全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
!"#$)"*)#"
&修改稿收到日期$
!"#$)")!&
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基金项目$国家自然科学基金"
%#*+"%1+
#&新疆农业科学院优秀青年人才基金"
2
-
03
4
)!"#%""&
#&新疆自治区高技术研究发展计划"
!"######+
#
!!
作者简介$李
!
波"
#&1(
#!男!助理研究员!主要从事作物分子生物学研究
5)67.8
$
89:7;;
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!
/.07,?@6
!!"
通信作者$范
!
玲!研究员!主要从事棉花纤维品质分子机理和分子改良的研究
5)67.8
$
A708.0
B!
277/,7?,?0
陆地棉(徐州
$%&
)纤维不同发育时期
蛋白质组比较分析
李
!
波#!王
!
娟!!杨
!
洋#!范
!
玲#"
"
#
新疆农业科学院 核技术生物技术研究所!乌鲁木齐
1%""&#
&
!
新疆农业科学院 经济作物研究所!乌鲁木齐
1%""&#
#
摘
!
要$该研究以陆地棉(徐州
#*!
)为材料!于开花后
$
*
#"
*
#$
*
!"
*
!$
*
%"C
分别取样"棉铃#代表
+
个不同时期的棉
纤维!利用双向电泳技术比较了棉纤维发育不同时期蛋白质组的变化!以明确不同发育阶段差异表达蛋白质及其
功能与纤维发育之间的关系!为棉花产量和品质的改良提供理论依据结果显示$"
#
#随着棉花的发育!棉纤维中
的总蛋白含量逐渐降低!在开花后
$C
"
$DEF
#时棉花纤维中总蛋白的含量最高!达到
##,G
!同时
!)D5
图谱中
发现了
#$
个明显的差异蛋白点&"
!
#运用
HFIDJ)KLM)HN
对差异蛋白质点鉴定结果发现!有
$
个明显的差异蛋白
与棉花纤维发育相关!分别是
O:NFH
*
O:EOP
*
O:QND
*
O:MR
和
O:HDS
蛋白&"
%
#开花后不同时期棉纤维蛋白质
组的
!)D5
图谱表明!
O:NFH
*
O:EOP#
和
O:HDS%
个蛋白在整个发育期都表达!但
O:QND
从
#$DEF
开始表
达!
O:MR
从
!"DEF
开始表达!而且
O:NFH
在
#$DEF
时蛋白表达量最高!
O:EOP#
在
#"DEF
时表达量最高!
O:HDS
*
O:QND
和
O:MR
都是在
%"DEF
时表达量最高研究表明!棉纤维发育不同时期存在着差异蛋白!且在纤
维发育不同时期蛋白的表达量也存在差异!同时这些差异蛋白参与能量代谢*碳代谢*细胞周期调控和发育等途径
关键词$棉花纤维&蛋白质组&
HFIDJ)KLM)HN
&表达量
中图分类号$
T&*+,#
&
T&*!,+
!!!
文献标志码$
F
"(
)
*+#,"-"./+"01"(1#-"00"-2#31+14!5+#-
6
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71814"
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O:EOP
!
O:QND
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O:MR70CO:HDS
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B
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4
X78.Z
<
!!
蛋白质组研究是一种分子生物学研究方法!并
在棉花纤维发育机制研究方面已取得较大进展!但
利用蛋白质组学技术研究棉花纤维发育的报道很
少与基因组学的遗传标记相比!由于蛋白质组学
的研究对象是基因表达的产物!是介于基因型和表
型之间的特性!因而蛋白质组学标记是联系基因多
样性和表型多样性的纽带!具有独特的意义
棉纤维是由胚珠表皮细胞发育而形成的单细胞
纤维!起始分化后迅速伸长!一般不再分裂!最终纤
维长度可达细胞纤维直径数千倍+#,棉花纤维形成
和发育过程可分为$纤维原始细胞分化和突起"起始
期#*初生壁伸长*次生壁增厚和脱水成熟
*
个相互
重叠的时期+!)%,在每个发育时期棉纤维都具有不
同的内容和特点!分别决定着纤维的不同性状!但相
邻时期没有截然区分的界限!并且有所重叠+%,
O;7_>/
等+*)$,最早利用双向电泳研究了棉花胚珠或
纤维的蛋白差异图谱!分别比较了
)%DEF
"开花后
天数#*
)!DEF
和
!DEF
胚珠的差异!从而确定了
棉纤维起始发育的开始
KX;8>
<
+,利用双向电泳技
术!在离体培养时产生纤维的胚珠中发现了
$
个特
异表达蛋白
M>;
B
X/@0
等+,比较了纤维发育伸长
期棉纤维的蛋白质图谱!发现了
*+
个差异表达的蛋
白质点!并鉴定了其中
!
