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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
棉花纤维是全球重要的纺织原料之一，是第一
大产天然纤维的作物，具有重要的经济价值，在世
界及我国国民经济中均占有十分重要的地位［1，2］。
近年来由于我国纺织技术的发展以及国民需求的日
益增长，对棉花纤维的品质提出了更高要求，亟待
在纤维品质方面进行改良以满足生产生活的需求。
收稿日期 ：2014-03-03
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31260339），兵团创新项目（2012BB050，2013CB010），石河子大学杰青项目（2012ZRKXJQ03）
作者简介 ：李榕，女，硕士研究生，研究方向 ：植物基因工程 ；E-mail ：782348048@qq.com
通讯作者 ：李鸿彬，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向 ：植物分子生物学与基因工程 ；E-mail ：lihb@shzu.edu.cn
一个棉花微管结合蛋白基因 GhSP1L5 的克隆及
表达分析
李榕1  寇伟1  谭兰1  贺怡1  梁卓1  李鸿彬1，2
（1. 石河子大学生命科学学院，石河子 832003 ；2. 石河子大学农业生物技术重点实验室，石河子 832003）
摘 要 ： 利用 RT-PCR 技术从处于快速伸长发育时期的棉花纤维组织中克隆得到 Spiral1-Like（SP1L5）基因（GhSP1L5），其
开放读码框为 315 bp，编码 105 个氨基酸的蛋白质，生物信息学分析表明，GhSP1L5 蛋白 N 端和 C 端较为保守，并含有 SCOP 结构域，
是典型的微管结合蛋白。进化树分析表明该基因与 SP1L5 家族基因的亲缘关系较近。构建原核表达载体 pET28a-GhSP1L5，转化
大肠杆菌 BL21（DE3）并进行体外诱导表达，通过 SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达，获得分子质量约为 12 kD 的重组蛋白。QRT-
PCR 结果分析表明 GhSP1L5 基因在开花后 15 和 20 dpa 的纤维组织中表达量较高，在棉纤维发育的其他时期及根、茎、叶组织中
表达量较低。
关键词 ： 棉花纤维 Spiral1-Like5 基因 微管结合蛋白 表达
Cloning and Expression Analysis of a Cotton Microtubule Associated
Protein Gene of GhSP1L5
Li Rong1 Kou Wei1 Tan Lan1 He Yi1 Liang Zhuo1 Li Hongbin1，2
（1. College of Life Sciences of Shihezi Universtiy，Shihezi 832003 ；2. Key Laboratory of Agrobiotechnology of Shihezi University，
Shihezi 832003）
Abstract: A cotton Spiral1-Like5（GhSP1L5）full-length open reading frame（ORF）cDNA was cloned from fast elongating fiber
tissue by RT-PCR method, The GhSP1L5 gene contains 315 bp necleotides and codes a protein of 105 amino acids. Through sequence function
analysis and homology sequence alignment, GhSP1L5 protein includes several microtubule associated protein binding sites and SCOP domains.
Phylogenetic tree analysis showed that GhSP1L5 has a similar relationship with SP1L5 protein family. Prokaryotic expression vector pET28a-
GhSP1L5 was constructed and transformated into E.coli BL21（DE3）. Recombinant GhSP1L5 protein was obtained after induction by IPTG
and SDS-PAGE analysis with a MW of ~12 kD. Quantitative RT-PCR analysis showed that the GhSP1L5 gene expresses highly at 15 dpa and 20
dpa fiber tissues compared with the expressions in root, stem, leaf and fiber tissuse of other development stages. GhSP1L5 cloning and expression
analysis establish a basis for its further functions in cotton fiber development.
