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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第6期
三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国特有的淡
水珍珠蚌，其产珠质量佳，所产珍珠占全世界淡水
珍珠的 90% 以上［1-3］。近些年来，养殖三角帆蚌中
出现的产珠质量差、个体变小等一系列问题，对珍
收稿日期 ：2013-12-16
基金项目 ： 上海市高校知识服务平台项目（ZF1206），国家科技支撑计划项目（2012BAD26B04），国家自然科学基金项目（31272657），上
海市青年科技启明星（A 类）（12QA1401400），上海工程技术中心能力提升项目（13DZ2280500）
作者简介 ：韩学凯，男，硕士，研究方向 ：种质资源与遗传育种 ；E-mail ：15618062362@163.com
通讯作者 ：白志毅，男，博士，副教授，研究方向 ：种质资源与遗传育种 ；E-mail ：zybai@shou.edu.cn
三角帆蚌四核苷酸重复微卫星的开发及特征分析
韩学凯1  李家乐1，2  王照旗1  白志毅1
（1. 上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306 ；2. 上海高校水产养殖学 E-研究院，上海 201306）
摘 要 ： 用磁珠富集法和生物素标记（ATAC）5 为探针构建了三角帆蚌基因微卫星富集文库。利用 PrimerSelect 软件对得到
的微卫星序列进行引物设计并合成得到 43 对引物，初筛后发现有 20 对引物可以扩增出稳定、清晰的目的产物带。荧光标记这 20
对引物，然后用 36 只洞庭湖三角帆蚌扩增，发现 17 对引物呈现多态性。17 个微卫星位点等位基因数的范围为 6-28。期望杂合度
（He）、观测杂合度（Ho）的范围分别为 0.677 6-0.946 4、0.638 9-1.000 0。多态信息含量（PIC）在 0.630-0.929 之间。统计分析结
果显示，其中有 12 个微卫星位点满足 Hardy-Weinberg 平衡条件。与本实验室之前开发的二核苷酸重复微卫星相比，该 17 对四核
甘酸重复微卫星具有更高多态性，且更易于采用聚丙烯酰胺凝胶电泳等传统方法分析基因型，有利于节约成本，从而为三角帆蚌
群体遗传分析、亲子鉴定等技术提供了准确、价格低廉的微卫星标记。
关键词 ： 三角帆蚌 微卫星 四核苷酸重复 多态性
Development and Characteristics of Tetranucleotide Repeat
Microsatellite Loci in Hyriopsis cumingii
Han Xuekai1 Li Jiale 1，2 Wang Zhaoqi1 Bai Zhiyi1
（1. Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources， Ministry of Agriculture， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306 ；
2. Aquaculture Division，E-Institute of Shanghai Universities，Shanghai 201306）
Abstract:  A microsatellite-enriched library of the Hyriopsis cumingii was constructed using repeat-enrichment method with biotin-
labeled oligo（ATAC）5 and streptavidin coated magnetic beads. Forty-three pairs of primers designed by software PrimerSelect according to
the sequences were synthesized for the pre-screening. Twenty pairs of primers which could amplify constant and legible expected DNA products
were labeled by fluorescence. Seventeen microsatellite loci showed high levels in genetic polymorphism testing on 36 individuals sampled from
Dongting Lake. The number of alleles at each locus ranged from 6 to 28. The expected and observed heterozygosities varied from 0.677 6 to
0.946 4 and from 0.638 9 to 1.000, respectively. The PIC value ranged from 0.630 to 0.929. Twelve microsatellite loci fitted to Hardy-Weinberg
equilibrium. Compared with the previous dinucleotide repeat microsatellite developed in our laboratory, these 17 tetranucleotide repeat
microsatellite loci showed higher polymorphism. Also, these 17 microsatellite loci can make genotyping easier by conventional methods such as
polyacrylamide gel electrophoresis and save cost. Therefore, it offered accurate and inexpensive microsatellite markers for population genetic
analysis and paternity test in Hyriopsis cumingii.