个蛋白质点近年来!中国
棉花研究者也利用双向电泳研究蛋白质与棉纤维发
育的关系刘康等+1,和徐子健等+&,对棉花纤维蛋白
质的提取方法和双向电泳条件等进行了初步探索和
改良有研究者比较了
$
"
!$DEF
棉花胚珠和纤
维
!)D5
图谱差异发现!在整个纤维发育中大约有
#+""
个蛋白点处于稳定表达水平+#")##,
棉纤维蛋白质组中有相当多的蛋白质是随不同
发育阶段而差异表达!这些差异表达的蛋白质与不
同时期纤维的各种变化密切相关研究这些差异表
达蛋白质的功能及其与纤维发育之间的关系!有利
于阐述棉纤维伸长和次生壁增厚的分子调控机制
本研究以陆地棉遗传标准系(徐州
#*!
)为实验材
料!采取
$
*
#"
*
#$
*
!"
*
!$
和
%"DEF
分别代表细胞
分化期*初生壁伸长高峰期*初生壁合成向次生壁合
成转变前期*中期*末期以及次生壁增厚期等
+
个不
同时期的棉纤维!比较不同时期棉纤维蛋白质组
!)D5
图谱!对其可能的功能进行讨论!以了解不同
发育阶段差异表达蛋白质及其功能与纤维发育之间
的关系!为棉花产量和品质的改良提供理论依据
#
!
材料与方法
$,$
!
材
!
料
供试材料为陆地棉(徐州
#*!
)"
O@//
<]
.X6:.;)
/XZX6I,?_,[X^:@X#*!
#!种植于新疆农业科学院
玛纳斯试验基地!取
$
*
#"
*
#$
*
!"
*
!$
和
%"DEF
棉
铃!剥除棉籽置
("`
冰箱备用
$,&
!
方
!
法
$,&,$
!
不同阶段棉纤维蛋白的提取
!
取棉花纤维!
去除棉籽!于液氮中迅速研磨成细粉状!加入
%
倍体
积的蛋白提取缓冲液+
$""66@8
%
IK;./)SQ8
"
]
S
1,"
#!
$"66@8
%
I5DKF
!
""66@8
%
I
蔗糖!
!G
EaE)*"
!
#66@8
%
IEHNM
,!漩涡!在冰浴上静置
#"
6.0
&加入等体积
K;./
饱和酚!溶液在室温下混匀
#"6.0
&
*`
*
#!"""b
B
离心
#"6.0
!将酚相转移至
新的离心管中!加入等体积蛋白提取缓冲液!漩涡!
在冰浴上静置
%6.0
后离心&取酚相!在酚相中加入
$
倍体积的甲醇
)
醋酸铵!
(!"`
过夜!进行蛋白沉
淀&
*`
*
#!"""b
B
离心
#"6.0
!收集沉淀!用甲醇
(
醋酸铵溶液洗涤
%
次!然后用冷丙酮洗涤
#
次!真
空干燥蛋白!
("`
冰箱保存备用+#!)#%,
$,&,&
!
蛋白质浓度测定
!
蛋白质浓度测定参考
R;7CA@;C
+
#*
,的方法在
$&$06
下测定吸光度值
!
$&$
!重复
%
次求吸光度平均值!制作标准曲线!计
算样品蛋白质含量
$,&,?
!
双向电泳
!
采用
E;@Z>70J5MQ>8
等电聚
焦系统"
R.@)c7C
#!条件略有改变!取适量蛋白样品
加裂解液至总体积为
*""
#
I
!沿
JEO
胶条槽缓慢均
匀加入!将
JEO
胶条胶面朝下覆盖在样品上!在胶
面上加少许矿物油!置于
E;@Z>70J5MQ>8
型电泳
仪上!
