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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第2期
噬菌体展示系统是以丝状噬菌体为载体，将外
源蛋白或多肽的基因表达产物与其外壳蛋白融合，
使得外源蛋白或多肽在其表面得以展示，进而通过
筛选获得表达有特异性蛋白质或多肽的噬菌体，再
收稿日期 ： 2013-08-08
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31270171），江苏高校优势学科建设工程资助项目
作者简介 ：方月琴，女，博士研究生，助理研究员，研究方向 ：生物医学 ；E-mail ：yueqinfang@aliyun.com
通讯作者 ：朱国强，男，博士，教授，研究方向 ：病原微生物和免疫学 ；E-mail ：yzgqzhu@yzu.edu.cn
多功能 M13KE 噬菌体展示系统的建立
方月琴1  郭娟宁2  陆豪杰1  朱国强3
（1. 江苏健雄职业技术学院，苏州 215411 ；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009 ；3. 新乡医学院，新乡 453003）
摘 要 ： 以 M13KE 噬菌体为起始载体，建立一种无需辅助噬菌体的较长片段多肽库展示系统，以解决当前噬菌体展示仅能
筛选短肽库现象，并扩大靶向高通量筛选范畴。根据 M13KE 次要外壳蛋白（Minor coat protein of wild-type M13KE，wt-pIII）基因
III（wt-gene III）结构与功能关系，设计并扩增出能发挥其基因功能的截短基因 III（Truncated gene III，tgIII）；通过拼接-重叠-延伸
PCR（Splice-overlapping-extension polymerase chain reaction，SOEing-PCR）获得含启动子、信号肽和结构基因的融合基因片段，将
其插入至 M13KE 载体的合适部位，进行蛋白质诱导表达，SDS-PAGE 和 Western blot 分析。同时在 wt-gIII 和 tgIII 部位分别插入 HA
和 c-Myc 多肽标签，再次进行表达和检测。结果显示，tgIII 被插入到 M13KE 的非必需部位，利用抗蛋白 III（anti-M13 pIII）抗体
进行 Western blot 检测发现，wt-gIII 和 tgIII 均能表达 pIII（protein III，pIII）；anti-HA 和 c-Myc 抗体都能检测到 2 个标签蛋白和 pIII
蛋白质的表达。获得一种多功能 M13KE 载体，具有既能表达短片段多肽库，也能表达较长片段多肽库的潜能，而且无需辅助噬菌
体，可用于更大范围的高通量靶向筛选。
关键词 ： 靶向高通量筛选 噬菌体展示系统 M13KE 长片段多肽库
Construction of a Multipurpose M13KE Phage Display System
Fang Yueqin1 Guo Juanning2 Lu Haojie1 Zhu Guoqiang3
（1. Dept. of Biological and Chemical Engineering，Chien-Shiung Institute of Technology，Suzhou 215411 ；2. College of Veterinary Medicine，
Yangzhou University，Yangzhou 225009 ；3. Dept. of Medical School，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003）
Abstract:  It was to engineer a multipurpose M13KE phage display vector from M13KE wild-type phage for the longer peptide or protein
display library without helper phage, as well as to expand the scope of targeting high-throughput screening. Based on the relationship of the
structure and function of minor coat protein of wild-type M13KE, a truncated gene III encoding minor coat protein from M13KE phage was cloned
and a fusion gene fragment containing a lac/tac promoter and the gene III signal peptide sequence was assembled using splice-overlapping-
extension polymerase chain reaction. SDS-PAGE and Western blot analysis with anti-M13 pIII monoclonal antibody was employed to detect
the expression of the recombinant gene III. Two peptide tags, c-Myc and HA tag sequences were fused to the recombinant gene for expression
and analysis, and the following screening steps. The recombinant gene III（tgIII）was inserted into the unessential part of M13KE and the
corresponding protein III was detected with SDS-PAGE and Western blot with the anti-pIII antibody. The tgIII containing two tags expressed both
c-Myc and HA peptides using methods of SDS-PAGE and Western blot with their specific monoclonal antibodies. We made the construction of
a multipurpose M13KE phage display system. In the near future, we hope to apply this engineered phage display vector to carry longer peptide
libraries for high-throughput screening without helper phage.