Key words: Cotton fiber Spiral1-Like5 gene Microtubule associated protein Expression
纤维的强度和长度是棉花纤维品质中重要的参考指
标，细胞的伸长或膨大发育与纤维品质形成密切相
关［3］。
微管是构成细胞骨架的重要成分，在维持细
胞形态、细胞分裂、细胞运动与运输以及信号转导
等方面都发挥着重要的作用［4］。微管的形成发育
2014年第10期 83李榕等：一个棉花微管结合蛋白基因 GhSP1L5的克隆及表达分析
与细胞的伸长发育密切相关，在棉纤维伸长发育过
程中发挥着重要作用。微管结合蛋白（Microtubule
associated proteins，MAPs）是一类结合于微管骨架
上的蛋白，能够促进微管成束，帮助微管形成不同
列阵。Spiral1（SPR1）是植物特有的能与微管正端
相互作用的蛋白［5，6］，其同源蛋白 Spiral1-Like（spiral
1 like，SP1L）结构上与 SPR1 相似，都有几乎相同
的重复序列［7，8］，暗示了它们在功能上的相似性。
从拟南芥中鉴定出 5 种 SPR1 的同源蛋白编码基因，
命名为 SP1L1-SP1L5，它们在不同的器官中以不
同的水平表达。周质微管能调节细胞延伸的方向，
SPR1 与周质微管共定位，并且快速伸长的细胞中
SPR1 的表达水平上升。SPR1 突变能引起根轴旋转、
下胚轴变白、内胚层和皮层细胞各向异性生长降低，
SPR1 和 SP1L 均可以恢复由突变引起的细胞生长异
常的表型，这也暗示了 SP1L 在细胞生长方向发育
中的重要功能［6］。许多研究表明［6，9-11］，在棉纤维
伸长发育过程中微管的形成与发育发挥着重要作用，
微管的形成和发育离不开微管结合蛋白。目前对于
微管结合蛋白参与棉纤维发育的相关研究鲜有报道。
对棉花纤维中 GhSP1L5 基因的克隆及表达分析，
将有助于解析微管结合蛋白参与棉纤维发育的重要
功能并有助于解析棉花纤维发育的分子机制。因此
本研究从棉花纤维组织中克隆得到 GhSP1L5 基因，
分析该基因编码的蛋白质结构和序列特征并预测可
能的功能，体外重组表达 GhSP1L5 蛋白，使用 qRT-
PCR 方法进行半定量分析研究该基因在棉花纤维发
育中的表达特征，旨在研究 GhSP1L5 基因参与棉花
纤维发育的可能功能。
1 材料与方法
1.1 材料
陆地棉徐 142 由本实验室培养，纤维细胞经液
氮速冻后于 -80℃保存。E. coli Top10 由本实验室保
存，原核表达载体 pET-28a 购自大连宝生物公司。
凝 胶 回 收 试 剂 盒、 质 粒 提 取 微 量 试 剂 盒 购
自 TIANGEN 公 司 ；RNA 反 转 录 试 剂 盒、TaKaRa
LA Taq DNA 聚 合 酶、T4 DNA 连 接 酶、EcoR Ⅰ、
BamH Ⅰ、Xho Ⅰ等相关酶购自大连宝生物公司 ；其
他相关试剂均为国产分析纯，购自上海生工生物工
程公司。
PCR 仪（Biomotra Tpersonal）、电泳仪（Tannon
Epson100 型 ）、 高 压 蒸 汽 灭 菌 锅（HVE-50）、
Eppendorf 5417 R 型台式冷冻离心机、凝胶成像系统
和恒温摇床（HWY-100B）等。
1.2 方法
1.2.1 棉花总 RNA 的提取 所使用的研钵经高压灭
菌和酒精灼烧，其他器皿均经 DEPC 处理，根据改
良的 CTAB 法提取棉花总 RNA［12］。
1.2.2 GhSP1L5 基因的克隆 从 GenBank EST 数据
库中所获得的完整 cDNA ORF 基因片段进行保守性
分析后，利用 Primer Premier5.0 进行引物设计。用
Prime-ScriptTM 反转录试剂盒以总 RNA 为模板合成
cDNA［13］，通过 PCR 扩增获得全长的 GhSP1L5 基因。
在 GhSP1L5 和 表 达 载 体 pET-28a 两 端 设 计
BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ的酶切位点（下划线）和保护性
碱基 ：正向引物 ：5-CGGGATCCATGAGTAGAGGTG-
GGAGCT-3 ；反向引物 ：5-CCGCTCGAGCTTCTCAC-
CAAACAGGTAACC-3。
