全 文 ：Aug．2006
·28·
生物加工过程
ChineseJ叫mal0fBi叩IocessEngineering
第4卷第3期
2006年8月
重组大肠杆菌生产可溶性MBP
融合肝素酶的培养条件优化
叶逢春，陈 银，邢新会
(清华大学 化学工程系生物化工研究所，北京100084)
摘要：为确立肝素酶I的高效生产工艺，利用麦芽糖结合蛋白(MBP)与肝素酶I融合，洼能，通过构建相应的表达
质粒pMHs，在大肠杆菌方面实现了肝素酶工可溶性表达。通过对LB培养基摇瓶培养E．co如TBl(p删s)的诱导时
机、诱导剂用量以及添加葡萄糖、酵母提取物、乙醇、氯霉索和卡那霉素等一系列培养条件的优化，确定了该可溶性
肝素酶融合蛋白MBP_hepA的最佳生产条件。
关键词：肝素酶；大肠杆菌；麦芽糖结合蛋白；优化；可溶性表达
中圈分类号：脚．1 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)03一0028—05
Optimi硪ti蚰0f伽ltiV觚伽c伽Imti0璐0frec伽【Ibi瑚nt层．加历forpr扳I眦tion
ofsoll棚eMBP—fIlsedhepadn嬲eI
YEFeng—chun，CⅧ1NYin，XING)(in-hui
(IIlstituteofBiocheHdcalErlgineeIing，DepartrnentofChe“calEn百nee^ng，Tsin曲uaunive商ty，Beijing100084，CIlim)
Abs删：InordertoachievehighpIDductionofhep撕naseI，whichist11emostusemlenzyllleinproduction
0fⅢWH(I_owHlolecularwei曲thepaIin)，t11eplas而dpMHS稍threcorIlbinaIlthep撕naseI fusedt0dleC-
temlinalofmaltosebindingpI_0tein(MBP)wasconstnlctedandtllesolubleexpressioninE．co拓wasm lized．
BasedonnlecoIlstmctedvector，叩timizationofthecuhivationconditi叫susingLB瑚edi啪wascaniedout，in-
cludingt11einductionme，theeoneent硪ti伽oftheinducer，theadditionsof甜ucose，yeastextac ，ethanol，chlo—
mmycetin(Cm)aIldkaJlaⅡlycin(K锄)．
Keyw砌s：h印鲥nase；E．co尻；maltosebindiIlgpmt in(MBP)；叩ti商zation；solubleeXpres ion
肝素酶(hepari撇)是一类作用于肝素(heparin)
或者乙酰肝素(hepaIan鲫l】fate)分子等肝素类物质的
多糖裂解酶。从肝素黄杆菌中提取的肝素酶有肝素
酶I、肝素酶Ⅱ和肝素酶Ⅲ3种[1。3]。肝素酶具有许多重
要的医药用途，包括制备低相对分子质量肝素Hj，体
外循环中肝素的消除[5]，肝素精确结构的确定№』，制
备抗肿瘤药物[7]，抑制新血管生成及碱性成纤维细胞
生长因子介导血管内皮细胞的增殖【81等等。其中最
重要的用途是制备低相对分子质量肝素。
普通肝素(咖ndaIdh印arin，sH)作为抗凝剂和抗
血栓药物在临床上已经应用60多年，然而其使用量
大会引起出血和血小板减少等副作用，极大地限制
了肝素的临床应用拇J。低相对分子质量肝素(10w
molecularwei出th印耐n，IMWH)与SH相比，具有生
收稿日期：2006．05—15
基金项且：自然科学基金重点项目(20336010)
作者简介：叶逢春(1982．)，男，福建南平人，博士，研究方向：生物化工。
联系人：邢新会，教授，博士生导师，E-mail：xIl】【ing@tsingIlua．edu．cn
万方数据
2006年8月叶逢春等：重组大肠杆菌生产可溶性MBP融合肝素酶的培养条件优化 。29．
物利用度高、血浆半衰期长、较低的出血倾向及较少
的血小板减少症等优点，引起了人们对IMWH研究
的重视旧o。现今低分子肝素的制备方法大体上可分
为物理分离法、化学裂解法和酶法。物理分离法收
率低，不适宜工业化生产，而目前主要用于工业生产
的化学裂解法Ho反应剧烈，使肝素分子中的某些功
能基团在反应过程中或多或少地被破坏，另外也造
成了环境的污染。采用酶法制备圳wH反应条件
温和，使用固定化肝素酶降解肝素，产品和肝素酶易
