基因，
成功构建大肠杆菌表达载体 pMAL-hepC ；基因测序
发现所用到的 HepC 基因由于未知原因与文献报道
不一致，在核苷酸序列上存在 1 处差异，在氨基酸
序列上存在 1 处不同。
通过该融合蛋白表达体系实现了肝素酶Ⅲ在大
肠杆菌中 90% 以上有活性的可溶蛋白形式存在 ；大
肠杆菌 Top10（pMAL-hepC）在 37℃培养 2.5 h 后，
加 入 0.24 mmol/L IPTG， 诱 导 温 度 15℃， 生 产 的
肝素酶酶活可达 1 776.3 IU/L 发酵液，比酶活可达
46.41 IU/mg，是目前报道的最高值。通过一步亲和
纯化 MBP-HepC，蛋白的纯度可达 95% 以上。
酶学性质分析发现 ：MBP-HepC 融合蛋白的最
佳作用 pH 为 7.3，最佳作用温度为 42℃-48℃，与
0
20
40
60
80
100
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
Incubation timeh20 40 60 80 100 120
图 7 MBP-HepC 在 30℃时的稳定性
3 讨论
融合蛋白技术是构建高活性、多功能酶的重要
手段，可以根据不同目标蛋白的性质，选择不同的
伴侣蛋白进行共表达，从而避免异源表达中容易形
成包涵体的问题，同时还可以通过选择具有亲合吸
附功能的伴侣蛋白，建立融合蛋白的高效生产及分
离纯化技术，有望降低酶的生产、分离和使用成本。
具有亲合吸附能力的 MBP 是生物技术中常用的融合
连接肽之一，能与麦芽糖和淀粉分子进行特异性的
结合，与 MBP 融合能够促进外源蛋白在大肠杆菌中
的可溶表达或者提高蛋白表达量，有利于酶的工业
化生产。而且，MBP 的亲和吸附配基是麦芽糖和淀
粉，因此 MBP 融合酶在食品及医药工业应用中安全
性高。
肝素酶通常从肝素黄杆菌发酵液中提纯获得，
但该酶产量很低，需要价格昂贵的肝素的诱导，通
常需要经过多步色谱纯化，收率很低，导致肝素酶
的价格高昂。因此，肝素酶的异源重组表达是替代
肝素黄杆菌生产肝素酶的有效可行的方案。在这方
面，肝素黄杆菌的肝素酶Ⅰ是研究比较广泛的一种
酶，本研究室建立了 MBP-HepA 的高效可溶表达体
系和生产技术［20］，并解析了该融合酶的催化特性，
证明其能够用于低分子量肝素的酶法制备。与肝素
酶Ⅰ的外源表达相比，肝素酶Ⅲ的重组表达技术研
究很少，如前所述，至今只有以下两个研究小组对
其进行了研究。Godavarti 等［11］和 Su［12］对肝素酶
Ⅲ进行了重组表达，但是表达量和活性都不高，不
能实现工业化应用。本研究通过将 HepC 与 MBP 融
合表达，提高了酶的可溶性，与 Godavarti 等的试验
2013年第6期 139李晔等 ：肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因 hepC 的可溶表达体系构建及酶学性质研究
肝素黄杆菌的 HepC 不相同。MBP-HepC 的热稳定
性较好，30℃时稳定性高于本研究小组构建的 MBP-
HepA，更有利于工业应用。
致谢 ：本论文由专业建设 -战略性新兴产业相关专
业职业教育分级，PXM2012-014306-000065 项目支持。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）