全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌
彭帅 1 石磊 2
( 1华南理工大学生物科学与工程学院,广州 510640; 2华南理工大学轻工与食品学院,广州 510640)
摘 要: 副溶血弧菌广泛分布于海水或海产品中, 人类摄入或接触污染的水源和食物易引起感染。近年来,有关致病
性弧菌引起腹泻的报道逐渐增多,但 GB标准的细菌学诊断方法检测周期长达 1周左右, 而且操作较为复杂, 难以满足控制疾
病暴发和传播的需要 ,就这一现状, 建立了一套不仅快速、准确, 而且操作简便、不依赖昂贵仪器的检测方法, 应用于海产品中
副溶血弧菌快速检测。采用环介导恒温扩增方法 ( LAMP ),针对副溶血弧菌的 gyrB基因设计特异引物, 进行恒温扩增。使用
该方法最低检出限达到 101CFU /mL,灵敏度可以达到 0. 1 pg副溶血弧菌基因组 DNA, 为海产品中副溶血弧菌的检测提供了一
个新的辅助方法。
关键词: 副溶血弧菌 环介导恒温扩增 ( LAM P) gy rB基因
Rapid Detection ofVibrio parahemolyticus in Seafood by
Loop-mediated IsothermalAmplification
Peng Shuai
1 Shi Lei2
(
1
School of B ioscience& Bioengineering, South China University of T echnology, Guangzhou 510640;
2
College of L ight Industry and Food Sciences, South China University of T echnology, Guangzhou 510640)
Abstrac:t V ibrio parahem oly ticus is w ide ly distributed in seaw ate r or seafood, hum an contact w ith contam inated w ater or food w ill
be easily caused infection. Recently, reports o f d iarrhea caused by the pathogen ic V ibr io gradually increased. But theGB standard bac-
ter io log ica l diagnostics test cycle up to 1 w eek or so, and the operation is comp lex, d ifficu lt to m ee t the need of contro l of d isease ou-t
breaks and spread. Loop-m ed iated iso therma l amp lification is a novel nuc leic ac id am plification m ethod in wh ich reagents react under -i
sotherm al conditions w ith high specificity, e fficiency, and rapidity. In th is study, the LAMP m ethod w as em ployed in rapid detection of
V ibrio parahem oly ticus in seafood. The spec ies-specific prim ers were designed by targeting the gyrB gene. The resu lts show ed that the
m ethod is sensitive; the 101CFU /mL of V ibrio parahemo ly ticus o r 0. 1 pg genom e DNA can be detected w ith in 4 hours. Th is new me thod
m ight facilitate genetic analysis app lied in V ibrio parahem oly ticus in seafood.
Key words: V ibrio parahem oly ticus Loop-m ediated iso therm a l amp lification( LAMP) gyrB gene
收稿日期: 2010-08-11
基金项目:国家自然科学基金项目 ( 20877028) , 2008年珠海市产学研专项项目 ( PC 20082034)
作者简介:彭帅,男,硕士研究生,研究方向:分子生物学及食品安全检测; E-m ai:l gw zps211@ 126. com
通讯作者:石磊,教授,博士生导师, E-m ai:l leish@i scu t. edu. cn
副溶血弧菌 ( Vibrio parahemolyticus)是我国沿海
地区常见的食物中毒病原菌。据报道, 我国沿海地
区近 10年来由该菌引起的食物中毒占细菌性食物
中毒事件的首位, 可引起人类胃肠炎和败血症。