PCR 反应条件为 ：94℃预变性 4 min ；94℃预变
性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 60 s，30 个循环 ；
72℃延伸 10 min ；4℃存放。
1.2.3 蛋白质序列比对和结构域分析 蛋白质序列
比对通过 Clustalx1.81 软件和 NCBI 网站在线完成，
通过 MEGA 软件完成进化树构建。
1.2.4 重组 GhSP1L5 蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE
分析 原核表达载体 pET28a-GhSP1L5 的构建、鉴定、
重组蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 分析参考实验室
常规方法完成［14，15］。
1.2.5 棉花 GhSP1L5 基因 QT-PCR 分析 样品采集：
徐 142 野生型棉花幼苗根、茎、叶的准备 ：用自来
水浸泡棉种 1-2 dpa，待露出培根后移栽入土中进行
培养，约 7 dpa 左右待幼苗长出真叶后可进行采样 ；
棉纤维胚珠混合样的准备 ：将棉花花朵授粉当天命
名为 0 dpa，标记授粉当天的花朵若干，之后试验需
要分别采取授粉后 -3、0、3、5、10、15 和 20 dpa
（Days post anthesis 授粉后天数）的纤维和胚珠组织
混合材料、10 dpa 无长绒无短绒突变体胚珠材料、
棉花根、茎、叶材料，以液氮速冻后于 -80℃保存备
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期84
用。根据改良的 CTAB 法提取各材料总 RNA［16］，反
转录成 cDNA，并以其为模板，使用 TaKaRa 公司生
产的 SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒，运用 LightCycler
480 System 对 GhSP1L5 基因的表达量进行 QT-PCR
分析。选择 UBQ7 为内参基因，引物序列为 ：上游 ：
5-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3 ；下 游 ：5-GGG-
CTTGGCTTGATCTT-3。
GhSP1L5 的 QT-PCR 的 引 物 序 列 为 ：上 游 ：
5-CCTTGGGCTACCTCTTTGG-3 ；下 游 ：5-TGAAT-
TCTGTCCTTGAGCCC-3。
PCR 反应条件为 ：95℃预变性 5 min ；95℃预变
性 45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 30 s，30 个循环 ；
72℃延伸 7 min，4℃保存。
2 结果
2.1 棉花GhSP1L5基因克隆
使用 CTAB 法提取棉花纤维组织中的总 RNA ：
所提取的总量 RNA 呈现 28S、18S 完整条带，同时
28S 的含量约为 18S 的 2 倍，所提取的 RNA质量较
好，可以继续进行后续反转录及基因克隆的试验（图
1-A）。以反转录获得的 cDNA 作为模板，经过 PCR
扩增得到特异性条带，经测序正确后获得 GhSP1L5
基因的全长开放读码框（图 1-B），包含 315 个碱基
对的核苷酸，编码含有 105 个氨基酸的蛋白质。
进行对比 ：拟南芥 AtSPR1、拟南芥 AtSP1L1-5、野
草 莓 FvSP1L5、 黄 瓜 CsSP1L5、 玉 米 ZmSPR1、 番
茄 SlSP1L、 蓖 麻 RcSP1L。 结 果 显 示， 植 物 中 的
GhSP1L5 蛋白质在 N 端和 C 端的氨基酸序列相似性
较高，GhSP1L5 蛋白质具有保守的结构域，黑色部
分为保守的氨基酸序列，灰色部分为保守性一般的
序列。GhSP1L5 蛋白包含多个微管蛋白结合位点（图
2-A 虚线所示）和与蛋白相互作用相关的 SCOP 结构
域（图 2-A 实线所示）。进化树分析结果（图 2-B）
表明 GhSP1L5 与黄瓜 CsSP1L5 在进化亲缘关系上
较近。
2.3 原核表达载体pET28a-GhSP1L5的构建与鉴定
经 测 序 后 比 对 正 确 的 重 组 质 粒 pGEM-T-