Key words:  High-throughput screening Phage display M13KE Longer peptide library
进行富集［1］。其优点是直接将基因型与表型联系
到一起，再利用其与配体的特异性亲和力，将目的
蛋白质或多肽筛选出来。所用丝状噬菌体主要有
M13KE、fd 和 fe 等，它们通过 gIII 侵染携带 F’的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期144
大肠杆菌，而外源基因大多插入到 gIII 中，以融合
蛋白的形式展示在噬菌体表面［2］。
但是如果外源基因过长会造成噬菌体感染能力
的失去，因而现有展示系统只能够表达短片段多肽，
很多时候不能够满足蛋白质靶向筛选的要求［3］。或
者是在辅助噬菌体存在的情况下完成长肽筛选，但
是增加了操作过程的繁琐性［4-8］。因此，本研究以 M-
13KE 为载体［9］进行改造，目的是建立针对较长片
段多肽或蛋白质库筛选、又不影响其复制感染能力、
且无需辅助噬菌体存在的高通量噬菌体展示系统。
1 材料与方法
1.1 PCR获得tgIII
通过两步 PCR 法获得 M13KE 载体（New Engl-
and Biolabs，USA）wt-gIII 的 启 动 子 与 信 号 肽 的 基
因序列。两步 PCR 包括了拼接 PCR（Dual-assembly
PCR，DA-PCR） 和 延 伸 PCR（Over-extension PCR，
OE-PCR）［10］。所需引物和步骤如图 1 所示。接着
以 M13KE 双链 DNA 为模板 PCR 扩增得到 gIII 的 C-
端区域 DNA，引物为 M13F（5-3）：ACT AGT GGT
GGC TCT GGT TCC GGT GAT TTT G ；M13R（5-3）：
GCC GGA ATT CGC GCA CTG CTT ATT AAG ACT
CCT TAT TAC。最后利用 SOEing-PCR 法将上列 3 种
DNA 序列进行拼接，得到 tgIII 全长。
PCR 体系为 37.5 μL，在 1×pfu 缓冲液中加入
200 μmol/L dNTP，7.5 U pfu DNA 聚合酶（Fermentas，
USA），合适的 DNA 引物和 DNA 模板。PCR 反应条
件为 94℃ 5 min，94℃ 30 s，53℃ 30 s 和 72℃ 45 s
共 25 个循环，之后 72℃延伸 7 min。PCR 产物在 1.5%
琼脂糖凝胶上电泳。
1.2 基因克隆
tgIII 首先插入至 pJETTM PCR 克隆载体（Ferme-
ntas，USA），经克隆 PCR、酶切、测序鉴定序列正
确 后， 用 Bst I 酶（New England Biolabs，USA） 将
tgIII 片段切下，胶纯化（Qiagen，Germany）；同时
将 M13KE 用该酶切后，胶纯化 ；再将两者进行连接
克隆入 M13KE，最终得到 M13KE-tgIII 载体。
1.3 标签蛋白HA和c-Myc的克隆
分别将 HA 序列插入 tgIII，c-Myc 序列插入 wt-
gIII 信号肽序列的 3 端。首先根据氨基酸密码子优
化原则设计一对反向互补引物，两端携带相应粘末
端，接着将其进行 94℃高温变性、55℃退火连接，
形成具有相应酶切位点粘末端的互补双链，与酶切
F1: GCC GCA GTG AGC GCA ACG CAA TTA ATG T
F2: AGC TCA CTC ATT AGG CAC CCC AGG C
F3: ACT TTA TGC TTC CGG CTC GTA TGT T
F4: GAA TTG TGA GCG GAT AAC AAT TTC A
F5: GAA ACA GCT GTG AAA AAA TTA TTA T
F6: ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT T
F7: TCG CCG CGG TCC TGA TTT CGG ACT A
