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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
耐盐菌对环境具有一定的适应能力，在一定盐
度范围内微生物通过自身的渗透调节机制用以平衡
细胞内的渗透压或保护细胞内的原生质，进而调节
自身的新陈代谢以适应盐度的变化［1，2］。
近年来，有关耐盐及嗜盐菌用于处理高盐废水
的研究报道较多，美国 NotreDame 大学的研究人员
利用从美国大盐湖中分离出的菌种处理盐度为 1%-
15% 的含酚废水，酚的去除率达到 99%，该试验中
分离得到的菌种在含盐氨氮磷与铁的环境中就可生
长［3］。耐盐及嗜盐菌处理高盐废水在废水处理工艺
上得到较多的应用。Kargi 等［4］在转动式生物转盘
中投入嗜盐菌处理含盐废水，含盐量 5% 时的 COD
收稿日期 ： 2013-10-30
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（30571071），江苏师范大学王子元教授科研启动基金（KY2009101），江苏高校优势学科建设工程项目，
江苏省教育厅优秀创新团队项目
作者简介 ：王菲，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：xzwangfei@126.com
通讯作者 ：王子元，男，教授，研究方向 ：极端环境微生物 ；E-mail ：zwang2229@aliyun.com.cn
一株耐盐弧菌 Vibrio sp.K1-L 的分离与鉴定
王菲  刘抗  范家同  成守亮  王子元
（江苏师范大学 生命科学学院，徐州 221116）
摘 要 ： 从山西运城盐湖水样中分离出一株细菌 K1-L，能在 2%-10% 的 MGM 固体培养基上出现群游现象。该菌株为革兰
氏阴性菌，周生鞭毛，电镜下大小约为 0.4 μm×（1-2）μm，其菌落形态为圆形，灰色。菌株 K1-L 的最适生长盐浓度、温度和
pH 值的范围分别为 2%-6%、30-40℃和 6.0-7.0，GC 含量为 47.06%。通过对其形态学、生理生化试验，16S rRNA 基因序列及系
统发育学的分析，发现其与 Vibrio diabolicus HE800T 和 Vibrio rotiferianus LMG 21460T 等细菌的 16S rRNA 有高度同源性，最大的相
似性均为 99％，确定该菌株 K1-L 为弧菌属（Vibrio）。
关键词 ： 运城盐湖 弧菌属 耐盐菌 系统发育分析
Isolation and Identification of a Halotolerant—Vibrio sp. K1-L
Wang Fei Liu Kang Fan Jiatong Cheng Shouliang Wang Ziyuan
（School of Life Science，Jiangsu Normal University，Xuzhou 221116）
Abstract:  Strain K1-L, isolated from Yuncheng Salt Lake, Shanxi Province, could swim on the 2%-10% MGM medium. The strain K1-L
was Gram-negative with polar flagellum and was 0.4 μm ×（1-2）μm under the scanning electron microscope. Strain K1-L appeared grey,
rounded colony. Its optimum salt concentration, temperature and pH ranges were 2%-6%, 30-40℃ and 6.0-8.0. The GC content is 47.06%.
After comparing the traditional characteristics of morphology, physiological biochemistry and 16S rRNA sequence analysis, we discovered that
the strain K1-L was highly homologous to the Vibrio diabolicus HE800T and Vibrio rotiferianus LMG 21460T. The maximum similarity was 99%.
It was asserted that K1-L was belonged to the genus Vibrio, we proposed the name Vibrio sp. K1-L for this strain.
Key words:  Yuncheng salt lake Vibrio Halotolerant Phylogenetic analysis
去除率为 85%。Woolard 等［5］利用中度嗜盐菌处理
含盐量 15% 的废水，对苯酚的去除率高达 99.5%。
本研究通过分析从山西运城盐湖水样中分离的菌株
K1-L 的 16S rRNA 基因序列，建立菌株 K1-L 的系统
发育进化树，并对其生理生化特性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 菌株 K1-L 分离自山西运城盐湖
水。
1.1.2 试 剂 DNA Marker、 限 制 性 内 切 酶 等 购 于
Fermentas ；引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1.1.3 仪器 恒温培养箱、恒温摇床、UV-7504 紫
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期128
外可见分光光度计、显微镜（Olympus）、PCR 仪、
电泳仪、凝胶成像仪和日立扫描电镜。