"`
恒温进行!
$"a
主动水化
#!:
后!
$"a
%"6.0
&
$""a#:
&
#"""a%"6.0
&
$"""a#:
!
#""""a$:
&最后稳压在
#""""a
进行等电聚焦!
总电压时间积为
+""""a:
时结束电泳第一向等
电聚焦结束后!将
JEO
胶条放于
!,$6I
胶条平衡
缓冲液
J
中振荡平衡
#$6.0
!再转入
!,$6I
胶条
平衡缓冲液
JJ
中振荡平衡
#$6.0

用
EcLK5FV[I
"
R.@)c7C
#垂直电泳系统进
行第二向电泳平衡完后将胶条转移到
#!GNDN)
EFO5
凝胶上!用琼脂糖封胶!以
#!"a
电压进行
电泳!待溴酚蓝移至凝胶底部时停止电泳电泳结
束后!用考马斯亮蓝染色方法+1,进行凝胶染色
%&#
#"
期 李
!
波!等$陆地棉(徐州
#*!
)纤维不同发育时期蛋白质组比较分析
表
$
!
实验中所用的引物序列
K798>#
!
E;.6>;/>
4
X>0?>/7
]]
8.>C.0Z:.//ZXC
<
基因
O>0>
引物
E;.6>
引物序列
E;.6>;/>
4
X>0?>
退火温度
K6
%
`
"#$%&
M
c
FFOFQQKFQFQQFFOQQQFFOF
QKQKKKQQKQFOQQKQKOFFQQK
+$
"#()
M
c
QKQOKKFQKOOFOQKOQFOOFQ
FFQKKOOFQFKKKFOKKKQKQKOFOFKKKO
+#,%
"#*!
M
c
FOFKKOOKFOOKOKKKQKOFFOFFFQK
OQQOOQFFKQFKQFQFKQFOK
+#,+
"#+",#
M
c
QOFKQKOFFQOKKQQFKKOOFK
QQKFOFFQQFQQOFQFFKKOQ
$&,1
"#-*(
M
c
OKOFFFOQFOKOOQKOKQQKKFO
QFFOQKFQKQKFQQFQQFOQFKKK
$&
"#.%
M
c
FQQQKQKQKKKQQKKQOKKFKKKQ
OFKQFFFOFOKFFQFOFKFKFOKOKKQFQ
$$,%
$@&@%
!
AB:
提取与
;7B:
第一链合成
!
采用热硼
酸
)
蛋白酶
P
法提取各时期棉纤维的总
cVF
利用
反转录酶反转录合成
?DVF
第一链!首先将
cVF
与随机引物混合!在
EQc
仪上
!`
变性
$6.0
后!
及时暂停冰上依次后续组分!混匀后于
!$`
复性
$
6.0
!
*!`
延伸
+"6.0
!
"`
加热
#$6.0
使反转录
酶失活!
?DVF
产物于
(!"`
保存
$@&@C
!
半定量
ADE/A
!
利用半定量
cK)EQc
方
法!以
$
*
#"
*
#$
*
!"
和
!$DEF
棉花纤维反转录产物
为模板!检测
"#()
*
"#*!
*
"#+",#
*
"#-*(
和
"#.%
在
#"
和
!$DEF
棉纤维中的表达情况
根据
H7/?@Z
搜索结果!利用
DVFHFV+,"
软件根
据目的蛋白的核苷酸序列进行引物设计引物序列
和退火温度如表
#
以
"#$%&
"登录号
FY#1&&
#
作为内标基因!扩增引物为
"#$%&/.
和
"#$%&/0

"#$%&
与目的基因同机分管扩增
!"
#
I
体系中
含
?DVF
"
!"0
B
%
#
I
#
#
#
I
!
bH.2#"
#
I
!引物"
!$
#
6@8
%
I
#
",$
#
I
!
CCS
!
L1
#
I
扩增条件为$
&*`
预变性
*6.0
&
*`
变性
%"/
!
+"`
复性
*$/
!
!`
延伸
#6.0
!共
!1
个循环&
!`
延伸
#"6.0

EQc
产物置
#G
琼脂糖中电泳!用紫外凝胶成像仪"
R.@)
c7C
#观察结果实验重复
%
次
!
!
结果与分析
&,$
!