2010年 2月浙江温州市疾控中心进行的一项致病
性弧菌的污染情况调查可以看出,在 149份样本中
有 25份呈现副溶血弧菌阳性,检出率为 1678% [ 1] ,
然而 GB标准的细菌学培养方法存在检测周期长、
操作复杂等缺点。
环介导恒温扩增 ( LAMP), 是一种基因扩增的
方法 [ 2]。该技术的反应原理是根据序列保守区域
设计的一对外引物和一对内引物特异性识别靶序列
上的 6个独立区域, 在 B st DNA聚合酶的作用下引
起自循环链置换反应, 60- 65 范围 60 m in内, 大
量合成目标 DNA的同时伴随有副产物 白色的
焦磷酸镁沉淀产生 [ 3]。No tom i等 [ 4 ]用 LAMP反应
2011年第 2期 彭帅等:环介导恒温扩增法快速检测海产品中的副溶血弧菌
来检测体系中只有 6个拷贝的肝炎病毒 (HBV ) ,试
验结果证明,同时存在于反应混合液中的 100 ng人
基因组 DNA没有影响到检测结果。此外, 该方法的
另一特点是由于这种特殊的引物设计, 不仅保证了
扩增反应发生的特异性, 而且使得引物介导的链延
伸循环过程和子代 DNA自身环化形成茎环结构引
导链延伸过程同时存在,因此反应效率很高, 可在 1
h内实现 109水平扩增 [ 2] , 能够满足快速检测的需
要。重要的是检测过程无需额外设备, 同时也省去
了常规 PCR方法需要电泳分析的操作, 大大降低了
技术的使用成本,易于普及、推广 [ 5]。
目前,国内副溶血弧菌的 LAMP检测所设计的
引物都是针对 tlh毒力基因。本试验以副溶血弧菌
gyrB基因为靶序列设计引物,着重在灵敏度和特异
性等方面对此方法进行证实, 期望建立的 LAMP反
应条件能够对今后的病原微生物的检测研究工作起
到参考作用。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株 副溶血弧菌、沙门氏菌、阪崎肠杆菌、
单核增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌
O157为本实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂和仪器 B st DNA聚合酶, 10
thermopol缓冲液, New Eng land B io labs公司; 硫酸
镁,甜菜碱, Syber G reen , S igm a公司; dNTP,大连
宝生物公司, 引物合成由英骏 ( Inv itrogen )公司完
成。凝胶成像分析系统 UN IVERSAL HOOD, B io-
RAD公司; THZ-82型恒温水浴震荡器, 江苏金坛富
华电器公司;高速冷冻台式离心机, Thermo公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA模板制备 采用煮沸法 8 000 r /m in离
心 1 mL菌液,加 500 L DW 悬浮菌体, 101 保温
10 m in后置冰上放 10 m in。最后, 10 000 r/m in离
心 2 m in,取上清液作为扩增模板。
1. 2. 2 LAMP扩增条件 选择副溶血弧菌的 gyrB基
因,针对其中的 6个不同区域设计的 4个引物为: 内
引物 FIP、BIP,其中 F1引物和 F2c引物组成 FIP, B1
引物和 B2c组成 B IP。外引物 F3和 B3,分别位于内
引物 F2c和 B2c引物的外侧。F3引物序列: 5-CG-
TAAACGCAGAAGCTCCA-3; B3引物序列: 5-TGGCT-
TGCACCCACTTC-3; F IP引物序列: 5-CGGCTCAT-
ACGATCAGCAAGCTTCTAGCTGGCGAAGCACTAG-3;
BIP引物序列: 5-TCGTTACCCTCGCGCCTTAGTTGCT-
GCTGCATCATGACAC-3。本试验采用 25 L的反应
体系,包括 FIP和 B IP内引物各 1. 6 mo l/L, F3和 B3
外引物各 0. 2mol/L, 16 mmol /L的 dNTP, 6mmo l/L
的 MgSO4, 1 mo l/L 甜菜碱, 8U B st DNA聚合酶。混
合物在 65 水浴 50m in,待反应结束之后,加入 Syber
green,观察结果。
1. 2. 3 LAMP法检测副溶血弧菌的特异性 分别
使用了沙门氏菌、阪崎肠杆菌、单核增生李斯特菌、
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 O157, 在 65 条件下
反应 50m in,检查其特异性。
1. 2. 4 LAMP法检测副溶血弧菌的灵敏性 通过
对副溶血弧菌 DNA模板进行连续梯度的稀释,分别
作为模板,用以上扩增条件来进行 LAMP反应。将
模板 DNA分别稀释成以下 7个梯度: 1 ng, 100 pg,
10 pg, 1 pg, 0. 1 pg, 10 fg和 1 fg。
1. 2. 5 LAMP法检测人工污染海产品中的副溶血
弧菌 从市场上购买海蜇样品, 首先使用 GB方法
对样品中副溶血弧菌进行检测, 若结果呈现阴性,
则进行人工污染试验, 并参考文献 [ 6]中的方法。
取灭菌的 15 mL大离心管并加入灭菌的 5 mL的
