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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一
收稿日期 ：2013-01-25
基金项目 ：广东省教育部产学研项目（2010B09301037）
作者简介 ：李雨辰，男，硕士研究生，研究方向 ：抗体技术及其应用 ；E-mail: liyuchen198834@126.com
通讯作者 : 向军俭，男，教授，博士生导师，研究方向 ：分子免疫与抗体工程技术及应用 ；E-mail:txjj@jnu.edu.cn
副溶血弧菌外膜蛋白 ompK 免疫
磁珠检测方法的建立
李雨辰 闻一鸣 童吉宇 向军俭
（暨南大学抗体工程研究中心 广东省分子免疫与抗体工程重点实验室，广州 510632）
摘 要 ： 构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白 ompK 并制备多克隆抗体，建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集，结合化学
显色检测方法。利用生物软件 Primer 5 设计副溶血弧菌 ompK 基因的引物，通过 PCR 扩增出 ompK 基因，并将其克隆至 pET28a（+）
原核表达载体，转化至大肠杆菌 BL21 进行优化表达。镍柱纯化表达产物，免疫小鼠，制备其多克隆抗体。Western blot 鉴定重组蛋
白，ELISA 分析其免疫原性。间接 ELISA 检测多抗效价及交叉性，并与 protein G 磁珠偶联结合显色平板检测副溶血弧菌。结果显示，
成功表达 ompK 蛋白 ；免疫小鼠获得特异性抗血清，效价为 1∶64 000 ；Western blotting 证明抗血清能与副溶血弧菌 28 kD 处条带
特异性结合。制备的免疫磁珠敏感度最高能达到 104 CFU/mL。成功克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白 ompK 并制备副溶血弧菌特异性
鼠多克隆抗体，建立的免疫磁珠检测方法与显色平板法结合较传统的二次增菌法能够节省 72 h，整个过程只需要传统方法时间的
1/3 ；相比于常用的免疫学检测方法检测灵敏度提高两个数量级。
关键词 ： 副溶血弧菌 ompK 多克隆抗体 免疫磁珠
Dectection of Vibrio parahaemolyticus by Outer Membrane Protein
ompK Immunomagnetic Beads
Li Yuchen Wen Yiming Tong Jiyu Xiang Junjian
（Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Antibody Engineering Center of Jinan University，
Guangzhou 510632）
Abstract: It was to construct recombinant gene cloning and express the membrane surface protein outer the membrane protein K（ompK）
of Vibrio parahaemolyticus, developing a method to detect Vibrio parahaemolyticus via immunomagnetic separation combined with color plate
method. Using Primer 5 to design primers of ompK gene, the ompK gene was amplified by PCR subsequently and cloned into pET28a（+）
prokaryotic expression vector, optimally transferred into E. coli BL21 to express. The expression products were purified by Nickel column and
immunized mouse to prepare polyclonal antibody. Western blotting analysis was applied to identify the recombinant protein and ELISA was
used to analyze its immunogenicity. The titer and cross reactivity of the polyclonal antibody were determined using indirect ELISA, then the
polyclonal antibodies we prepared were coupled with protein G immunomagnetic beads to develop a chromogenic plating detection of Vibrio
parahaemolyticus. The sensitivity of immunomagnetic beads reached to 104 CFU/mL. We managed to clone and express Vibrio parahaemolyticus
outer membrane protein ompK, in addition, we prepared mouse anti-Vibrio parahaemolyticus polyclonal antibody to create a new detection method
using immunomagnetic beads, this method which combined with color plate method could save 72 hours comparing with traditional enrichment
method, all process only need one-third of the time of traditional methods. When compared to the common immune detection methods, it was two
magnitudes more sensitive.