Key words:  Hyriopsis cumingii Microsatellite Tetranucleotide repeat Polymophism
珠的产量和效益都造成较大的影响［4］。因而筛选培
育抗逆性好、生长性状佳、产珠质量优的品种，促
进三角帆蚌养殖业持续健康发展，是目前三角帆蚌
遗传育种研究的主要方向。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期140
由于微卫星的突变率高，可产生大量多态性丰
富的位点，如今已作为一种良好的分子标记广泛应
用于个体识别、种质资源鉴定、生物遗传作图、遗
传多样性分析等方面的研究［5，6］。关于贝类微卫星
开发与应用研究，国外已见较多报道［7-10］，国内对
淡水贝类如三角帆蚌［11-14］、背瘤丽蚌（Lamprotula
leai）［15］、 褶 纹 冠 蚌（Cristaria plicata）［16］ 和 背 角
无 齿 蚌（Anodonta woodiana）［17］ 的 微 卫 星 研 究 也
逐渐开展起来。但目前国内淡水贝类开发的微卫星
标记主要是双核苷酸重复微卫星，用传统银染法检
测 PCR 产物时，扩增产物常常会出现影子带，对
于 PCR 产物长度的正确分析干扰较大。研究人类基
因组发现，四碱基重复微卫星序列具有丰富的多态
性，易于 PCR 扩增，具有明显的等位基因差异，极
少出现影子带［18］，故分型效果较二核苷酸微卫星要
好。鲁翠云等［19］研究鲤鱼（Cyprinus carpio）后发现，
在黑龙江鲤野生群体中，四核苷酸重复的微卫星标
记表现出的多态性水平高于双核苷酸重复。同样，
谭照君等［20］在研究鲢鱼（Hypophthalmichtysmolitrix）
中不同核苷酸重复微卫星特征时，发现四核甘酸重
复微卫星不但多态性更高，而且遗传稳定性更好，
更加适合作为种群分析的工具标记。在我国特有淡
水贝类三角帆蚌中，四核苷酸重复微卫星是否同样
具有高度多态性及其特征如何，还未见到有关研究
报道。本研究通过生物素标记的微卫星探针获得并
筛选一些三角帆蚌四核苷酸重复微卫星位点，通过
对其多态性初步分析，以期为三角帆蚌群体遗传分
析、亲子鉴定技术、种质资源的保护等研究提供更
多高质量的微卫星分子标记。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用在洞庭湖采集到的三角帆蚌野生群
体作为试验样本。
1.2 方法
1.2.1 三角帆蚌基因组 DNA 的提取及富集文库的构
建 取三角帆蚌外套膜组织作为提取材料，用苯酚-
氯仿提取法提取其基因组 DNA。基因组 DNA 的酶
切和富集文库的构建主要参照罗明等［14］和 Li 等［21］
的方法。用 Rsa Ⅰ内切酶进行三角帆蚌基因组 DNA
的酶切，用试剂盒回收 200-1 000 bp 大小的片段用
于文库构建。微卫星序列的富集采用生物素标记的
（ATAC）5 探针，具体操作步骤与罗明等
［14］所述相同。
1.2.2 微卫星引物设计 先用 Sequencher 软件去除
载体及接头后，再使用 SSRhunter 软件来查找其中
微卫星位点，之后用 GeneQuest 软件查找并去除冗
余序列。最后用 PrimerSelect 软件在微卫星序列上进
行引物设计。
1.2.3 多态性微卫星引物的初筛及荧光标记引物分
析 引物设计好后，首先送上海迈浦生物科技有限
公司合成普通引物，然后用 3 个三角帆蚌的基因组
DNA 作为模板来初筛这些引物。经 PCR 扩增反应后，
用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测分析扩增产物，从中挑
选能够稳定扩增出条带且与设计引物片段大小相符
的引物，经初步筛选的引物用来合成 5 上游荧光引
物（FAM、HEX）。从洞庭湖中采集 36 只野生三角
帆蚌，取每只蚌的外套膜组织进行基因组 DNA 提取。
用荧光引物对 36 个模板 DNA 进行 PCR 扩增，扩增
后的荧光 PCR 产物送上海迈浦生物科技有限公司进
行 STR 测序分析。
1.2.4 数据分析 用 GeneMapper v4.0 软件对公司送
来的基因组扫描结果进行分析并估算等位基因大小，
利用 PopGen32 软件计算以下参数：等位基因数（N）、
有效等位基因数（A）、观测杂合度（Ho）、期望杂
合度（He），并进行 Hardy-Weinberg 平衡检测（HWE）。
用 Cervus 软件来分析多态信息含量（PIC）。
2 结果
