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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
自从 1991 年 Fordor 首先提出了 DNA 芯片的概
念开始［1］，生物芯片技术得到迅速发展，并很快产
生了不局限于 DNA 探针的蛋白质芯片等新的芯片种
类。蛋白芯片的制备及检测技术的出现，为实现高
通量、高敏感性地检测某些生物活性物质提供了新
的思路及方法。但要使蛋白质探针固定，就必须先
对芯片表面进行物理或化学的修饰，然后通过化学
反应将蛋白质分子（如抗体分子）偶联固定到修饰
后的固相表面，完成蛋白芯片的制作。目前常用的
蛋白芯片表面修饰技术有多种 ：如氨基修饰、醛基
修饰及多聚赖氨酸修饰等［2］，不同的修饰方法都有
收稿日期 ：2012-10-18
基金项目 ：天津市自然科学基金重点项目（12JCZDJC22400）
作者简介 ：周爽，硕士研究生，研究方向 ：生物信息检测与生物传感器 ；E-mail ：ispecter@163.com
通讯作者 ：邢克礼，E-mail ：tjxingkeli@126．com ；贾芸芳，E-mail ：jiayunfang@yahoo.com.cn
基于 LAPS 系统的蛋白芯片表面修饰技术的对比研究
周爽1  贾芸芳2  孙晓轩1  邢克礼1
（1. 天津医科大学生物医学工程学院，天津 300070 ；2. 南开大学信息技术科学学院，天津 300071）
摘 要 ： 采用 3-氨基丙基 -三甲氧基硅烷（（3-aminopropy1）trimethoxysilane，APTES）和戊二醛（glutaraldehyde，GA）、左
旋多巴（L-DOPA）修饰芯片载体表面，对两种不同修饰方法制备的蛋白质芯片进行对比研究。以 XPS 检测表面活化剂的修饰效果；
将 AFP 抗体固定在修饰后的片基上，加入 AFP 溶液，以蛋白探针的反应性作为监测指标，通过 LPAS 系统检测反应产生的光电流。
结果显示，左旋多巴修饰硅片对蛋白固定效果较好，有较高的反应活性，检测范围较宽，但幅值较小。
关键词 ： LAPS 蛋白芯片 表面修饰
Comparative Study Based on the LAPS System of Protein Chip Surface
Modification Technology
Zhou Shuang1 Jia Yunfang2 Sun Xiaoxuan1 Xing Keli1
（1. Medical University of Tianjin School of Biomedical Engineering, Nankai University, Tianjin 300070 ；
2. College of Information Technical Science, Tianjin 300071）
Abstract:  The surface of chips were modified by 3 - aminopropyl - trimethoxysilane（（3-aminopropy1）trimethyoxysilane APTES）
and glutaraldehyde（Glutaraldehyde, GA）, levodopa（L-DOPA）modification of the chip carrier surface. The two kinds of different types of
modification of the protein chips prepared a comparative study. XPS detect surface modification effect of the activator. AFP antibodies were fixed
on the modified film base, then adding AFP solution, and photocurrent detected by LPAS system, selecting reactive protein probes as monitoring
indicators. The results showed the silicon protein modified by levodopa fixing preferably, having a higher reaction activity and a large detection
limit, though the amplitudes were small.