于分离，生产方便，而且酶可反复使用，可进一步节
约成本H』。因此，有关肝素酶制备低相对分子质量
肝素的技术成为重要的研究课题。
在肝素黄杆菌的3种肝素酶中，对肝素酶I
(EC4．2．2．7)的研究最多。目前实际应用的肝素酶
I主要是从肝素黄杆菌发酵液中提纯而获得的，这
种方法的缺点在于肝素黄杆菌的肝素酶产量很低，
而且还需要价格昂贵的肝素进行诱导，之后通常需
要经过多步的色谱纯化，由此得到的最终收率很低；
另一方面，肝素黄杆菌在生产肝素酶I时同时还会
产生肝素酶Ⅱ和Ⅲ，这就使得肝素酶工的分离纯化
变得更加复杂。而采用大肠杆菌重组表达策略的主
要问题在于大都形成无活性的包涵体，即使实现了
可溶表达，其酶活也很低u训。
为建立肝素酶I的高效生产技术，前期利用麦
芽糖结合蛋白(MBP)与肝素酶I融合表达质粒pM．
Hs表达的MBP-hepA融合蛋白很好地解决了肝素酶
I的高效可溶性表达问题[10|。以LB培养基为基础
进行了～系列E．∞如TBl(pMHS)产可溶性肝素酶
的培养条件优化研究，为进一步发酵工艺研究提供
实验基础。
1材料和方法
1．1菌株和质粒
宿主大肠杆菌TBl由本实验室保藏。
Hs由本实验室构建完成‘1训，如图1所示。
A
HjndIII
图l质粒pMHs示意图
F．ig．1 Sketchm印0felpressionvectorpMHS
1．3培养过程
从平板中挑取昱．co!iTBl(pMHs)菌落于5mL
LB培养基中，37℃隔夜培养(12。14h)。按1％的
接种量接入含氨苄青霉素Amp(终质量浓度为100
腭／mL)的100rIlLIJ3培养基中，于37℃摇床预培养
至DD鳓约为o．600(除诱导时机优化一节)，加入诱
导剂IfrI_G转入15℃，200r 耐n诱导培养。
1．4分析方法
酶活检测采用uv232法【11|。检测的步骤如下：
取诱导培养后的菌液5n1L离心(1000r，瓶nx5
IIlin)，弃上清，向沉淀中加入pH为7．4的缓冲液5
mL重悬，并进行超声破碎；取950止缓冲液，500皿
肝素底物溶液，50皿破碎后的酶溶液于石英比色
皿，混匀后立即放入分光光度计测定吸光度随时间
变化曲线，扫描波长为232姗，时间为3耐n。由曲
线的斜率K，可以得到肝素酶酶活(Iu／L)计算公式如
下：
Cn
肝素酶酶活=等Jc×103×2
2结果与讨论
质粒pM一 2．1诱导时机对MBP-hepA表达的影响
从肝素黄杆菌中克隆出的肝素酶I基因h印A
融合在麦芽糖结合蛋白(MBP)基因的3’端，受tac启
动子调控，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(Im)
后可以诱导表达MBP-hepA融合蛋白。
1．2培养基
LB培养基(∥L)：胰蛋白胨(Tryptone)lO，酵母提
取物(YeastE)【tmct)5，NaCll0。
为确定最佳的诱导时机，在培养的不同时期加
入终浓度为O．3Imlol，L的IPTlG，转入15℃培养2l
h，检测酶活和细胞浓度，探讨不同时期加入IPIG对
肝素酶I酶活和比酶活的影响，结果如图2所示。
图2结果表明，随着诱导时刻菌浓增加，总酶活
也不断提高，但比酶活在加入的0D咖为0．1之后变
化不够明显，说明表达的融合蛋白MBP_hepA的量
基本上与终止时的菌体浓度呈正比。由于诱导剂
万方数据
·30· 生物加工过程 第4卷第3期
I眦会抑制菌体的生长，诱导时机越早，菌体生长
受抑制就越早，在培养时间内所得总酶活越低，因此
选择在菌体生长的对数生长期中后期(0．600附近)
加入诱导剂比较适宜。后续实验均在菌体DD㈣约
为0．6时加入诱导剂。表l给出不同时刻加入IPIB
的诱导菌浓和最终菌浓比较。
O线Ⅵ
一●一em胛ticactivjty；一口一splec西cem舯“acti“ly
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(n=3)
图2诱导时的菌浓对历．枷JIBlfpMHS)表达MBP-hepA酶
活影响(诱导培养时间2lh)
Fig．2ExpressionresulbofMBP-hepAinE．co{irIBl(pMHS}
underdiⅡbrentiIlitia王iIlduction
表1不同时刻加入Ⅳ眦诱导时的菌浓和21h培养后
的最终菌浓
T￡“el Di娲rentiIlitialnductionDD600出erinductionof2lh
∞‰(加I既G时的菌浓)O．028O．101O，194O．400O．6131．004
oD600(最终的菌浓)O．2621．蚴1．7663．1003．6843．828
