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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
随着经济社会的快速发展，我国工农业和生活
污水中的氨氮含量逐年增加，如果处理不当，会导
致各种环境和健康问题［1］。废水脱氮是水环境治理
的主要手段，生物脱氮是目前应用广泛且经济效益
较高的脱氮方法。异养硝化是指异养微生物在好氧
条件下将氨氮或是还原态有机态氮氧化到羟胺、亚
硝酸盐和硝酸盐的过程［2，3］。异养硝化细菌具有生
长速率快，细胞产量高［4］，需要的溶解氧浓度低，
能忍受酸环境［5-7］等优点，异养硝化作用日益受到
关注。
收稿日期 ： 2013-07-05
作者简介 ：郑丽侠，女，硕士研究生，研究方向 ：废水生物处理 ； E-mail ：zhenglixiahappy@163.com
通讯作者 ：张大伟，男，副教授，硕士生导师，研究方向 ：废水生物处理 ；E-mail ：daweizhang@sohu.com
一株异养硝化细菌的分离鉴定及紫外诱变育种
郑丽侠  张大伟
（齐鲁工业大学食品与生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，济南 250353）
摘 要 ： 以活性污泥为主要来源，筛选得到一株具有硝化作用的异养型细菌 N18，对其 16S rDNA 进行测序分析，确定 N18
为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。以 70%-80% 致死率为紫外诱变条件，经高浓度氨氮（15 g/L）培养基初筛得到 8 株突变株，以
脱氮效率为复筛指标，得到一株氨氮去除率最高的突变株 NF34。经过 72 h 培养，突变株 NF34 氨氮去除率达到 85.06%，比诱变前
菌株 N18 提高了 11.99%，初始氨氮浓度分别为 100、200 和 500 mg/L 时，脱氮率分别提高了 6.14%、11.49%、10.75%，在此过程中，
亚硝态氮积累量较小，证明诱变也是获取高活性硝化细菌的有效手段。
关键词 ： 生物脱氮 异养硝化作用 假单胞菌 紫外诱变
Isolation and Identification of a Heterotrophic Nitrifying Bacterium and
Its Mutation Breeding by UV-irradiation
Zheng Lixia Zhang Dawei
（Key laboratory of Microbial Engineering of Shandong Province，Food and Bioengineering Department of Qilu
University of Technology，Ji’nan 250353）
Abstract:  A strain of heterotrophic nitrification bacteria named N18 was isolated from activated sludge of fermentation wastewater
treatment using heterotrophic nitrification medium, and identified as Pseudomonas sp. according to the analysis of its16S rDNA gene. By UV-
irradiation and 8 mutants was selected by high concentration of （NH4）2SO4 medium, and a mutant NF34 with highest rate of NH4
+-N removal
was obtained. Studied on its function of heterotrophic nitrification, the result showed that the rate of NH4
+-N removal of strain NF34 was 11.99%
higher than the original strain N18, the nitrification rate of different initial ammonia concentration 100, 200, 500 mg/L were 6.14%, 11.49%,
10.75% higher than the original strain, respectively. Little nitrite accumulated during nitrifying process. It proved that UV-mutation is an
effective means to obtain nitrifying bacteria with highly nitrification activity.