不同阶段棉花纤维总蛋白含量的变化
利用
R;7CA@;C
法!根据
RNF
标准曲线!计算蛋
白的百分含量结果表明!在棉纤维发育过程中!蛋
白的百分含量呈动态变化"图
#
#在
$DEF
棉花纤
维中!总蛋白含量最高达到
##,G
!其后随着发育
时期的发展!总蛋白含量逐渐降低这一结果与棉
图
#
!
棉纤维发育过程中总蛋白百分含量的动态变化
M.
B
,#
!
K:>C
<
076.?_7;.7Z.@07078
<
/./CX;.0
B
Z:>
?@ZZ@0A.9>;C>_>8@
]
6>0Z
图
!
!
不同时期棉纤维总蛋白的
NDN)EFO5
分析
H,
蛋白质标准分子量&
#
"
+,$
"
%"DEF
棉纤维蛋白
M.
B
,!
!
K:>C
<
076.?_7;.7Z.@07078
<
/./CX;.0
B
Z:>
?@ZZ@0A.9>;C>_>8@
]
6>0Z
H,E;@Z>.0/Z70C7;C6@8>?X87;=>.
B
:Z
&
#(+,$(%"DEF?@ZZ@0A.9>;
]
;@Z>.0
纤维发育过程中生理变化相关!在棉纤维快速延伸
阶段"
$
"
#$DEF
#和次生壁增厚阶段"
!"
"
%"
DEF
#!纤维迅速增加!蛋白含量降低
&@&
!
不同发育阶段棉纤维总蛋白
979E/:FG
分析
利用饱和酚
)
甲醇醋酸铵法!分别提取
+
个不同
*&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
时期棉纤维总蛋白!并利用
NDN)EFO5
凝胶电泳进
行检测!结果"图
!
#显示!这
+
个时期都可提取出蛋
白!且在分子量
$"3D
左右蛋白含量较多!条带较亮
&@?
!
不同发育阶段棉纤维蛋白的
&E7G
图谱比较
+
个不同时期棉纤维蛋白质组的
!)D5
图谱共
检测到
#"""
多个蛋白质点根据质谱鉴定结果!
比较了
+
个样品
!)D5
图谱中
#$
个差异点"图
%
#
在
VQRJ
上进行数据查询!分别是
M)9@2
家族蛋白*
肌动蛋白*
$
)
微管蛋白*
M#)FKE
合成酶*
FKE
酶
$
亚基*膜联蛋白*磷酸甘油酸酯激酶
J
*胞质苹果酸
脱氢酶*
N)
腺苷
)I)
高半胱氨酸水解酶*谷氨酰胺合
成酶*
QX
%
d0
超氧化物歧化酶*
]
;@A.8.0
*
)
香豆酸辅
酶
F
连接酶选取
$
个在不同样品中表达量差异
明显的蛋白质点进行分析结果表明!蛋白质在不
同发育时期的表达有所不同!蛋白点
#
只在
!"
"
%"
DEF
时期表达!蛋白点
#*
只在
#$
"
%"DEF
时期
表达!其它
%
个蛋白点在不同发育时期表达量都不
同!说明不同发育时期纤维的蛋白质在不同时期表达
量不同!其中一部分蛋白在特定时期不表达!这是蛋
白质以适应不同纤维发育时期纤维细胞活动的需要
&,%
!
部分差异蛋白在不同发育阶段的表达量分析
利用
EDTX>/Z1,",#
软件对其中
$
个差异点
进行分析!结果显示!胞质苹果酸脱氢酶"
O:HDS
#
存在于棉纤维发育的各个时期!并且随着纤维的发
育表达量升高&
N)
腺苷
)I)
高半胱氨酸水解酶"
O:)
NFH
#同样存在于棉花纤维发育的各个阶段!其在
#$DEF
表达量最高&胞质磷酸甘油酸酯激酶
J
也存
在于整个棉纤维发育阶段!在
#"DEF
时表达量最
高"
O:EOP#
#!之后随着时间的增加蛋白的表达量
逐渐减少&
QX
%
d0
超氧化物歧化酶"
O:QND
#从
#$
DEF
开始表达!并且随着纤维的发育含量逐渐增
加&
M)9@2
家族蛋白"
O:MR
#在棉纤维的伸长期未见
表达!其于
!"DEF
开始表达!含量随着时间的增加
而升高"图
*
#
&@C
!