2.1 多态性引物的设计与筛选结果
用 Sequencher 软件去除接头及载体序列后，利
用 PrimerSelect 设计并合成引物 43 对。用 3 个三角
帆蚌的基因组 DNA 为模板对这 43 对引物进行初步
筛选，PCR 扩增产物经过 2% 琼脂糖凝胶电泳检测
得到 20 对稳定扩增、条带清晰并且大小相符的引
物。对这 20 对引物的 5 上游荧光引物分别用 FAM
和 HEX 两种荧光基团来修饰，用 36 只洞庭湖野生
三角帆蚌个体对合成的 20 对荧光引物进行 PCR 扩
增。用 GeneMapper v4.0 软件对公司送来的基因组扫
描结果进行分析后显示，合成的 20 对引物中 17 对
均具有良好的多态性（引物信息见表 1），并对这 17
2014年第6期 141韩学凯等 ：三角帆蚌四核苷酸重复微卫星的开发及特征分析
对引物多态性进行深入评价。
2.2 微卫星多态性引物对群体遗传评估分析
用 PopGen32 软件对这 17 对引物扩增的产物进
行多态性评价分析，结果（图 1）显示扩增产物大
小在 163-438 bp 之间，17 个微卫星位点等位基因
数变动范围为 6-28，平均每对引物获得等位基因数
为 17.52，其中位点 Hcuca301 获得等位基因数最少，
仅为 6 个，位点 Hcuga726 获得等位基因数最多，为
28 个，有效等位基因数在 3.014 0-14.982 7 之 间，
平均值为 9.365 8，Ho 在 0.638 9-1.000，平均值为
0.833 3 ；而 He 在 0.677 6-0.946 4 之间，平均值为
0.877 9。用 Cervus 软件来分析多态信息含量，多态
信息含量 PIC 在 0.630-0.929 之间，平均值为 0.853 1。
经 Hardy-Weinberg 平衡检测显示，17 个微卫星位点
中有 12 个满足 Hardy-Weinberg 平衡条件（P>0.05）。
17 个微卫星位点多态性统计数据见表 2。
3 讨论
虽然近些年微卫星标记在水产动物中得到大
表 1 三角帆蚌 17 个微卫星位点的核心序列及其引物特征
位点 荧光基团 引物序列（5-3） 核心序列 退火温度（℃） 片段大小（bp）
Hcuca0276 HEX F ：ACCACGACCCAGGAAAACTG （TGTA）10N（TGTA）11 60 395
R ：ACATGCAAACAAGCAAGCACA
Hcuca0301 FAM F ：TGGAGGCGATACGTATGTTACTA （ATAC）7 55 274
R ：ATGCCTTTGGACACTCATTTACT
Hcuca0323 HEX F ：GTGCCACTGAACCACAGACACA （ATAC）7 55 293
R ：AACGGAGCATGCTATAGTGAGGTC
Hcuca0325 HEX F ：AAAGAGATTTTCATGGTCATAGAT （GATG）7N（TGGA）7 50 204
R ：ATTGTGCGTTTTCATAATAATAAA
Hcuca0333 HEX F ：AATTTAAAAAGATGGGATGCTTAT （GTCT）7N（TC）10（AC）10 50 367
R ：ACGATCATAGGGTTTTAGTATTA
Hcuca0340 HEX F ：AACCGTCAGGCAGGCAGTCA （TATC）15 55 301
R ：TTTCCATTCCGTATTCCAGTCTCA
Hcuca0414 FAM F ：GTTTCTGAAAATGTTGGCATAAAT （AC）14（ATAC）7 50 288
R ：ATCGCCCACTATACTTAAAATGAA
Hcuca0416 HEX F ：ATCCATCCATCCATCCATCCAC （ATAC）10 60 296
R ：TTTAGGCTGTGTTAAGGGGTGTCA
Hcuca0726 HEX F ：TAGGCGCTATGGAAAGTCTTCATT （TATG）15N（TGTA）7 55 267
R ：AGCATACTCGGAGGGTAATAACGA
Hcuca0814 FAM F ：GTCGGCCTTGTGTCAGGATAATGG （CA）11N（ACAT）11 55 354
R ：TAAGCCTGCACAGCCAGACCAGAC
Hcuca0889 HEX F ：ACCAGGATGAGGGTCAAACT （CATA）12 60 387
R ：AAGCAAATACAACCGTCACG