Key words:  Biological nitrogen removal Heterotrophic nitrification Pseudomonas sp. UV-irradiation
目前，异养硝化细菌的筛选常采用选择性富集、
分离的方法，陈威［8］等人利用亚硝化细菌分离培养
基从湿地浅层底泥中分离到一株异养硝化细菌，初
步鉴定为 Micrococcus sp.，经 8 d 的好氧培养，对铵
态氮去除率为 49.2%。刘芳芳等［9］通过富集、分离
和纯化等步骤从养殖废水中分离筛选了 4 株具异养
硝化功能的粪产碱杆菌，振荡培养 48 h 氨氮去除率
分别达到 44.4%、47.9%、61.3% 和 56.4%。本研究
以高浓度氨氮培养基作为筛选条件，对从活性污泥
中筛选得到的异养硝化菌株 N18 进行紫外诱变处理，
2013年第12期 185郑丽侠等 ：一株异养硝化细菌的分离鉴定及紫外诱变育种
旨在选育高效脱氮菌株，为实际废水脱氮处理提供
理论依据和有效菌种。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源 活性污泥取自青岛根源生物技术
集团有限公司发酵废水处理系统好氧池。
1.1.2 培 养 基 ① 异 养 硝 化 培 养 基（/L）［12］：
（NH4）2SO4 1.0 g，丁二酸钠 2.17 g，维氏盐溶液 50 mL，
加水溶解，补充蒸馏水至 1 L，固体加琼脂 15 g，pH
7.0。维氏盐溶液（/L）：K2HPO4 5.0 g，MgSO4·7H2O
2.5 g，NaC1 2.5 g，MnCl2·4H2O 0.05 g，FeSO4 0.05 g，
加水溶解后定容至 1 L。② 诱变筛选培养基（/L）：
（NH4）2SO4 75.0 g，丁二酸钠 2.17 g，加水溶解，补
充蒸馏水至 1 L，固体加琼脂 15 g，pH7.0。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离筛选 称取 5 g 新鲜活性污泥接
种到装有 100 mL 无菌异养硝化培养基的 250 mL 锥
形瓶中，30℃、150 r/min 连续富集培养 3 d 后，取 5
mL 菌悬液接种至新鲜培养基中，如此重复 3 次后将
富集培养液经多次平板涂布分离，获得 20 株较纯菌
株。将这 20 株菌株分别以 1% 的接种量接种于 100
mL 无菌异养硝化培养基中，30℃、150 r/min 振荡培
养 48 h，测定 20 株菌株的 NH4
+-N 去除率，确定脱
氮效果最好的一株菌株进行后续试验。
1.2.2 菌株分子鉴定 利用细菌小剂量 DNA 提取试
剂盒提取待鉴定菌种的基因组 DNA，并进行 PCR 扩
增。引物为细菌通用引物 27f 和 1492R［13］，由上海
生工生物工程有限公司合成。27f 序列为 ：5-AGAG-
TTTGATCCTGGCTCAG-3 ；1492R 序列为 ：5-GGTT-
ACCTTGTTACGACTT-3。将菌株 16S rDNA 序列 PCR
产物交由济南力戈公司测序，利用 BLAST，将测序
结果与 Interent 上 GenBank 中有关序列进行同源性
分析。
1.2.3 紫外诱变试验
1.2.3.1 最佳诱变时间的确定 将菌株活化后，用
生理盐水制成菌悬液，调整细胞浓度约 108 CFU/mL。
取 5 mL 菌悬液移入直径 90 mm 的无菌培养皿中，
30 W 紫外灯下 15 cm 处分别照射 0、5、8、10、15、
20、30、60 s，在红灯下取各菌悬液 1 mL 进行 10 倍
系列稀释，取稀释度为 10-4 的菌液各 0.1 mL 均匀涂
布在 LB 平板上，每个时间 3 个平行。30℃避光培
养 24 h 后记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。
1.2.3.2 最佳（NH4）2SO4 浓度的确定 为了快速筛
选出硝化能力强的菌株，同时排除不耐受高氨氮的
菌株来减少后续筛选的工作量，采用高浓度硫铵培
养基对菌株进行初筛。配制（NH4）2SO4 浓度分别