Key words: Vibrio parahaemolyticus ompK Polyclonal antibody Immunomagnetic beads
种嗜盐性细菌，主要存在于近海岸的海水、海水沉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期210
积物和鱼虾、贝类等海产品中，被人食用之后会造
成严重肠胃炎［1］，是我国最重要的食源病菌之一［2］。
并且副溶血弧菌会感染养殖海产品尤其是蟹贝类等，
造成养殖蟹贝大量死亡［3］，给渔业带来巨大损失。
传统的检测方法需要对副溶血弧菌进行多次增
菌，耗费人力和时间［4］，由于待检样品往往是时效
性很强的海产品，需要更加快速灵敏的检测方法。
化学显色方法其特异性高但是需要增菌时间长，而
ELISA 方法特异性和灵敏度较高，但其检测限一般
在 106-107CFU/mL，不能满足实际需要。ompK（外
膜蛋白 K）蛋白是副溶血弧菌表面的组成蛋白之一，
免疫原性好，与其他菌属存在较少交叉，并且弧菌
属的 ompK 蛋白进化趋于保守［5，6］，因此能够排除
致病革兰氏阳性菌、多数致病革兰氏阴性菌及副溶
血弧菌多血清型对检测造成的干扰，所以 ompK 蛋
白可以被用作免疫磁珠富集副溶血弧菌的靶点。本
研究通过原核表达 ompK 蛋白并制备多抗，制备免
疫磁珠富集副溶血弧菌，再结合显色培养基以期达
到快速灵敏检测副溶血弧菌的目的。
1 材料与方法
1.1 材料
单 增 李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes54002）、
副 溶 血 弧 菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802）、
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus ATCC 6538），
沙 门 氏 菌（Salmonella typhimurium CMCC 50093），
大肠杆菌（Escherichia coli ATCC 25922）均由广东省
微生物研究所馈赠。Balb/c 小鼠购于南方医科大学
实验动物中心。
试验所用兔抗副溶血弧菌全菌多抗血清为实
验室之前制备。副溶血弧菌显色固体培养基自广东
环凯公司购得。主要器材混匀仪 Dynal-MIX1，美
国 Invitrogen 公 司 ；UV-2550 紫 外 分 光 光 度 计， 日
本 SHIMADZU 公司 ；酶标仪 Multiskan MK，Thermo
Labsystem 公司 ；弗氏佐剂，Sigma 公司 ；镍离子亲
和层析柱，GE 公司，磁分离器，西安北美基因公司；
Multiskan 酶标仪，Thermo 公司 ；台式恒温摇荡器，
培英公司 ；人工气候箱，广东省医疗器械厂。
1.2 方法
1.2.1 ompK 基因的 PCR 扩增及扩增载体的构建与
鉴定 使用 Primer5 针对 GenBank 中 ompK 蛋白核酸
序列设计引物，上下游引物分别含有 BamH Ⅰ和
Xho Ⅰ酶切位点。上游引物 ：5-GGATCCGATTACT-
CTGACGGCGATATC-3，下游引物 ：5-CTCGAGTT-
AGAACTTGTAAGTTACTGCG-3。以提取的副溶血弧
菌 DNA 为 模 板 进 行 PCR 扩 增。 将 PCR 产 物 回 收
后，与 pMD18-T 载体 16℃连接过夜，连接产物转化
E. coli DH5α。利用 Axygen 公司的质粒抽提试剂盒抽
提质粒，进行 PCR 鉴定及 BamH Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切
鉴定和测序鉴定。PCR 循环参数为 ：初始变性 94℃
5 min ；主循环 94℃，30 s，退火温度为 58.2℃ 30 s，
72℃延伸 60 s，30 个循环 ；循环结束后继续延伸
10 min。
1.2.2 表达载体的构建与鉴定 将上述鉴定正确
的重组质粒和 pET28a（+）质粒载体用 BamH Ⅰ、
Xho Ⅰ双酶切，纯化回收后用 T4 DNA 连接酶连接构
建 pET28a（+）-ompK 重组表达质粒，连接产物转化
E. coli BL21，经含卡那霉素的 LB 平板筛选，挑选单
菌培养后落提取质粒双酶切鉴定。验证结果正确后
进行表达。
1.2.3 重 组 ompK 蛋 白 的 诱 导 表 达 及 表 达 产 物 的
可 溶 性 鉴 定 将 鉴 定 正 确 的 重 组 菌 液 按 体 积 比
1∶1 000 接种于 5 mL 含卡那霉素的 LB 液体培养基
中，37℃、270 r/min 培养过夜。从新鲜菌液中取 1