Hcuga0394 HEX F ：ATGGGGAAGGTAGAATGGAT （AG）23N（AGAT）11 55 213
R ：TCGAGTTTACTGGGGAAGAA
Hcuga0398 FAM F ：ATGCGAGAATCATTATGTCACAAC （ACAT）8N（GA）20 55 341
R ：CCACAGCGTTTATATTTCGTATGA
Hcuga0431 FAM F ：CGGCTGCGGTTGACTCTTA （AGAA）8 55 289
R ：CGTGGTTGTTCGCTATCTGTTC
Hcuga0632 FAM F ：ATGGGGCTGCATTTATGTCCTACA （GTAT）9 55 205
R ：TGACGCCATTTTACGGCACAC
Hcuga0812 FAM F ：GCTTGCAAATGAAATCTCCTA （GATT）9 55 284
R ：TGATAGCACTTTCCGTTCTGT
Hcuga0896 HEX F ：GCCATGCAATTAGGGAGTA （TACA）12 55 428
R ：TCATTAGAAAACGGGGATTAT
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第6期142
量开发和应用，但是目前多数水产动物开发的微卫
星标记多为双核苷酸重复。在有关人类二核苷酸重
复微卫星研究中，发现 PCR 产物常常会出现比主
带小 2 bp 的影子带［22，23］。本实验室利用二核苷酸
重复微卫星开展三角帆蚌种质资源评价及其育种工
作中也发现同样问题。研究发现，多核苷酸重复微
卫星标记可以减少扩增产物中“影子带”的出现，
比二核苷酸重复序列遗传稳定性更高且扩增更忠
实［24］，故基因分型效果较二核苷酸微卫星要好，且
更易于采用聚丙烯酰胺等传统方法分析基因型。目
前国内四核苷酸重复微卫星标记在水产动物中开发
应 用 较 少， 仅 见 鲤 鱼（Cyprinus carpio）［19］、 鲢 鱼
（Hypophthalmichtysmolitrix）［20］、方正银鲫（Carassius
auratus gibelio Bloch）［25］、 草 鱼（Ctenopharyngodon
idellu）［26］中有相关研究，而淡水贝类中关于四核
苷酸的开发与研究却鲜有报道。而随着磁珠富集法
的发展和完善，四核苷酸重复的微卫星筛选比例得
到提高，并逐渐被开发应用。本研究通过构建三角
帆蚌 ATAC 四核苷酸重复的富集文库，从中筛选和
开发出 17 对四核甘酸重复微卫星标记用于研究。
多态信息含量（PIC）可以较好地反映片段的
多态性和遗传信息含量。在一个群体中，多态信息
含量高低与其提供的遗传信息多少成正比［27］。参
照 Botstein 等［28］提出的衡量多态信息含量大小的指
标，本研究中的 17 个微卫星位点的 PIC 在 0.630-
0.929 之间，平均值为 0.828 2，PIC 值均大于 0.5，
为高度多态性位点，表明筛选微卫星位点多态性信
息含量丰富。本实验室罗明等［14］曾用 20 对微卫星
引物对洞庭湖野生三角帆蚌进行了遗传评估，本研
究与其所用的洞庭湖样本为同一群体，并采用相同
的分析方法，不同的是本研究使用的是四核甘酸重
复微卫星，因此可以通过对两者结果进行对比，反
映出双核苷酸重复与四核苷酸重复微卫星标记在多
态性和遗传多样性评价方面差别（表 3）。比较发
现，本研究的四核苷酸重复微卫星多态信息含量
（PIC=0.853 1）高于罗明用双核苷酸重复在同一群体
中得到结果（PIC=0.823 9）。同样，与许巧晴等［13］
用 13 个双核苷酸重复标记对洞庭湖野生三角帆蚌的
表 2 三角帆蚌 17 个微卫星位点的遗传参数
GenBank 登录号 位点
观测等位
基因数（N）
有效等位
基因数（A）
观测杂
合度（Ho）
期望杂
合度（He）
HWE 检验
概率值
多态信息
含量（PIC）
KF886685 Hcuca0276 19 12.5825 0.8889 0.9335 0.4418 0.915
KF886686 Hcuca0301 6 3.0140 0.7778 0.6776 0.1465 0.630
KF886687 Hcuca0323 15 9.0947 0.9722 0.9026 0.2042 0.881
KF886688 Hcuca0325 21 14.9827 0.9722 0.9424 0.9581 0.929
KF886689 Hcuca0333 12 6.8031 0.8333 0.8650 0.0791 0.838