R1: TGA GTG AGC TAA CTC ACA TTA ATT G
R2: AGC ATA AAG TGT AAA GCC TGG GGT G
R3: CTC ACA ATT CCA CAC AAC ATA CGAG
R4: CAG CTG TTT CCT GTG TGA AAT TGTT
R5: CTA AAG GAA TTG CGA ATA ATA ATTT
R6: ACC GCG GCG AGT GAG AAT AGA AAGG
R7: AAC CAG AGC CAC CAC TAG TCC GAAA
CAA TTA ATG T-3˃
3 -˃AAAG CCT GAT
5 -˃GCC GCA GTT AGC GCA ACG
CAC CAC CGA GAC CAA-5˃
3˃5˃ 5˃3˃
图 1 通过 DA-PCR 和 OE-PCR 法获得启动子与信号肽的 DNA
2014年第2期 145方月琴等 ：多功能 M13KE 噬菌体展示系统的建立
的 M13KE 载体连接。HA 标签两端为 Sac II 和 Spe
I 酶切位点，引物序列为 HA-F（5-3）：GGC CGA
ATA CCC ATA CGA CGT TCC AGA CTA CGC TTC，
HA-R（5-3）：GGC CGA AGC GTA GTC TGG AAC
GTC GTA TGG GTA TTC。C-Myc 两 端 为 Eag I 酶 切
位点对应序列，引物序列为 ：Myc-F（5-3）：GGC
CGA ACA GAA GCT GAT CTC TGA AGA AGA CCT
GTC，Myc-R（5-3）：GGC CGA CAG GTC TTC TTC
AGA GAT CAG CTT CTG TTC。最终获得的载体称为
M13KE-HA-Myc。
1.4 M13KE噬菌体蛋白质SDS-PAGE分析
3 mL LB 培养液（1 L ddH2O 中 10 g 蛋白胨，5 g
酵母提取物，10 g NaCl，121℃灭菌 25 min）中加入
60 μL 过夜培养的 ER2738 菌和 2.5 μL 噬菌体上清，
37℃培养至指数生长阶段，转移至 40 mL LB 液中培
养 1 h，加入不同浓度 IPTG 溶液（Fermentas，USA）
进行诱导。诱导结束，将培养液离心≥ 6 000 r/min，
8 min。上清液转移至干净试管中，加入 1/5 体积比
的 PEG/NaCl 溶液，混匀，4℃沉淀至少 5 h。12 000
r/min 4℃离心 20 min，弃上清，沉淀溶于 TBS（1L
ddH2O 中 6.06 g Tris，8.766 g NaCl，0.5%（V/V）
Tween-20）。噬菌体蛋白质在 12% SDS-PAGE 上电泳
分离，染色（Bio-Rad，USA）。
1.5 噬菌体蛋白质的Western印迹分析
噬 菌 体 蛋 白 质 SDS-PAGE 分 离 之 后， 经 小 型
Bio-Rad Trans-blot 转印槽（Bio-Rad，USA），30V 低
温过夜或是 60 V 室温 3 h，转移至纤维素膜（Milli-
pore，Germany）。接着取出纤维素膜，在 5% 脱脂
牛奶封闭液中封闭 2-3 h，一抗（Anti-M13 pIII 1 ：
200，New Engl-and Biolabs，USA ；anti-c-Myc［11，12］，
anti-HA［13］1∶1 000，Sigma-Aldrich，USA）4℃孵育
过夜，TBST 充分洗涤，加入辣根过氧化物酶（HRP）
标记二抗（1∶8 000，Sigma-Aldrich，USA）孵育 2 h，
TBST 充分洗涤 4 次后利用 HRP 显色试剂盒（Bio-Rad，
USA）进行蛋白质显色。
2 结果
2.1 tgIII的基因合成
tgIII 由 3 部分组成，包括启动子、信号肽和 C
端gIII（图 2），与 wt-gIII 相比，删去了不影响 pIII
功能的 N 端 gIII 序列。启动子和信号肽为 210 bp，
C 端 gIII 为 490 bp。 首 先 通 过 DA-PCR 和 OE-PCR