mL，接种于 100 mL 2×YT 培养基中，37℃、220 r/min
培养 2 h 左右，OD600 值 0.5 时，加入 1 mol/L IPTG
使其终浓度为 1 mmol/L ；28℃、160 r/min 培养 8 h。
4℃、8 500 r/min 离心 10 min，收集菌体 ；加入 PBS
缓冲液（pH7.4）重悬菌体，冰浴超声波破碎。4℃、
8 500 r/min 离心 15 min，分别取上清液组分和沉淀
组分，用 12% 的分离胶进行 SDS-PAGE 分析。
1.2.4 重 组 ompK 蛋 白 的 纯 化 与 鉴 定 及 可 溶 性 转
化 参考钱荣华等［7］方法溶解包涵体。收集诱导
表达的菌体，重悬于细胞裂解（50 mmol/L Tris-HCl、
1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH8.0），冰浴超
声破碎，8 000 r/min 离心 5 min，沉淀重悬于包涵体
洗 涤 液（20 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L EDTA、100
mmol/L NaCl、2 mol/L 尿素，pH8.0），12 000 r/min 离
心 15 min，经过洗涤液两次洗涤之后。沉淀重悬
于 包 涵 体 增 溶 液（100 mmol/L Tris-HCl、2 mmol/L
2013年第6期 211李雨辰等 ：副溶血弧菌外膜蛋白 ompK 免疫磁珠检测方法的建立
EDTA、6 mol/L 尿素，pH8.0），室温搅拌溶解 30 min
后，12 000 r/min 离心 20 min，上清液经 Ni-NTA 柱
子进一步纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化结
果。随后纯化产物置于透析袋中，用 TE 缓冲（100
mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，pH8.0） 透 析，
PEG20000 浓缩，将浓度调至 1 mg/mL，鉴定蛋白浓
度之后 -20℃保存。
1.2.5 鼠多克隆抗体的制备 Bab/c 小鼠 3 只适应性
饲养 1 周后，将纯化的融合蛋白皮下多点注射免疫，
每只注射 100 μg，首次免疫用弗氏完全佐剂乳化，
加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化，隔两周加强免疫
1 次，共 3 次，末次加强免疫后 1 周尾部取血，间
接 ELISA 检测血清抗体效价，效价达标后眼球取血，
离心分离血清，冷冻保存。
1.2.6 鼠 多 克 隆 抗 体 效 价 的 测 定 及 其 交 叉 性 分
析 单增李斯特菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、
大肠杆菌与沙门氏菌经加热灭活后，用麦氏比浊法
将菌体浓度调至 109 CFU/mL。取上述菌体 100 μL 包
被 ELISA 板孔，将与蛋白反应性最好的小鼠血清作
间接 ELISA 测定效价。
1.2.7 Western blotting 分析 分别用纯化后的 ompK
蛋白和副溶血弧菌菌体经过经过 SDS-PAGE 电泳，
然后电转至 PVDF 膜上，用 5% 脱脂奶粉封闭，分
别用兔抗副溶血弧菌的多抗抗体和鼠抗 ompK 蛋白
多抗作一抗，以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊
抗鼠 IgG 为二抗，二氨基联苯胺（DAB）为底物进
行蛋白印迹分析。
1.2.8 免 疫 磁 珠 制 备 与 免 疫 磁 珠 平 板 法（IMB-
PALCAM）灵敏度分析 使用 25 μL proteinG 磁珠与
分别与 10 μL 的兔抗副溶血弧菌血清与鼠抗 ompK
蛋白血清在常温下偶联 1 h，用灭菌 PBS 缓冲液清
洗 3 次之后用 5%BSA 封闭 1 h，随后灭菌 PBS 洗两
次，将制备好的免疫磁珠至于 4℃保存。将副溶血
弧菌按照麦氏比浊法用灭菌 PBS 缓冲液调整浓度至
109 CFU/mL。之后 10 倍梯度稀释直到 102 CFU/mL。
之后由 105 CFU/mL 开始，每个浓度分别用两种免疫
磁珠进行富集并且使用稀释菌液直接涂平板作为对
照，每一浓度重复试验两次。经过 1 h 的反应之后，
将免疫磁珠用灭菌 PBS 缓冲液洗 3 次。将其涂在显
色平板上。培养 18 h，观察结果。
2 结果
2.1 ompK基因的PCR扩增
PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测，观察到