LB培养基, 将若干份 5 g的新鲜海蜇分别置于其
中。将增菌液用无菌蒸馏水以 10倍的关系释成
一系列浓度, 将稀释好的增菌液添加到上述大离
心管中, 使得菌液的终浓度的范围呈现 104至 10- 1
CFU /mL 6个浓度梯度, 并且以 5 mL水作为阴性
对照。然后于 37 分别进行 0、4、6、8 h的富集培
养, 0 h指经过污染之后立即进行 LAMP检测。具
体检测方法为: 取 1 mL增菌液, 16 000 r /m in离心
10m in,用 1 mL的无菌蒸馏水洗涤并重新悬浮沉
淀。将上述液体在水浴中加热煮沸 10 m in。随后
1 500 r /m in离心 30 s,取 5 L作为模板进行 LAMP
反应。
2 结果
2. 1 LAMP最佳扩增条件的确定
主要从温度和时间两方面对 LAMP反应进行考
虑。以副溶血弧菌 DNA为模板, 进行 LAMP扩增。
分别对比不同反应温度 ( 61、63、65 ) ,反应完成之
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
后加入 Syber green,肉眼观察,并对扩增产物进行
琼脂糖凝胶电泳, 从反应结果来看, 并没有显著影
响,结果均为阳性。有文献表明, 65 有利于提高
LAMP反应的特异性 [ 7] ,因此本试验皆选择 65 为
反应的最佳温度;分别对比不同反应时间,条件分别
设置为 30、40、50和 60m in,在 65 下反应时, 30和
40 m in反应时间,在加入 Syber g reen后,均未观察
到发生扩增。而在 50和 60 m in条件下则观察到了
扩增反应的发生。
2. 2 LAMP法检测副溶血弧菌的特异性
选择几种常见的食源性致病菌的模板 DNA 50
ng作为对照来确定此方法检测副溶血弧菌的特异
性,包括沙门氏菌、阪崎肠杆菌、单核增生李斯特菌、
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌 O157, 最终在 65 条
件下反应 50m in,其结果均为阴性。
2. 3 LAMP法检测副溶血弧菌的灵敏度
使用以上试验优化的反应条件 ( 65 反应 50
m in)进行 LAMP检测。结果 (图 1)表明, 该方法的
灵敏度达到每个反应体系 0. 1 pg模板 DNA。
M2kb DNA ladder; 1. 阳性对照; 8.阴性对照; 2- 7.所使
用副溶血弧菌 DNA模板的浓度分别为 1 ng, 100 pg,
10 pg, 1 pg, 0. 1 pg, 10 fg和 1 fg
图 1 LAMP法检测副溶血弧菌的灵敏度
2. 4 LAMP法检测人工污染海产品中的副溶血
弧菌
利用 LAMP法对人工污染海产品中的副溶血弧
菌进行扩增,经 0 h富集后, 终浓度 104 CFU /mL、103
CFU /mL、102 CFU /mL的人工污染海蜇中副溶血弧
菌检测结果就呈阳性; 经 4 h的富集后,终浓度 101
CFU /mL的人工污染海蜇中副溶血弧菌检测结果便
呈阳性;经 8 h的富集后, LAMP反应检测副溶血弧
菌的灵敏度甚至可以达到 100 CFU /mL。
3 讨论
副溶血弧菌是一种嗜盐生长的革兰氏阴性
菌,人类因使用污染有该菌的食品后, 可引起严重
的肠胃炎 [ 8 ]。近年来, 由于副溶血弧菌引起的食
物中毒呈上升趋势, 尤其在沿海地区导致的食物
中毒, 无论是影响范围还是人群暴露规模都已超
过沙门氏菌引起的食物中毒。目前检测食物中的
副溶血弧菌标准方法为 GB法, 由于该方法是一种
传统的细菌培养方法, 需要经过多个步骤, 检测周
期长, 未能满足快速检测的需要。然而以 PCR方
法为代表的分子生物学技术, 大大提高了检测效
率,却由于需要依赖较为昂贵的 PCR仪而未能普
及。而 LAMP方法不仅具有较高的特异性和灵敏
度,且操作简便, 不依赖昂贵的分析仪器, 克服了
传统方法操作繁琐、检测周期长的缺点, 因此具有
广泛的应用前景。
目前,在国内相关文献中 [ 9] , 对于副溶血弧菌
的 LAMP检测仅仅是针对 t lh毒力基因设计引物,而
本研究的 LAMP引物则是以其 gyrB基因为靶序列
设计,并对反应体系进行了优化。该检测方法对目
的 DNA的检出限达到了 0. 1 pg;随后的人工污染试
验中, 经过 4 h 的富集之后的检出限能达到
10
1
CFU /mL;而经过 8 h的富集, 检出限可以达到
10
0
CFU /mL。这种方法相对于 GB推荐方法, 极大
地提高了灵敏度,也缩短了检测周期。
参 考 文 献
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2011年第 2期 吕佰瑞等: DC-SIGN胞外区基因的克隆、蛋白表达及抗体制备
手段克隆得到 DC-SIGN胞外区片段, 诱导原核细胞
高表达 DC-S IGN胞外区蛋白,免疫日本大耳白兔获
得高效价的抗 DC-SIGN抗体。通过 EL ISA和免疫
荧光法鉴定所制备的多克隆抗体具有良好的特异性
和高度的亲和力, 为深入研究DC-SIGN的生物学功
能提供试验基础。
参 考 文 献
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