Key words:  LAPS Protein chip Surface modification
各自的特点与适用范围。
目前常用的蛋白芯片检测方法主要包括酶联
免疫吸附法（ELISA）、放射免疫（RIA）法、化学
发光法及电化学发光法（ECLIA）等［3］，这些方法
均需要对探针进行标记。光寻址电位传感器（light
addressable potentiometrie sensor，LAPS）是一种基于
半导体光电效应的化学传感器，可以在无标记的情
况下根据光电流的大小检测敏感膜的电位变化，给
出芯片的检测结果。在稳定性、重复性、灵敏度、
准确性和响应速度等方面具有优良的性能［4］，是一
种新的蛋白芯片检测方法。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期216
甲胎蛋白（Alpha fetoprotein，AFP） 是肝癌细
胞表达的高特异性蛋白质，70% 左右的患者在发病
期间表现出 AFP 高表达的特征，因此是进行肝癌初
筛及诊断的常用肿瘤标志物［5］。
本研究对醛基修饰和 L-DOPA 修饰后的芯片经
XPS 检测分析其修饰效果，并基于 LAPS 检测系统
研究两种修饰方法制备的蛋白芯片用于 AFP 检测的
反应性进行比较。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
主要试剂：3-氨基丙基 -三甲氧基硅烷（APTES）
（Sigma 公司，美国）；牛血清白蛋白（BSA）（北京
中杉金桥）；左旋多巴（L-DOPA）（北京鼎国生物技
术有限责任公司）；人甲胎蛋白（AFP）、AFP 抗体（上
海领潮生物科技有限公司）；戊二醛、无水乙醇、过
氧化氢、氨水、盐酸等其他试剂均为市售分析纯。
主要仪器 ：PHI 1600ESCA 系统（Perkin-Elmer
公司，美国），光纤输出一体光源（海特光电有限公
司）；数字锁相放大器（STANDFORD 公司 SR830）；
超声清洗机（VGT-1860QT）。
1.2 方法
1.2.1 表面修饰 戊二醛法 ：用无菌棉签沾取成
分 比 为 H2O∶H2O2∶NH4OH=5∶2∶1 的 碱 性 清
洗 液 擦 拭 硅 片， 去 离 子 水 冲 洗 后 再 用 成 分 比 为
H2O∶H2O2∶HCl=5∶2∶1 的酸性清洗液擦拭，之后
将硅片置于超声清洗机中，60℃清洗 20 min。在清
洗后的芯片表面加 40 μL APTES，室温反应 20 min
后用去离子水冲洗。再加入 40 μL 5% 戊二醛的 PBS
缓冲液，室温反应 1.5 h，吸去残液，用 PBST 冲洗 3 次，
去离子水冲洗一次。干燥待用。
左旋多巴法修饰 ：如上文所述清洗硅片，在清
洗后的芯片表面加 40 μL 5 mg/mL L-DOPA 的 PBS 缓
冲液，室温反应 1.5 h，吸去残液用 PBST 冲洗 3 次，
去离子水冲洗一次。干燥待用。
1.2.2 蛋白芯片的制备 在修饰好的芯片上加入 40
μL 浓度为 50 ng/mL 的 AFP 抗体，4℃过夜。反应后
用 PBST 冲洗 3 次。再加 40 μL 1% 的牛血清白蛋白
溶液，室温反应 1.5 h，进行芯片活性点封闭。之后
用 PBST 冲洗 3 次。
重新加入 40 μL PBS，并在芯片上盖封口膜，使
芯片保持湿润。置冰箱冷藏室（4℃），待用。
1.2.3 蛋白芯片检测 LAPS 检测系统是由电压控制
器、锁相放大器、光源控制器、待测芯片几部分组成，
如图 1 所示。芯片检测的步骤如图 2 所示。
图 2 LAPS 系统检测蛋白芯片的流程
图 1 LAPS 构成示意图
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150 ng/mLᰦ
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150 ng/mLᰦ䟷ṧ
通过 LAPS 系统的控制软件设置锁相放大器及
光源的各个参数。测量配置 ：偏置电压 -1 V，采样
间隔 0.1 s ；光源控制 ：调制频率 3 kHz，寻址时间
2 min。
加入 1 ng/mL 的相应抗原的 PBS 溶液 40 μL。反
应 15 min，用 PBS 缓冲液清洗 3 次，测量该浓度下
的响应值。重复上述步骤，依次测量 5、10、20、
40、60、80、100、120 和 150 ng/mL 的相应抗原浓
2013年第4期 217周爽等 ：基于 LAPS 系统的蛋白芯片表面修饰技术的对比研究
度的响应值。
2 结果
2.1 戊二醛/L-DOPA两种修饰的XPS检测
该检测用到 4 个单点芯片 ：未使用过的空载芯
片、修饰有 L-DOPA 的芯片、修饰有 APTES 的芯片、