为 0.5、1、2、5、8、10、12、15、20 g/L 的诱变筛
选培养基，将培养至对数期的菌液进行梯度稀释，
取稀释度为 10-6 的菌液 0.1 mL 涂布于各个浓度的筛
选培养基平板上，每个浓度 3 个平行，于 30℃培养
48 h，记录不同培养时间的菌落生长情况。
1.2.3.3 紫外诱变及正突变菌株的筛选 初筛 ：按
1.2.3.1 的方法进行紫外照射，将照射之后的菌悬
液全部转入 100 mL 无菌诱变筛选液体培养基中，
30℃、150 r/min 培养至稳定期，取 1 mL 菌悬液稀释
10 倍后均匀涂布在诱变筛选平板上，30℃避光培养，
挑取优先长出的菌落进行复筛。复筛 ：将初筛菌株
和原菌株 N18 按 1% 的接种量接入 100 mL 无菌异养
硝化培养基中，30℃、150 r/min 振荡培养 48 h。测
定培养液的 NH4
+-N 去除率，从中筛选出硝化能力明
显比原菌株 N18 高的正突变菌株。
1.2.4 正突变菌种的脱氮活性 将正突变菌株和原
菌株分别以 1% 的接种量接入 100 mL 无菌异养硝化
培养基中，30℃、150 r/min 振荡培养 72 h。每隔 12
h 测定培养液的 NH4
+-N、NO2
--N 的含量。
1.2.5 分析检测方法 NH4
+-N：纳氏试剂光度法［14］；
NO2
--N ：N-（1- 萘基）- 乙二胺分光光度法［14］；细
胞内氮 ：测定培养液中菌体细胞干重，计算含氮量。
氨氮去除率（%）=（初始氨氮含量 - 某一时刻
的氨氮含量）/ 初始氨氮含量 ×100% ；
脱氮率（%）=（初始氨氮含量 - 剩余氨氮含量 -
细胞内氮）/ 初始氨氮含量 ×100%。
2 结果
2.1 菌株的筛选
经过富集和分离，获得在异养硝化培养基上生长
良好的菌株 20 株，编号为 N1-N20。将这 20 株菌株
接种到异养硝化培养基内，48 h 后测定 NH4
+-N 去除
率，共得到 8 株 NH4
+-N 去除率在 50% 以上的菌株，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期186
其中菌株 N18 的 NH4
+-N 去除率最高，达到 60.32%
（图 1），故选定 N18 作为供试菌株进行后续研究。
菌属。
2.2 最佳诱变条件的确定
选取 30 W 紫外灯进行诱变照射，照射距离为
15 cm，当照射时间为 8 s 时，致死率为 74.29%（图
3）。因此，确定 8 s 为最佳照射时间。
0
10
20
30
40
50
60
70
N1 N7 N8 N12 N13 N14 N18 N20㧼Ṛ
N
H
4+
-N
৫䲔
⦷%

图 1 不同菌株 NH4
+-N 去除率的比较
2.2 菌株的鉴定
2.2.1 形态学观察 菌株 N18 在固体平板上，菌落
形态圆形，浅黄色，中心突起，表面褶皱，边缘呈
锯齿状。单个细胞成短杆状，革兰阴性（图 2）。
图 2 菌株 N18 菌落形态及单细胞形态
2.2.2 生理生化鉴定 生理生化鉴定结果如表 1 所示。
表 1 菌株 N18 的生理生化功能鉴定
鉴定指标 鉴定结果 鉴定指标 鉴定结果
革兰染色 - 明胶液化试验 -
接触酶试验 + 产吲哚试验 -
氧化酶试验 + 硝酸盐还原 +
淀粉水解 - 反硝化 -
油脂水解 + 尿素水解试验 +
葡萄糖 + 需氧性试验 好氧
甲基红 - 柠檬酸盐利用
试验
+
+ ：阳性 ；- ：阴性
2.2.3 分子生物学鉴定 对菌株 N18 的 16S rDNA 序
列进行测序，得到长度为 1 376 bp 的序列。测序结
果经 NCBI Blast 检索比对，与 Pseudomonas sp.MBE-
B29（登录号：AB733537.1）、Pseudomonas sp.JF2（登
录号 ：JX007944.1）等多株假单胞菌 16S rDNA 的对
应序列相似度在 99% 以上，初步鉴定 N18 为假单胞
0
20
40
60
80
100
0 5 8 10 15 20 30 60➗ሴᰦ䰤s
㠤↫
⦷%

图 3 照射时间与致死率的关系曲线
2.3 筛选培养基氨氮浓度的确定