KF886690 Hcuca0340 17 7.3846 0.6389 0.8768 0.0000 0.851
KF886691 Hcuca0414 22 11.5714 0.9722 0.9264 0.5731 0.908
KF886692 Hcuca0416 21 5.8909 0.7222 0.8419 0.0000 0.821
KF886693 Hcuca0726 28 13.5707 0.7778 0.9394 0.0916 0.922
KF886694 Hcuca0814 15 8.9689 0.8056 0.9010 0.0594 0.879
KF886695 Hcuca0889 13 5.7945 0.5000 0.8389 0.0000 0.808
KF886696 Hcuga0394 23 10.7552 0.9167 0.9198 0.0718 0.901
KF886697 Hcuga0398 22 14.7273 0.9444 0.9452 0.2154 0.928
KF886698 Hcuga0431 8 3.0968 0.7500 0.6866 0.9969 0.633
KF886699 Hcuga0632 13 6.6804 1.0000 0.8623 0.0035 0.835
KF886700 Hcuga0812 25 13.2245 0.9167 0.9374 0.9899 0.920
KF886701 Hcuga0896 18 11.0769 0.7778 0.9225 0.0076 0.903
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M
404
bp
353
242
M ：分子量标记（pUC18 DNA/MspI）；1-17 ：引物 Hcuca0340 的扩增结果
图 1 引物 Hcuca0340 在部分个体的扩增结果
2014年第6期 143韩学凯等 ：三角帆蚌四核苷酸重复微卫星的开发及特征分析
表 3 不同类型核心序列的微卫星对洞庭湖三角帆蚌的评估效果比较
重复序列类型 座位数目 等位基因数 有效等位基因数（A） 期望杂合度（He） 多态信息含量（PIC） 数据来源
四核苷酸 17 17.52 9.3658 0.8779 0.8531 本研究
双核苷酸 20 11.45 6.5822 0.8239 0.7864 罗明［14］
研究结果（PIC=0.519 8）相比，本研究四核苷酸重
复微卫星评价的群体多态性也明显高。有效等位基
因数反映了群体中等位基因的分布均匀度，而杂合
度可以反映群体中遗传多样性高低。本研究 17 个微
卫星位点在洞庭湖三角帆蚌野生群体扩增到的有效
等位基因数（A=9.365 8）和期望杂合度（He=0.877 9）
两项群体遗传多样性评估指标均高于罗明等用双
核 苷 酸 重 复 在 同 一 群 体 得 到 的 结 果（A=6.582 2，
He=0.823 9），表明四核甘酸重复评价的群体遗传多
样性更高，遗传变异更大。与罗明和许巧晴研究结
果相比，虽然本研究所用样本量稍多，但总体可以
判断在三角帆蚌中四核苷酸重复微卫星多态性水平
高于二核苷酸重复微卫星。此结果与谭照君等［20］
通过研究鲢鱼和鲁翠云等［19］研究鲤鱼后得出结论
相似。四核苷酸重复的微卫星多态性更高可能是真
核生物中四核苷酸重复多存在于非编码区，在生物
进化过程中承受的选择压力较小，因而可以较为“自
由”突变的缘故［29］。
对 17 个微卫星位点进行 Hardy-Weinberg 平衡
检测，发现其中有 5 个位点偏离了平衡，这可能是
杂合子缺失或研究采用样本较少等缘故，这种情况
在研究二核苷酸重复微卫星时也经常出现，属合理
现象。选取本研究中开发的几对四核甘酸重复微卫
星进行 PCR 扩增，通过传统银染法来检测 PCR 产
物，发现扩增带谱清晰，“影子带”出现较少。这与
Edwards 等［18］研究人类中四核甘酸重复微卫星特征
所得结果相一致。因此本研究开发的四核甘酸微卫
星可作为理想的分子标记。
4 结论
本研究开发的 17 对四核苷酸重复的微卫星标
记，不但具有高度的多态性，而且是较二核苷酸重
复微卫星更为高效的分子标记，可以在不采用 SSR
荧光标记分析技术，节约成本情况下，用传统非荧
光电泳检测方法同样取得较好效果，能够为三角帆
蚌群体遗传分析、亲子鉴定技术等研究提供廉价、
准确的分子标记，是很好的微卫星资源。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）