GhSP1L5 和 pET-28a 原核表达载体同时用 BamH Ⅰ
和 Xho Ⅰ进行双酶切，回收目的基因小片段和原核
表达载体大片段，连接后转化大肠杆菌 Top10 感受
态细胞，挑取转化成功的单克隆做菌落 PCR 鉴定（图
3-A），PCR 鉴定为阳性单菌落的摇菌提取其质粒
进一步做双酶切鉴定（图 3-B），成功构建 pET28a-
GhSP1L5 原核表达载体。
2.4 重组GhSP1L5蛋白的诱导表达
将构建成功的 pET28a-GhSP1L5 重组子转入大
肠杆菌表达菌株 BL21（DE3）中，经 PCR 筛选鉴定
后，进行扩大培养，利用 IPTG 诱导菌体表达，提取
蛋白质后进行 SDS-PAGE 电泳（图 4）分析，获得
了大小约为 12 kD 左右的重组蛋白 GhSP1L5。
2.5 棉花GhSP1L5基因的表达特征分析
通过定量 PCR 分析 GhSP1L5 基因在棉花幼苗
根、茎、叶，棉花开花前 -3、0 dpa 和开花后 3、5、
10、15、20 dpa 的纤维和胚珠组织，以及无长绒无
短绒突变体（fl）开花后 10 dpa 的胚珠中的表达情况。
结果（图 5）表明，GhSP1L5 基因野生型棉花开花
后 15 和 20 dpa 的纤维组织中表达较高，在根、茎、
叶中及其他发育时期的纤维组织中表达较低。说明
GhSP1L5 基因的表达可能与棉花纤维伸长及次生壁
发育有关。
3 讨论
微管在细胞发育、形态建成和物质运输等过
程中发挥着重要作用，通过参与细胞各种生理活动
4500
bp
M 3
1 2
3000
2000
1200
800
500
200
28S
18S
A
B
1，2 ：纤维组织 RNA 电泳条带 ；3 ：PCR 扩增条带 ；M ：DNA Marker Ⅲ
图 1 棉花纤维组织总 RNA 提取（A）及 GhSP1L5 基因的
克隆（B）
2.2 序列比对与进化树分析
将 GhSP1L5 基因的 cDNA 序列翻译为氨基酸序
列，并与以下几种微管结合蛋白基因的氨基酸序列
2014年第10期 85李榕等：一个棉花微管结合蛋白基因 GhSP1L5的克隆及表达分析
A ：棉花 GhSP1L5 蛋白质与其他几种 SPR1 蛋白质序列对比（SCOP 结构域，蛋白结合位点）；
B ：棉花 GhSP1L5 与其他几种植物 SPR1 的进化树构建
图 2 GhSP1L5 的氨基酸序列比对（A）及进化树分析（B）
而发挥调控植物生长的作用，如细胞分裂、胞间运
输、染色体分离、和信号转导等［17-20］。植物细胞生
长和发育过程中，微管列阵会依次转换，这一过程
离不开微管结合蛋白的参与，微管结合蛋白通过影
响植物细胞骨架形成进而参与细胞伸长与膨大过程。
SP1L 是植物特有的一种微管结合蛋白，作用于微管
的正端，与微管的聚合密切相关［9，10］。
GhSP1L5 ：
AtSP1L1 ：
AtSP1L2 ：
AtSP1L3 ：
AtSP1L4 ：
AtSP1L5 ：
FvSP1L5 ：
CsSP1L5 ：
GhSP1L5 ：
AtSP1L1 ：
AtSP1L2 ：
AtSP1L3 ：
AtSP1L4 ：
AtSP1L5 ：
FvSP1L5 ：
CsSP1L5 ：
： 55
： 58
： 56
： 61
： 64
： 53
： 52
： 53
： 105
： 113
： 110
： 121
： 127
： 99
： 99
： 104
FvSP1L5
AtSP1L5
CsSP1L5
GhSP1L5
AtSP1L1
AtSP1L2
AtSP1L3
AtSP1L4100
95
46
55
79
0.2
A
B
4500
bp
MA 1 2 3 4
3000
2000
1200
800
500
200
4500
bp
MB 5
3000
2000
1200
800
500
200
M ：DNA Marker Ⅲ ；1，2 ：PCR 产物 ；3 ：阳性对照 ；4 ：阴性对照 ；
5 ：pET28a-GhSP1L5 重组子双酶切结果
图 3 pET28a-GhSP1L5 原核表达载体构建（A）及双酶切
鉴定（B）
1 2 3 4 5 6
117
kD M
85
49
34
25
19
M ：蛋白质分子量标准 ；1 ：pET-28a 空载体（IPTG 诱导 2 h）；2 ：未诱导的
蛋白表达 ；3-6 ：诱导 0、2、4 和 6 h 的蛋白表达 .