表 2 记录 9 个不同（NH4）2SO4 浓度平板在不
同时间的生长情况。表 2 结果显示，提高培养基
（NH4）2SO4 浓度，可增加对目的菌株的生长抑制作
用。当（NH4）2SO4 浓度达到 15 g/L 和 20 g/L 时，经
过 48 h 的培养，均未见明显菌落，但（NH4）2SO4 浓
度为 20 g/L 时，平板絮状沉淀明显，影响菌落观察，
选择筛选培养基的（NH4）2SO4 浓度为 15 g/L。
表 2 不同（NH4）2SO4 浓度下菌株 N18 的生长情况
培养时间（h）
（NH4）2SO4 浓度（g/L）
0.5 1 2 5 8 10 12 15 20
12 + + + + — — — — —
24 + + + + + + — — —
36 + + + + + + + — —
48 + + + + + + + — —
+ ：肉眼可见 ；— ：肉眼不可见
2.4 正突变菌种的筛选
诱变后的菌悬液，经过 96 h 富集培养后，生
长达到稳定期。表 3 数据表明，通过高浓度硫铵平
板 48 h 筛选培养，初筛得到 8 株高浓度氨氮耐受菌
株。对 8 株菌株的氨氮去除率进行比较，得到 2 株
为正突变菌株，其中 NF34 的脱氮能力最强，48 h
NH4
+-N 去除率达到 70.85%，比诱变前菌株 N18 高
了 10.53%。
2.5 正突变菌株的硝化能力
以 诱 变 前 原 始 菌 株 N18 为 参 照， 对 突 变 株
2013年第12期 187郑丽侠等 ：一株异养硝化细菌的分离鉴定及紫外诱变育种
NF34 的硝化性能进行测定，图 4 结果表明，两株菌
株的生长趋势和氨氮下降趋势基本一致，异养硝化
过程主要发生在菌体的对数生长期。经过 72 h 的培
养，突变株 NF34 使 NH4
+-N 的浓度由最初的 194.05
mg/L 降低到 28.99 mg/L，去除率 85.06%，比原菌株
N18 提高了 11.99%。NF34 的细胞内氮含量为 42.26
mg/L，脱氮量 122.80 mg/L。可见原始菌株 N18 和诱
变菌株 NF34 均具有异养脱氮能力，NF34 的硝化能
力更强。
61.48%、67.62%；当初始氨氮浓度提升到 200 mg/L 时，
N18 和 NF34 的脱氮率分别为 51.79%、63.28% ；当
初始氨氮浓度提升到 500 mg/L 时，N18 和 NF34 的
脱氮率分别为 35.54%、46.29%。这说明突变株 NF-
34 对不同浓度的氨氮都表现出了更高的脱氮能力。
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 12 24 36 48 60 72ᰦ䰤h
0
10
20
30
40
50
60
70
N18 cNH4+-Nmg/L NF34 cNH4+-Nmg/L
cN
H
4+
-N
m
g/
L
㓶㜎
޵≞
mg
/L

NF34㓶㜎޵≞mg/LN18㓶㜎޵≞mg/L
图 4 原始菌 N18 与突变株 NF34 的硝化性能
对脱氮过程中 NO2
--N 浓度的变化进行监测，结
果见图 5。在整个培养过程中，菌株 N18 和 NF34
的 NO2
--N 积累量很小，且呈现出先升高后下降的
趋势，于 36 h 分别达到其最大积累值 0.072 mg/L 和
0.065 mg/L。
2.6 不同初始氨氮浓度下菌株的脱氮能力
图 6 结果显示了在不同初始氨氮浓度下，原
始菌株 N18 和突变株 NF34 的脱氮性能，在初始氨
氮浓度 100 mg/L 时，N18 和 NF34 的脱氮率分别为
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0 12 24 36 48 60 72ᰦ䰤h
N18 NF34
cN
O
2-
-N
m
g/
L
图 5 72 h 后原始菌 N18 与突变株 NF34 的亚硝态氮含量变化
0
10
20
30
40
50
60
70
80
100 200 500
N18 NF34
㝡≞
⦷%

≘≞⎃ᓖmg/L
图 6 原始菌 N18 与突变株 NF34 对不同初始氨氮浓度的
脱氮率
3 讨论