方法获得启动子-信号肽序列，之后将其与 C-端gIII
的 PCR 产物经 SOEing-PCR 进行拼接，获得 tgIII 全
长约 700 bp，两端携带 Bst I 酶切位点（图 3）。
1 ：lac 启动子和 gIII 信号肽（约 210 bp）；2 ：gIII 的 C 端片段（约 490 bp）；
3 ：tgIII（约 700 bp）；M ：100 bp DNA 分子量标准
图 3 含启动子、信号肽和 C 端 gIII 序列的融合基因 gIII
੟ࣘᆀ ؑਧ㛭 NㄟgIII CㄟgIII
੟ࣘᆀ ؑਧ㛭 CㄟgIII
wt-gIII
tggIII
图 2 wt-gIII 和 tgIII 的基因结构
700
600
500
300
200
1
1 2 3 4
2 3 M
2.2 M13KE-tgIII载体构建
tgIII 首先插入 pJET 克隆载体，经酶切、测序明
确序列正确后，Bst I 酶切，胶纯化得到 tgIII 片段。
M13KE（图 4-A）也经该酶酶切，胶纯化，与 tgIII
片段进行连接，转化，鉴定，最终得到 M13KE-tgIII
载体（图 4-B）。
2.3 M13KE-tgIII载体的噬菌体蛋白
SDS-PAGE 和 Western 印 迹 分 析，M13KE-tgIII
载体经 IPTG 诱导，分离出噬菌体蛋白质，在 SDS-
PAGE 电泳银染图（图 5）能见到 5.5 kD 左右的主要
衣壳蛋白 pVIII，其他蛋白质在电泳图上不可见。
用 anti-M13 pIII 单 克 隆 抗 体 进 行 Western blot
检测，结果（图 6）发现有 2 个不同分子量大小的
pIII，wt-pIII 约为 70 kD，tpIII 电泳所示分子量大小
约 35 kD，与文献报道一致［14］。
2.4 构建M13KE-HA-tgIII-Myc载体和标签蛋白表
达分析
通 过 克 隆 技 术 分 别 将 c-Myc 和 HA 标 签 插 入
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第2期146
tgIII 和 wt-gIII 的信号肽与成熟 pIII 之间。之后分别
利用相应抗体进行检测。375 μmol/L IPTG 诱导 6 h，
分别检测到 c-Myc 标记融合蛋白 wt-pIII（图 7-A）和
HA 标 记 的 tpIII（ 图 7-B）， 表 明 载 体 M13-HA-Myc
顺利表达 2 个不同分子量大小的 pIII 蛋白。
1 ：M13-33 无 IPTG 诱导 ；2 ：M13KE 经 IPTG 诱导 6 h ；3 ：M13-33 经 IPTG
诱 导 2 h ；4 ：M13-33 经 IPTG 诱 导 3 h ；5 ：M13-33 经 IPTG 诱 导 4 h ；6 ：
M13-33 经 IPTG 诱导 5 h ；7 ：M13-33 经 IPTG 诱导 6 h ；8 ：蛋白分子量标准
图 5 M13KE 和 M13KE-tgIII 经不同浓度 IPTG 诱导的
SDS-PAGE 电泳银染图
M13KE
7 222 bp
geneIII
Acc651-Kpnl
Eagl
M13 ori
jacZa
A
ori
recomb gIII
Lac Z
M13KE-tgIII
7 903 bp
gVIII
EagI
gIII
B
A ：M13KE 载 体， 序 列 从 网 站 获 得 ：https ：//www.neb.com/~/media/NebUs/
Page%20Images/Tools%20and%20Resources/Interactive%20Tools/DNA%20
Sequences%20and%20Maps/Text%20Documents/m13kefsa.txt
B ：M13KE-tgIII 载体图，显示原 gIII 基因与重组 tgIII 在载体中的位置
图 4 M13KE 载体与 M13KE-tgIII 载体图
1 2 3 4 5 6 7 M
75
20
kD
M
75
kD
50
37
25
1 2 3 4 5 6