2．2诱导剂用量对MBP_hepA表达的影响
在15℃诱导时加入不同终浓度的诱导剂
IPI．G，诱导培养20h后，比较总酶活和比酶活的变
化趋势，确定Im的最佳浓度，结果如图3所示。
图3结果表明，在诱导剂哪浓度为0．1
mmol／L之前，随着IPI．{G浓度的增加，所得到的总酶
活和比酶活迅速增加，大于0．1姗ol／L之后，总酶
活和比酶活就基本保持不变，但Im浓度大于O．5
姗ol，L时呈下降趋势，因此，确定o．1HⅡ啪l，L为摇
瓶诱导培养的适宜浓度。
2．3 LB培养基中添加葡萄糖和酵母提取物对
MBP-hepA表达的影响
葡萄糖和酵母提取物分别作为菌体生长的碳源
和氮源，添加一定量可以提高菌体的代谢活性，增加
目的蛋白MBP．h印A的表达量。另一方面，葡萄糖
添加过量时容易导致葡萄糖效应，其代谢中间产物
有可能抑制lacIIlRNA的合成，从而降低MBP-hepA
的表达量。酵母提取物添加的外源氨基酸含量过
多，除提高目的蛋白的表达外同时也会促使大肠杆
菌热休克启动子的转录，从而可能增强某些细菌蛋
白酶的合成。而葡萄糖的加入恰可以抑制这部分蛋
白酶的表达，故可能提高酶活。图4、图5分别给出
了不同葡萄糖和酵母提取物初浓度下酶活和比酶活
的变化情况。
五
蘸
＆
c(IPl。(j)／(mmoI／L)
一●一em，m撕cactivity；～口一specmcem删iactivity
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(n=3)
图3彤m浓度对E．c0矗TBl(pM】娼)表达MBnhepA酶活影
响(诱导培养时间加h)
Fig．3Expressionre“ts《MBP．hepAinE．cD如，IBl(pMHS)
wimdi任；remconcenⅡ蛳onofIPm(inductionfor20h)．
d
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占
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苗
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p(glucose)“g，L)
一●一e瑚即枷cactivity；一口一speciflcem=yInaticetivity
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(n=3)
图4 LB培养基中添加葡萄糖对E．coli，IBl(pMHs)表达
MBP_hepA酶活影响(诱导培养时闻20h)
Fig．4ExpressionresultSofMBP-hepAinE．∞如TBl(pMHS)
widldi脆rentconcentmtionofglucoseinLB(inductionfor
20h)．
∞
∞
∞
∞
∞
∞
0
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＼扫I^一_譬u11矗Il_hNlI∞3I皇ooa∞一1／n1)／营AI_譬ojIBIllAz口Q
万方数据
2006年8月叶逢春等：重组大肠杆菌生产可溶性MBP融合肝素酶的培养条件优化 ．31．
1 2 j 45 6 7 8 9 lUlI1213141516
yeastextrac以g，L)
_l—e11zyTT诅ticac““ty；—口一specmcnzylmticactiv时
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(凡=3)
图5 LB培养基中添加酵母提取物对E．∞如1’B1(pMHs)表
达MBP-}lepA酶活影响(诱导培养时间20h)
Fig．5D印渤Ie鲫ltsd1Ⅷ弛hepAinE．础‘IBl(岬)证山d畦
硒t00r删哪0f州醐瞅in璩(砌删0n妇∞h)．
图4、图5的结果表明，在培养基中添加lg／L的
葡萄糖最有利于MBP。hepA的表达。而当添加的葡
萄糖浓度过大时总酶活和比酶活都开始降低。另外，
增加培养基中的酵母提取物初始质量浓度(葡萄糖初
始质量浓度固定为1g，L)也可以提高总酶活和比酶
活，质量浓度为12．5g／L时总酶活和比酶活最高。
2．4热休克和冷休克物质对MBP．hepA表达的影响
在培养基中添加非致死量的抗生素或者乙醇等
可以引起热休克或冷休克的物质也可以提高外源蛋
白在大肠杆菌中的表达量[12‘13|。分别在LB培养基中
添加了乙醇，卡那霉素和氯霉素来比较它们对酶活及
比酶活的促进作用。实验结果如图6一图8所示。
^
主
己
蔷
：三
墓