在 APTES 基础上又修饰上 GA 的芯片。利用电子能
谱仪（electron spectrometer）对上述 4 种芯片做全谱
及针对 N、Si、C 及 O 四种元素的单谱分析，结果
如图 3、图 4 所示。
从图 3 所示，芯片上除元素 O、N、C、Si 有较
高含量外，In 的含量也不小（150 000），这是因为
In 连接在硅片上作为工作电极的一部分而存在。
由图 4 可知，在引入 APTES 后，在 397 eV 处
出现一个 N 元素的峰，这是因为 APTES 中含有一个
与烃链连接的氨基集团，修饰后使 N 的含量增加 ；
而 APTES 与硅片结合，遮盖了硅片中的氮化硅（图
5），使得 401eV 处的峰高与空载硅片相比降低。加
入 GA 后，其醛基与 APTES 的氨基反应，形成共价键，
减少了氨基使得 397eV 峰高降低 ；GA 的加入改变
了硅片表面的微环境，使硅片表面的氮化硅部分暴
露，体现在 401eV 处的峰高相较于 APTES 修饰略有
上升，但未及空载硅片的峰高。L-DOPA 中含有一图 3 XPS 全谱分析
0.0
Binding EnergyeV
C
ou
nt
s/
s
5.0×104
1.0×104
2.0×104
3.0×104
3.5×104
2.5×104
1.5×104
1200
Blank
APTES
GA
DOPA
O1s
C1s
ln3d
1000 800 600 400 200 0
Binding EnergyeV
2×104
3×104
2×104
52×162 3×162 3×162 3×162 3×162 3×162 4×162 4×162 4×162 4×162 4×162 5×102
1×104
0
5×104
6×104
C
ou
nt
s/
s
Binding EnergyeV
O1s
N1s
1.8×104
1.6×104
1.4×104
1.2×104
1.0×104
8.0×104
3.9×1023.9×1023.9×1024.0×1024.0×1024.0×1024.0×1024.0×1024.1×1024.1×1024.1×102
6.0×104
4.0×104
2.0×104
2.2×104
C
ou
nt
s/
s
Binding EnergyeV
8.0×103
1.0×104
1.2×104
1.4×104
1.6×104
6.0×103
4.0×103
94 96 98 100 102 104 106 108 110
2.0×103
0
C
ou
nt
s/
s
Binding EnergyeV
Si2p
C1s
1.8×104
1.6×104
1.4×104
1.2×104
1.0×104
8.0×104
3.9×1023.9×1023.9×1024.0×1024.0×1024.0×1024.0×1024.0×1024.1×1024.1×1024.1×102
6.0×104
4.0×104
2.0×104
2.2×104
C
ou
nt
s/
s
Blank
APTES
GA
DOPA
Blank
APTES
GA
DOPA
Blank
APTES
GA
DOPA
Blank
APTES
GA
DOPA
图 4 N/C/O/Si 四种元素的单谱分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期218
个与短烃链相连的氨基，使 397eV 处及 401eV 处的
峰值均有增高。
因为 APTES 中含有 Si 元素，故在修饰后硅片
表面的 Si 含量明显升高。GA 的加入掩盖了 APTES
的 Si，使 Si 含量降至基础水平。L-DOPA 的两个酚
羟基与硅片表面的氨基、亚氨基上的氢相互作用，
使氮化硅中 Si 原子的暴露增加，从而在一定程度上
增加了 102eV 处的峰高。
空载硅片上出现了在 285eV 的 C 元素的峰，提
示在硅片的清洗过程中可能出现了碳沾污。而在
APTES、GA、L-DOPA 的修饰反应结束后，均有冲洗
芯片的步骤，可以除去硅片表面污染上的碳 ；而上
述 3 种芯片表面修饰剂中均含有烃链和（或）苯环，
故而又引入了 C 元素。最终结果就是图中显示的 4
张硅片的 C 含量的变化微小。
硅片中的主要成分是 Si3N4/SiO2/Si，并含有一定
量的羟基基团，因此空载硅片显示出位于 532eV 处
的一个 O 元素的峰。在修饰 APTES 后，APTES 与
硅片的羟基结合，在掩盖原有 O 原子的同时，引入
了自身所携带的与 Si 相连的 O，因此，APTES 修饰
后，O 含量变化不大，但由于 APTES 的 O 所处化学
环境与羟基的 O 的环境不同，故而修饰有 APTES 的
硅片与空载硅片的曲线不相同。同理，在 APTES 的
基础上再覆盖上 GA，也是覆盖了 APTES 的 O 而引