750 bp 左右的扩增片段，与 ompK 基因预期片段大
小一致（图 1）。
100
bp
M 1
250
500
750
1000
2000
M ：DNA marker DL2000 ；1 ：ompK PCR 扩增产物
图 1 ompK 基因的 PCR 扩增产物电泳
2.2 扩增载体pMD18T-ompK的酶切鉴定
重组质粒经 PCR 鉴定可以扩增出 750 bp 左右
片段。用 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切获得 2 900 bp 和
750 bp 的片段（图 2），证实 ompK 已成功克隆到 T
载体。经测序鉴定，阅读框架正确，与 GenBank 发
布的 ATCC17802 株 ompK 基因序列相比较，其核苷
酸序列同源性为 99%，推导出的氨基酸序列同源性
为 99%。
100
bp
M 1
250
500
750
1000
2000
M ：DNA marker ；1 ：重组质粒 pMD-18T（+）-ompK 经 BamHⅠ和
XhoⅠ双酶切
图 2 pMD-18T（+）-ompK 的酶切鉴定
2.3 表达载体pET28a（+）-ompK的酶切鉴定
对质粒 pET28a（+）-ompK 用 BamHⅠ和 XhoⅠ
双酶切可获得 5 400 bp 和 750 bp 的产物（图 3）。证
明 ompK 基因已成功插入 pET28a 表达载体。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期212
2.5 重组ompK蛋白的纯化鉴定
包涵体蛋白经镍柱亲和层析纯化得到目的蛋白，
凝胶电泳分析其纯度在 95% 以上（图 5）。
100
bp
M 1
250
500
750
1000
2000
M ：DNA marker ；1 ：重组质粒 PET28a（+）-ompK 经 BamH Ⅰ和
Xho Ⅰ双酶切
图 3 PET28a（+）-ompK 的酶切鉴定
2.4 重组蛋白可溶性鉴定
转 化 后 的 E. coli BL21 经 IPTG 诱 导 后， 在 30
kD 左右有明显的条带出现（图 4），与预期蛋白大
小一致。说明重组 ompK 蛋白诱导表达成功，表达
蛋白几乎都是以包涵体形式存在。进一步摸索其最
佳表达条件为 28℃、0.1 mmol/L IPTG 诱导 8 h。
97.4
kD
M 1 2
66.2
43
31
20.1
14.4
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：上清 ；2 ：沉淀
图 4 诱导表达菌体经超声破碎后的 SDS-PAGE 分析
3.5
O
D
45
0
2.5
1.5
0.5
0
1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000
Serum dilutied times
1.0
2.0
3.0
Salmonella
typhimurium CMCC
50093
Escherichia coli
ATCC 25922
Vibrio
parahaemolyticus
ATCC 17802
Negtive serum to
ATCC 17802
Listeria
monocytogenes
54002
Salmonella
typhimurium CMCC
50093
Escherichia coli
ATCC 25922
Vibrio
parahaemolyticus
ATCC 17802
Negtive serum to
ATCC 17802
Listeria
monocytogenes
54002
Staphylococcus
aureus ATCC 6538
O
D
45
0
2.5
1.5
0.5
0
1.0
2.0
3.0
170
kD
M 1
130
100
70
55
40
35
25
17
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：经纯化的 Ompk 蛋白
图 5 亲和层析纯化 ompK 蛋白的 SDS-PAGE 分析
图 6 多克隆抗体效价与交叉性分析
2.6 鼠多克隆抗体效价及交叉性分析
间接 ELISA 结果表明制备的多抗与灭活副溶血
弧菌效价可达 1∶64 000，与革兰氏阳性菌单增李斯
特菌以及金黄色葡萄球菌完全不反应（图 6）。与革
兰氏阴性菌大肠杆菌与沙门氏菌效价仅有 1∶2 000
与 1∶8 000 左右，造成这个结果的原因可能是纯化
蛋白中还含有少量的大肠杆菌膜蛋白。
2.7 Western blotting检测