与传统的自养硝化细菌相比，异养硝化细菌在
生长和脱氮条件等方面具有一定的优势，但由于异
养硝化反应机理和各反应中的关键酶、电子传递及
关键的控制步骤等方面还需要进一步阐明，目前还
无法对菌株进行定向改造，高效菌株的获得途径，
以多环境采样和富集筛选为主。本研究从发酵废水
活性污泥中筛选得到一株异养硝化细菌 N18，通过
形态学、生理生化及分子生物学研究对其进行了初
步鉴定。菌株 N18 与多株 Pseudomonas sp. 的相似性
99% 以上，鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。
紫外诱变育种是微生物育种中最常用和有效的
方法之一，操作简便，但后期筛选工作量较大，因
此选择一个高效快捷的筛选方法至关重要。本研究
采用 15 g/L 氨氮作为诱变后定向筛选的方法，排除
了一批不耐受高氨氮的菌株，从而将筛选效率大大
提高，同时也获得了在高浓度氨氮条件下生长良好
表 3 48 h 后诱变突变株与出发菌株 N18 的生长情况和除
氮性能
菌株 15 g/L（NH4）2SO4 氨氮去除率（%） 与 N18 之差（%）
N18 — 60.32 0
NF1 + 50.56 -9.76
NF9 + 58.31 -2.01
NF17 + 55.89 -4.43
NF21 + 49.77 -10.55
NF26 + 53.65 -6.67
NF31 + 66.83 6.51
NF34 + 70.85 10.53
NF41 + 60.02 -0.30
+ ：肉眼可见 ；— ：肉眼不可见
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期188
的菌株。出发菌株 N18 经紫外线照射和 15 g/L 氨氮
筛选之后，氨氮去除率提高了 11.99%。关于氨氮去
除率提高的原因有待进一步研究，是否耐受高浓度
氨氮的菌株具有更高的硝化能力还需考证。
对突变菌株 NF34 的硝化特性研究表明，硝化
作用主要发生在对数生长期，随着菌体的快速增值，
水中氨氮的含量迅速下降，脱除的氨氮有一小部分
用于同化作用，而大部分通过菌株的异养硝化作用
去除。此结果与刘芳芳［9］等研究的结果相符。在整
个硝化过程中并未出现大量的亚硝酸盐氮的积累，
该结果与辛玉峰［12］和刘晶晶［16］的结果相一致，分
析原因可能有两点 ：一是，该菌株能够同时进行硝
化和反硝化，硝化作用使 NO2
--N 浓度升高，再通过
反硝化作用转化为气体产物逸出 ；二是，该菌株的
脱氮途径可能将氨氮直接转化成气体排出。
考察原始菌株 N18 和突变株 NF34 对不同浓度
氨氮的脱氮能力，在初始氨氮浓度 100、200 和 500
mg/L 时，突变株 NF34 的脱氮率较 N18 分别提高了
6.14%、11.49%、10.75%。氨氮浓度对菌株的脱氮
性能有很大影响，氨氮浓度较低时，菌株对 NH4
+-N
的去除效果较好，氨氮浓度越高，菌株对氨氮的去
除率呈下降趋势，而氨氮去除量随着氨氮浓度的升
高而增大，这与廖小红［17］等报道的情况相似。
本研究首次通过紫外随机诱变和高浓度氨氮定
向筛选的方法，获得了氨氮耐受性和脱氮活性更高
的菌株，为拓宽高效硝化细菌的筛选提供了新的方
向。紫外诱变适用于大多微生物菌株的遗传改造，
结合异养硝化细菌脱氮机理的进一步揭示，不断优
化诱变后的筛选指标，可为污水的生物治理提供更
加有效的应用菌株。
4 结论
从活性污泥中筛选得到一株异养型硝化细菌
N18，初步鉴定为假单胞菌属。诱变菌株 NF34 在
72 h 的 NH4
+-N 去除率为 85.06%，比原菌株 N18 提
高了 11.99%。在初始氨氮浓度为 100、200 和 500
mg/L 时，NF34 的 脱 氮 率 分 别 为 67.62%、63.28%、
46.29%， 较 原 始 菌 株 N18 分 别 提 高 了 6.14%、
11.49%、10.75%。该菌株异养硝化过程主要发生在
对数生长期，整个过程中亚硝态氮积累量很小。
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（责任编辑 李楠）