部分差异蛋白的
H
ADE/A
分析
利用
4
cK)EQc
方法!分析
$
种蛋白基因在棉
纤维发育不同时期的表达情况"图
$
#
N)
腺苷
)I)
高
半胱氨酸水解酶基因"
"#*!
#在
#"DEF
棉花纤
维中表达量相对较高&胞质磷酸甘油酸酯激酶
J
基
因 "
"#+",#
#在
!"DEF
棉纤维中表达量相对较
图
%
!
不同发育时期棉花纤维蛋白的
!)D5
图谱分析
#,M)9@2
家族蛋白&
$,N)
腺苷
)I)
高半胱氨酸水解酶&
,
胞质磷酸甘油酸酯激酶
J
&
#!,
胞质苹果酸脱氢酶&
#*,QX
%
d0
超氧化物歧化酶
M.
B
,%
!
K:>!)D57078
<
/./CX;.0
B
Z:>C.AA>;>0Z?@ZZ@0A.9>;C>_>8@
]
6>0Z/Z7
B
>/
#,O:MR
&
$,O:NFH
&
,O:EOP#
&
#!,O:HDS
&
#*,O:QND
$&#
#"
期 李
!
波!等$陆地棉(徐州
#*!
)纤维不同发育时期蛋白质组比较分析
图
*
!
部分差异蛋白在不同发育阶段的表达量
M.
B
,*
!
K:>
]
;@Z>.0>2
]
;>//.@0
4
X70Z.Z
<
7078
<
/./CX;.0
B
Z:>?@ZZ@0A.9>;C>_>8@
]
6>0Z/Z7
B
>/
图
$
!
棉纤维不同发育时期部分基因的
4
cK)EQc
表达分析
M.
B
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左右的纤维素
之前研究中!利用
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对延伸初期
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#和次生壁合成中期"
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进行了初步鉴定根据鉴定结果!对
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个不同发育
阶段的棉纤维蛋白进行
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分析!并对部分蛋白
进行了蛋白水平和转录水平上的比较
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#是苹果酸代谢过程
中的关键酶!而苹果酸在棉花纤维发育过程中起着
重要的作用!
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,发现棉纤维延
伸初期苹果酸含量显著提升!在次生壁合成初期开
始减少而
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到次生壁合成过程中!苹果酸脱氢酶的活性逐渐增
加&佘义斌等+#,研究发现!
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腺苷
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高半胱氨酸水
解酶基因随着纤维伸长的发育进程!表达量逐渐减
弱&胞质磷酸甘油酸酯激酶
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胞信号转导等生命活动+#&,另外!
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家族蛋白
还通过其它作用方式参与了体内众多生化过程+!",
本研究分别在蛋白水平和转录水平上对部分差
异蛋白在棉花纤维发育过程中的作用进行了分析和
讨论结果显示!在蛋白水平上!胞质苹果酸脱氢
酶*
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超氧化物歧化酶以及
M)9@2
家族蛋白在
棉花纤维次生壁增厚阶段表达量明显增加!推测其
可能在棉花纤维次生壁发育阶段起重要作用在转
录水平上!存在着和蛋白水平不一致的结果!可能是
由于真核生物在转录与翻译不同时也不同地!基因
组与染色体结构复杂!有着更为复杂的调控机制
真核生物的基因表达具有多层次性!可发生在染色
质水平*转录起始水平*转录后水平*翻译水平以及
翻译后水平+!#,&另外!在多肽链加工折叠为蛋白质
的过程中!经过不同修饰加工的蛋白质其稳定性会
有差异
棉纤维发育是一个经历时间长*形态和生理等
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北
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植
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物
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学
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报
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卷
发生剧烈变化的过程!研究不同时期棉纤维蛋白的
动态变化!可以将不同发育时期纤维的形态和生理
变化与相关蛋白的活动联系起来!从而了解这些变
化的分子机制!最终为纤维品质和产量的遗传工程
改良提供依据由于棉纤维细胞壁随着细胞的发育
而逐渐增厚!使得棉纤维细胞不易破碎!为实验带来
一定的难度!且随着时间变化蛋白含量逐渐减少
参考文献!
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