图 4 GhSP1L5 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE 分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期86
棉纤维细胞是由胚珠外珠被表皮层分化而来的
单细胞，在纤维发育过程中周质微管的排列发生活
跃的变化，微管骨架的形成及发育与棉纤维细胞的
伸长发育密切相关［9，21］。本研究从棉花纤维组织中
克隆获得一个微管结合蛋白基因 GhSP1L5，该蛋白
属于典型的 SP1L 家族，具有多个微管结合位点和功
能结构域，暗示了其可能与微管结合相互作用并参
与纤维细胞的发育过程。植物微管结合蛋白可以调
控植物微管骨架的动态和组织，以及微管与其他细
胞结构间的连接，从而在植物细胞的形态、分化和
发育等生理过程中起作用［22-28］。spr1 突变体中的周
质微管排列表现异常，SPR1 可以通过调节周质微管
进而调节细胞延伸的方向［6，8，16］。
GhSP1L5 基因在开花后 15-20 dpa 的纤维组织
中表达量较高，可能与棉花纤维伸长发育和次生壁
形成有关。微管的形成与发育在棉纤维伸长发育过
程中发挥着重要作用［29］。微管作用的发挥离不开微
管结合蛋白的参与。周质微管骨架的排列方式与细
胞壁纤维素微纤丝的排列极为相似，在纤维发育过
程中，二者总是发生同样的阵列改变，利用秋水仙
素等抑制剂能够破坏微管结构导致纤维素微纤丝发
生相似的损坏，SP1L 可能通过与微管相互作用对纤
维细胞壁微纤丝的结构和排列起控制作用［30，31］。
许 多 研 究 结 果 表 明 微 管 结 合 蛋 白 在 植 物 生
长发育中发挥着重要的功能。棉花微管结合蛋白
GhSP1L5 可能参与了棉花纤维发育过程，后期将进
一步开展 GhSP1L5 蛋白质相互作用研究、转化拟南
芥同源基因突变体研究、转化裂殖酵母研究等工作，
进一步验证 GhSP1L5 基因在植物细胞发育中的重要
功能。本试验为深入研究 GhSP1L5 基因调控植物生
长发育的生物学功能及其参与细胞伸长发育的分子
机制提供一定的参考。
4 结论
本 研 究 从 发 育 的 棉 花 纤 维 组 织 中 克 隆 得 到
GhSP1L5 基 因，GhSP1L5 蛋 白 具 有 多 个 微 管 蛋 白
结合位点和 SCOP 结构域，构建了原核表达载体
pET28a-GhSP1L5 并 通 过 诱 导 表 达 和 SDS-PAGE 分
析获得了大小约为 12 kD 左右的重组蛋白质，定量
PCR 分析显示 GhSP1L5 基因在开花后 15 和 20 dpa
的纤维组织中表达量较高。
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0
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WT
10 dpa 15 dpa 20 dpa 10 fl Root Stem Leaf
图 5 GhSP1L5 在棉花纤维发育过程中的表达分析
2014年第10期 87李榕等：一个棉花微管结合蛋白基因 GhSP1L5的克隆及表达分析
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（责任编辑 马鑫）