．譬
善
雪
妒(ethan01)／％
一●一en2ymatic跗tivity；～口一specificemymat ca tiv ty
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(n=3)
图6 LB培养基中添加乙醇对E．cojiTBlIp黜s)表达MBP-
hepA酶活影晌(诱导培养时间20h}
Fig．6Bq)I髓sionregults0fMBP-he陋inE．∞菇‘fBl(pⅫ。珏)wim
diIlb唧1t删nrationofed】ardinLB{induc60nfor∞h)．
由图6～图8的结果可以看出，在IJB培养基中
添加少量的乙醇、氯霉素和卡那霉素对MBP_hepA的
表达都有一定的促进作用，但都存在最优浓度。乙醇
的最佳体积分数为l％，氯霉素的最佳质量浓度为
O．34mg，L，卡那霉素的最佳质量浓度为O．50-耐L。
虽然3者对细胞的生长均有抑制作用，以乙醇为例，
乙醇初体积分数对菌体终浓度的影响如表2所示。
可见，体积分数1％的乙醇对菌的生长没有影响。
p，(m∥L)
一一一em：yIllaticctivity；一口一spec浓cenzyTnaticac 、『ity
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(凡=3)
圈7 LB培养基中添加氯霉素对E．蒯iTBl(pMHs)表达
MBP_hepA酶活影响(诱导培养时间20hJ
Fig．7E]【pressionresult8ofMBP-hepAinE．∞矗TBl(pMHS)
w汕di雎哟ntconcenn锄ionofc}llofomycetininLB(jnduc—
tionfor20h)．
p／(mg／L)
——●一eru叮m撕ca tivity；一口一spec访ce脚叮maticactiVity
每个数据点代表3次测定结果的平均值，
偏差由3次测定值得到(n=3)
图8 LB培养基中添加卡那霉素对E．co菇TBl{pMHs)表达
MBP．}伦pA酶活影响(诱导培养时间20h)
Fig．8ExpressionresultsofMBP_hepAinE．c0眈TBl(pMHS)
wimdifreremconcentrationofc}llol_0rnvcetininI．B(induc—
tionfor20h)．
一一009Qo×一)／3一一
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万方数据
·32· 生物加工过程 第4卷第3期
表2培养基中乙醇体积分数与菌体终浓度的关系
Table2 Di自ferent0_D600afterinductionfbr21hwitlldi自ferent
concen删onofe吐瑚ol
妒(乙醇)，％ O l 2 3 4
最终的0D600值3．288 3．344 2．788 1．8501．144
已有的研究表明卡那霉素和乙醇属于可引起
热休克的物质n引。这类物质的加入会引起大肠杆
菌产生热休克反应，启动热休克基因的表达，而多数
热休克基因的产物是分子伴侣，如GmEL，GmEs，
Dn擞等[14|，这类分子伴侣有助于增加可溶蛋白的
含量，因此可以提高酶活。而氯霉素属于冷休克物
质u引，也能够表达类似的分子伴侣，因而也可以提
高外源表达的酶活。这些物质的添加效果从以上的
结果中也得到了验证。
在上述优化的培养条件下对重组菌进行培养，
结果发现：菌浓(∞锄)为1．000时加人诱导剂诱导
培养21h后，最高酶活可达4346IU，L，比酶活为
1 135IU／(L·oD600)。
3结论
从诱导剂和培养基的角度通过一系列的单因素
实验对培养E．cD反rI’Bl(pMHS)生产MBP与肝素酶
融合蛋白MBP．hepA的培养条件进行了优化，得到
了如下的结果：
(1)最佳的诱导时机是在菌体对数生长中后期
(DD鲫约为o．6)，最佳的诱导剂用量是IPm终浓度
为0．30眦nol／L。
(2)对目的蛋白MBP．hepA表达有最佳促进作
用的葡萄糖初始质量浓度1g／L，酵母提取物初始质
量浓度12．5∥L。
(3)向LB培养基中分别添加少量的热休克物
质乙醇和卡那霉素以及冷休克物质氯霉素可以提高
MBP-hepA的表达，3者的最佳值分别为乙醇1％、卡
那霉素0．50m∥L，氯霉素0．34Ⅱ19，L。
通过优化的培养条件培养E．c砒TBl(pMHs)，
得到了高活性的融合蛋白，为肝素酶I的生产和在
制备低分子肝素中的应用研究发展提供了依据。
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