结果（图 7）表明，兔抗副溶血弧菌全菌多克隆
抗体能够与 30 kD 处重组表达的 ompK 蛋白产生特
异性反应而对空载体无特异性反应，制备的抗 ompK
血清能与副溶血弧菌 28 kD 左右的条带特异性反应。
2013年第6期 213李雨辰等 ：副溶血弧菌外膜蛋白 ompK 免疫磁珠检测方法的建立
副溶血弧菌具有多种血清型，而且血清型与其
致病性之间并无直接关系［12］。免疫磁珠富集方法
的主要难点在于副溶血弧菌表面 O 与 K 抗原的多样
性导致的以全菌多抗或者 O 与 K 抗原制备的免疫
磁珠不能够对各种血清型副溶血弧菌具有均一的富
集效果。外膜蛋白（OMPs）是细菌表面一类蛋白，
在维持自身菌体结构及物质转运方面发挥着重要作
用［13-15］，而且具有较强的免疫原性。ompK 蛋白已
经被验证是弧菌表面保守抗原之一，但是目前的研
究集中于 ompK 蛋白作为疫苗使用效果［13］，未有相
关免疫磁珠富集研究。由于蛋白 ompK 的保守性，
所以能够避免因为血清型不同所造成的漏检错检，
以 ompK 制备的多克隆抗体相比于全菌多抗对不同
血清型副溶血弧菌的富集效果更加稳定。本研究制
备的鼠抗 ompK 蛋白血清与副溶血弧菌反应性较好。
虽然同革兰氏阴性菌沙门氏菌及大肠杆菌存在一定
交叉性，但与副溶血弧菌反应性显著优于与革兰氏
阴性杂菌反应性，这与文献中报道的 ompK 蛋白在
弧菌属中的抗原保守性结果一致。
弧菌显色培养基通过在培养基中加入特异性酶
的显色底物，直接根据菌落颜色就可以对菌种做出
鉴别，减少了对菌株进行纯培养和进一步生化鉴定
的步骤，能大大提高检测效率。卢勉飞等［16］用多
种常见病菌对于环凯公司的副溶血弧菌显色培养基
进行了验证，结论是这种副溶血弧菌培养基能够准
确验证副溶血弧菌。本研究利用自制抗 ompK 免疫
磁珠与这种显色平板联用，达到了快速检测副溶血
弧菌的目的。虽然在磁珠富集这一步中与其它革兰
氏阴性菌会有一定交叉，但是通过特异性副溶血弧
菌显色平板可以对试验结果实现准确验证。检测限
能达到 104 CFU/mL，与传统增菌检测法相比，检测
时间能够缩短 72 h ；与传统免疫学检测方法相比敏
感度增强两个数量级 ；与抗副溶血弧菌全菌多抗免
疫磁珠富集检测方法相比，敏感度处于同一数量级，
但是特异性更强。通过进一步试验条件摸索，能够
进一步增强此方法的灵敏度，这也将是下一阶段的
研究目标。
4 结论
成功制备抗副溶血弧菌 ompK 蛋白免疫磁珠，
1 2 3
1: 兔抗副溶血弧菌全菌与表达 ompK 蛋白反应 ; 2: 未插入表达载体工程菌与
ompK 多克隆抗体反应 ; 3: ompK 多克隆抗体与副溶血弧菌反应
图 7 Western blotting 鉴定 ompK 与多抗血清
2.8 免疫磁珠敏感度分析
经过 18 h 培养后观察培养基表面，出现紫红色
副溶血弧菌菌落则结果为阳性，未出现副溶血弧菌
菌落结果为阴性。结果如表 1 所示，表明两种多克
隆抗体的 IMB-PALCAM 法都检测出 104 CFU /mL 与
105 CFU /mL 浓度下的副溶血弧菌 ；而作为对照的未
与抗体偶联磁珠则未能在 105 CFU /mL 浓度下对副溶
血弧菌有富集效果。该法能检测浓度为 104 CFU/mL
以上的副溶血弧菌 ；对于浓度在 103 CFU /mL 及以
下水平的副溶血弧菌无法检出，重复试验结果与之
前保持一致。IMB-PALCAM 法检测副溶血弧菌的检
测限确定为 104 CFU /mL。
表 1 IMB-PALCAM 检测不同浓度 VP
磁珠类型 菌浓度（CFU/mL） IMB-PALCAM
鼠抗 ompK 蛋白免疫磁珠 105 +
104 +
103 -
兔抗副溶血弧菌全菌免疫磁珠 105 +
104 +
103 -
未与抗体偶联磁珠 105 -
+ ：能够在显色平板上观察到副溶血弧菌菌落 ；- ：不能在显色平板上观察到
副溶血弧菌菌落
3 讨论
副溶血弧菌的免疫学检测方法往往以其毒力因
子作为检测对象，传统免疫学检测方法往往针对其
TDH（耐热溶血素），TRH（相对耐热溶血素）等制
备单克隆抗体［8］，从而达到检验的目的。然而副溶
血弧菌的毒力基因也存在于其他弧菌之中，可能造
成漏检与误检。并且对于毒力因子检测需要长时间
的增菌以达到一定浓度才能被检出［9-11］，所以免疫
磁珠富集法相对于传统的免疫学检测方法具有直观、
准确的优势。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期214
免疫磁珠与弧菌显色平板结合能够在 20 h 内对副溶
血弧菌菌液完成检测，敏感度可达 104CFU/mL。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）