M: 蛋 白 分 子 量 标 准 ；1 ：M13-tgIII 经 100 μmol/L IPTG 诱 导 6 h ；2 ： M13-
tgIII 经 200 μmol/L IPTG 诱导 6 h ；3 ：M13-tgIII 经 400 μmol/L IPTG 诱导 6 h ；
4 ：M13-tgIII 经 800 μmol/L IPTG 诱导 6 h ；5 ：M13-33-tgIII 无 IPTG 诱导 ; 6:
M13KE 载体
图 6 M13KE-tgIII 的 Western blot 结果
75
KD
M
A B
M1 2 1 2
KD
50
37
75
37
（A）M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：M13-HA-gIII-Myc 载体 ；2 ：M13KE 载体 ；
（B）M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：M13KE 载体 ；2 ：M13-HA-gIII-Myc 载体
图 7 anti-c-Myc 和 anti-HA 抗体 Western blot 法检测
M13-HA-gIII-Myc 和 M13KE 结果
3 讨论
目前市场上流行的 New England Biolabs 公司的
M13KE 噬菌体展示系统，是在 wt-gIII 的信号肽与
基因之间插入多肽库，但均为 7 aa，9 aa 的短肽库，
往往不能满足长肽链的筛选［15， 16］。本研究构建一种
携带两个 gIII 的 M13KE 载体，其中 wt-gIII 保留其感
染宿主细菌的能力，tgIII 携带长片段多肽库，用于
进行靶向筛选。
为减少插入大片段基因对 M13KE 噬菌体功能的
影响，wt-gIII 中 C 端区域被删去，保留启动子、信
号肽和 N 端区域组成的 tgIII，其转录得到的 tpIII 能
够更有效地将其携带的蛋白质表达到噬菌体外壳，
但是对噬菌体包装与分泌不造成影响［1］。由于 tgIII
删除了 C 端区域，失去了感染宿主菌及包装蛋白的
能力，因此在携带有 tgIII 的噬菌体中，同时需存在
wt-gIII 以保持感染与成熟蛋白复制包装的能力［17］，
或者通过增加辅助噬菌体以完成上述功能［18］。本研
究即采用前者，即保留 wt-gIII 的感染能力。
2014年第2期 147方月琴等 ：多功能 M13KE 噬菌体展示系统的建立
经 PCR、 克 隆 步 骤 得 到 M13KE-tgIII 后， 用
anti-pIII 单克隆抗体对两个 pIII 进行蛋白质表达检
测，能检测到 2 个不同分子量大小的 pIII。之后在
wt-gIII 和 tgIII 的启动子与表达区域之间分别插入
c-Myc 和 HA 标签蛋白，以检测它们与 pIII 融合蛋
白的表达。经 anti-c-Myc 和 anti-HA 2 种单克隆抗体
检测，均在相应分子量大小的位置出现 pIII 蛋白质。
这说明 tgIII 的成功克隆与 tpIII 的成功表达，并表明
了 tgIII 的信号肽之后进行克隆长片段多肽库的潜能。
这也是本课题下一步研究方向。
本试验构建的 M13KE-tgIII 载体既可在 wt-gIII
部位插入短片段多肽，用于短肽库的构建，也具有
在 tgIII 上插入长片段多肽库的潜能，有望进行短肽
库与长肽库之间的筛选，简化了多肽库筛选的操作，
扩大了噬菌体展示高通量筛选的选择。
4 结论
以 M13KE 噬 菌 体 为 起 始 载 体， 通 过 SOEing-
PCR 法获得能发挥 gIII 基因功能的 tgIII，并将 tgIII
插入至 M13KE 载体的合适部位，获得一种能表达长
片段多肽的 M13KE-tgIII 载体，检测到 tgIII 基因表
达。同时在 wt-gIII 和 tgIII 部位分别插入 HA 和 c-Myc
多肽标签，再次进行表达和检测，能检测到 2 个标
签蛋白，最终得到 M13KE-tgIII 和 M13-HA-gIII-Myc
载体。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）