入 GA 中醛基基团的 O，最终亦使 O 含量变化不大，
但因所处环境的不同而造成曲线形状相异。L-DOPA
的两个酚羟基与硅片的氨基、亚氨基间形成氢键，
较大的苯环覆盖在硅片表面遮盖了原有的 O，而
L-DOPA 中羧基 O 的引入则使 O 含量最终不变。
全谱分析及单谱分析都较好地展示出芯片修饰
的效果 ：无论是戊二醛法还是 L-DOPA 法的芯片修
饰，均能表现出良好的修饰效果，可以进入下一步
的探针固定反应。
2.2 测试条件的确定
2.2.1 抗体浓度选择 选取 3 张空载芯片，采用
L-DOPA 修饰方法活化，再分别接入浓度为 25、50、
200 ng/mL 的探针。在偏置电压为 +5V，调制频率
为 5 kHz 的条件下进行检测。由图 6 可知，在浓度
为 25 ng/mL 时，低浓度的抗原即可将芯片饱和 ；浓
度为 50 ng/mL 和 200 ng/mL 时，响应范围相应提高，
得到较好的检测结果，且接入的抗体浓度越大响应
幅值越大。考虑到浓度为 50 ng/mL 的 AFP 抗体浓度
已经可以得到较宽的检测范围和较高的分辨率，在
之后的试验中即选择该浓度为探针浓度。
HO
HO
NH2
NH2
a b
c d
CH2 CH2 CH2
H
O O
H
Si
N N
NN
Si
Si
OC2H2
OC2H5
OC2H5
Si
CH2CH COOH
图 5 四种重要物质的化学结构
a ：APTES ；b ：GA ；c ：L-DOPA ；d ：Si3N4
0
1.0×1012
Agng/mL
C
ur
re
nt
A
2.0×1012
3.0×1012
4.0×1012
25
50
200
5.0×1012
10 20 30 40
图 6 不同抗体浓度的特性曲线
2.2.2 偏置电压选择 在采用 L-DOPA 修饰法活化
的芯片上接入浓度为 50 ng/mL 的探针，不加抗原在
调制频率为 5 kHz 的条件下，从 -5 V 开始逐渐增高
偏置电压测量芯片的响应值。
对电压的摸索过程中，暂定调制频率为 5 kHz。
由图 7 可知，电压在 -5 V 至 -3 V 的区段，幅值随电
压变化的幅度较大，若使用该区段的电压数值，会
影响检测结果的准确性。在 -2 V 至 +5 V 的区段，曲
线相对平稳，又考虑到所用电极的极限电压为 ±2 V，
且适当减小电压可以拓宽检测范围，当电压为负时
光电流的大小与敏感膜电位成正比，故选取 -1 V 为
偏置电压。
2013年第4期 219周爽等 ：基于 LAPS 系统的蛋白芯片表面修饰技术的对比研究
120-150 ng/mL 区段，L-DOPA 的检测上限明显大于
GA 法。
1.0×1012
6 4 2 0
voltageV 2 4 6
2.0×1012
3.0×1012
cu
rr
en
tA 5.0×10
12
4.0×1012
6.0×1012
7.0×1012
8.0×1012
图 7 不同频率的特性曲线
2.2.3 调制频率选择 分别用 5 K、3 K、1 K 的调
制频率测量蛋白芯片，得出不同频率下的响应值。
由图 8 可知，在输出光源的调制频率为 5 K 时，芯
片在检测到 10 ng/mL 的抗原时即出现饱和趋势，频
率为 3 K 和 1 K 时，AFP 浓度加至 50 ng/mL 时才显
现饱和趋势 ；在未饱和时，3 K 的响应值又较高，
故选取 3 K 为光源调制频率。因此，最终选定的探
针浓度为 50 ng/mL，偏置电压为 -1V，调制频率为
3 kHz。
2.0×1011
1.0×1011
2.0×101 4.0×101 6.0×101 8.0×101
5k
3k
1k
fit curve of 5k
fit curve of 3k
fit curve of 1k
1.0×102
Agng/mL
cu
rr
en
tA
0.0
0.0
3.0×1011
4.0×1011
5.0×1011
6.0×1011
图 8 不同频率的特性曲线
3.00E-009 GAL-DOPA
fit curve of GA
fit curve of L-DOPA2.50E-009
1.50E-009
1.00E-009
0.00E-009
20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Agng/mL
C
ur
re
nt
A
5.00E-010
2.00E-009
图 9 两种表面活化方法的检测结果比较
无论是 GA 法还是 L-DOPA 法制得的芯片，超
出检测上限时表现出幅值下降，这可能是因为随着
检测时间的延长，探针、免疫复合物等生物大分子
在电流的长时间作用下出现变性等物理化学的变化，
从而由敏感膜脱出，进入缓冲液中。这使得敏感膜
电位减小，光电流降低。L-DOPA 法在达到抗原检测
上限后，幅值下降幅度较 GA 法的小，说明在 LAPS
检测系统中，探针与 L-DOPA 的结合相对比较稳定，
且较少受到检测作用时间的影响，另外考虑到临床
对 AFP 检测的需要，应该具有较高的检测上限，而
对低浓度检测的要求并不是很重要，因此，L-DOPA
修饰法更适合于 LAPS 系统的蛋白芯片检测
3 讨论
LAPS 系统的出现提示人们在对于蛋白芯片的检
测过程中，不仅可以使用诸如放射型标记、荧光标
记等传统方法，同样可以使用某些高效的无标记系
统对其进行检测。而在对蛋白芯片的整个操作过程
中，蛋白芯片的表面修饰技术是直接关系到检测范
围、检测效果等主要结果的关键环节。芯片的表面
活性基团，上承芯片本身，下启探针结合，有着十
分重要的作用，选择适当的芯片修饰剂和修饰方法，
是有效利用蛋白芯片及其检测结果的必要保证。
LAPS 系统在工作时，由恒电位仪经参比电极提
供反向偏置电压，该电压可以使硅片表面处于电荷
耗尽的状态。此时，在硅片表面加入一定波长的交
变激发光之后，硅片将吸收光子，并发生电子跃迁，
2.3 戊二醛/L-DOPA两种修饰方法检测APF的比较
戊二醛修饰法与 L-DOPA 具体检测结果见图 9。
GA 修饰得到的蛋白芯片响应值（检测灵敏度）大于
L-DOPA。在较低浓度时，GA 法的分辨率较 L-DOPA
高 ；L-DOPA 法 在 抗 原 浓 度 小 于 20 ng/mL 时， 不
能有效分辨。GA 法在抗原浓度加至 100 ng/mL 时
出现饱和，L-DOPA 的检测范围出现在抗原浓度为
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期220
同时产生电子空穴对。之前产生的电荷耗尽层作用
于电子空穴对，并将其拉开，该作用使工作电极和
对电极之间产生光电流。根据能斯特方程可知，当
固定偏置电压和光强的数值之后，光电流的大小就
与敏感膜的表面电位相关。在对本文所涉及的两种
修饰方法进行检测时发现，无论是经戊二醛修饰还
是 L-DOPA 修饰的蛋白芯片，在检测后期、对高浓
度的抗原检测时，均出现了光电流下降的情况，而
不是达到理论上的平台期。根据 LAPS 系统的检测
原理，可以推测，在 AFP 抗原浓度增加至 150 ng/ml
时，敏感膜出现了变性。这可能是由于长时间的通
电破坏了结合在活性基团上的 AFP 抗体氨基酸残基
的带电状况，进而使抗体构象发生变化。构象变化
可能导致两种结果 ：一是尚未结合抗原的抗体构象
改变，不能维持原有的生物学活性，丧失与新加入
的抗原发生特异性结合的能力 ；二是已经结合了抗
原的抗体发生变性，原本与抗原相互作用的氨基酸
残基空间位置变化或解离状态变化，不能维持与抗
原的牢固结合，释放了抗原。再加上其他一些探针
对未结合抗原的抗体产生空间位阻，使得敏感膜变
薄，光电流下降。
氨基修饰时，亲核试剂为芯片表面羟基的孤电
子对，它进攻 3-氨基丙基 -三甲氧基硅烷中电正性
的硅原子，同时放出甲醇，在羟基和硅原子之间形
成共价键，形成了具有反应活性的氨基基团表面［7］。
醛基修饰时，通过双功能基团试剂戊二醛，在其末
端形成一个反应活性醛基［8］，通过共价键引入了新
的醛基基团——即共价耦合，这提高了芯片表面的
特性。在进行 L-DOPA 生物活性修饰时，芯片表面
的氨基、亚氨基上的氢与 L-DOPA 的两个酚羟基相
互作用，形成氢键，使 L-DOPA 固定在芯片表面，
成为芯片的表面活性基团［9］。由试验结果可知，戊
二醛法的检测范围不宽，却有着较高的光电流值。
这可能是由于这种方法需要先修饰上 AFPTES，再
结合 GA，二者复合物的分子质量大于 L-DOPA 的缘
故。与此同时，在加入戊二醛时，GA 的两个醛基都
有可能与 ATPES 共价耦合，于是在无形中减少了探
针的结合位点，造成探针的接入量小于 L-DOPA 法。
而更多的抗体显然能结合更多的抗原，这种现象的
直接结果就是 L-DOPA 法的检测范围更宽。
由于本次试验采用的是“同一敏感膜连续检测”
的方式，因此在抗原抗体复合物形成的过程中，可
能存在累加效应，即在加入更高浓度抗原溶液时，
部分抗体的结合位点已经被之前加入的低浓度抗原
所结合。可以推论，若能找到一种不损害探针的生
物学特性，同时可以简便地去除已经结合的抗原分
子的方式，则可以在一定程度上再次拓宽该蛋白芯
片的检测范围。
4 结论
GA 及 L-DOPA 两种芯片表面修饰方法，均可以
地好牢固地引入表面活性基团，为后续的探针接入
提供基础。在 LAPS 系统中，使用 L-DOPA 法制作
的蛋白芯片，显示出了更宽的检测范围和更稳定的
性能。L-DOPA 法更适合基于 LAPS 系统的关于 AFP
检测的蛋白芯片表面修饰。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）