1.1.4 培 养 基 5% MGM（Modified growth medium）
培养基 ：30% 人工海水 166.7 mL/L（配制参照 Mike、
Dyall-smith 所报道的方法［6］），胰蛋白胨 5 g/L，酵
母膏 1 g/L，去离子水定容至 1 L，调节 pH 至 7.5。
配制固体培养基时加 1.5% 的琼脂。其它盐浓度的
MGM 培养基采用同样的方法配制。
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离方法 从山西运城盐湖取水样涂
布于 10% MGM 培养基，由于出现向边缘扩散生长
的现象（即细菌群游现象），不能形成单菌落，故将
其接种到 LB 固体培养基上，37℃过夜培养，能长
出单菌落，连续划线纯化菌株。
1.2.2 形态学特征 将菌株 K1-L 在 LB 固体培养基
上划线培养，获得单菌落，观察其菌落形态，并进
行革兰氏染色及鞭毛染色［7］，扫描电镜观察。
1.2.3 生理生化指标的测定
1.2.3.1 生化和酶学鉴定 参考东秀珠等［8］的著作
《常见细菌系统鉴定手册》，测定菌株利用糖类、氨
基酸的生理特征及 MR（Methyl red）和 VP（Voges-
proskauer）等生化特性，以及接触酶等酶学特征。
1.2.3.2 抗生素敏感试验［9］ 参照美国国家临床实
验室标准委员会（NCCLS）纸片扩散法敏感试验分
委会推荐的 K-B 法（即纸片扩散法），以大肠杆菌
ATCC 25922 作为参照菌株，进行 3 次平行试验。
1.2.3.3 盐浓度对菌株生长的影响 将菌株 K1-L 等
量的菌悬液分别接种于盐浓度为 0%、0.5%、1%、2%、
3%、4%、5%、6%、7%、10%、12%、15%、20%
的 50 mL 无菌 MGM 液体培养基中，于 37℃条件下
摇床培养，在培养 8 h 后测定菌悬液的吸光度 OD600
值（测量时调节菌液浓度 ：0.1次平行试验。以盐浓度为横坐标，OD 值（测定的
OD 值乘以稀释倍数）为纵坐标绘制曲线［10-12］（数
据经 SPSS 17.0 软件处理和 Excel 2003 作图）。
1.2.3.4 温度对菌株生长的影响 将菌株 K1-L 等
量的菌悬液接种于 3%MGM 液体培养基中，分别于
22℃、25℃、30℃、34℃、37℃、40℃条件下培养 8 h，
测定各温度下菌株 K1-L 的 OD600 值，进行 3 次平行
试验。以培养温度为横坐标，OD 值（测定的 OD 值
乘以稀释倍数）为纵坐标绘制曲线。
1.2.3.5 pH 对细菌生长的影响 将菌株 K1-L 等量
的菌悬液接种于盐浓度为 3%，pH 值为 4.0、4.5、5.0、
6.0、7.0、8.0、9.0、9.5、10.0 的 50 mL 无 菌 MGM
液体培养基中，180 r/min，37℃条件下培养 8 h 后测
定各 pH 条件下菌株 K1-L 的 OD600 值，进行 3 次平
行试验。以 pH 值为横坐标，OD 值（测定的 OD 值
乘以稀释倍数）为纵坐标绘制曲线。
1.2.4 菌株 16S rRNA 基因序列分析 依据总基因
组 DNA 的提取方法［6］获得基因组 DNA，利用通用
引物对 16S rRNA 基因进行扩增，引物序列为 ：27F
（5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3） 和 1492R（5-
CTA CGG TTA CCT TGT TAC GAC-3）。PCR 反应体
系：10xPCR 缓冲液 5 μL，上下游引物各 2 μL，dNTPs
（5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）5 μL，Taq
DNA 聚合酶（5 u/μL）0.5 μL，DNA 模板 2 μL，加
水至 50 μL。所用扩增程序：95℃，5 min；95℃ 45 s，
50℃ 30 s，72℃ 90 s，35 个循环 ；72℃ 10 min。扩
增产物经 TA 克隆，送上海生工生物技术有限公司
测序。将菌株的 16S rRNA 基因序列提交到 NCBI 和
EzTaxon server 2.1 数据库上，获得与该菌序列同源
性高的相关菌株 16S rRNA 基因序列。再用 CLUSAL
X 1.83 软件［13］进行序列比对。在 MEGA version 3.1
软件［14］中用 Neighbour-joining 法［15］构建系统发育
进化树。
2 结果
2.1 筛选结果
分离出的细菌命名为 K1-L，该菌在 2%-10%
MGM 固 体 培 养 基 上 有 群 游 现 象（ 图 1）， 菌 株 在
5%MGM 培养基上培养 11 h 群游 59 mm。
59 mm
图 1 菌株 K1-L 的群游能力
2014年第4期 129王菲等 ：一株耐盐弧菌 Vibrio sp.K1-L 的分离与鉴定
2.2 鉴定结果
2.2.1 形态观察和生理生化特性 菌株 K1-L 在 LB
培养基上培养 12 h 后形成灰色、圆形、半透明菌落，
边缘整齐，表面光滑。革兰氏染色为阴性，鞭毛染
色可见其鞭毛着生方式为周生（图 2），电镜下菌株
K1-L 呈短杆和弧状，大小为 0.4 μm×（1-2）μm（图
3）。生理生化结果见表 1。
2.2.2 16S rRNA 序列分析与构建系统进化树 测序
表 1 菌株 K1-L 的生理生化特征
鉴定项目 结果 鉴定项目 结果 鉴定项目 结果
接触酶 + 精氨酸双水解酶 - 丁胺卡那霉素（30 μg） +
氧化酶 + 肌醇 - 庆大霉素（10 μg） +
MR 反应 + 葡萄糖 - 氯霉素（30 μg） +
VP 反应 - 多粘菌素 B（300 UI） +w 红霉素（15 μg） -
蛋白胨水（靛基质） - 链霉素（30 μg） + 复方新诺明（1.25/27.25 μg） +
蔗糖 + 四环素（30 μg） +w 氟呱酸（10 μg） +
甘露糖 - 青霉素（10 μg） - 丙氟呱酸（5 μg） +
阿拉伯糖 - 氨苄青霉素（10 μg） - O/129（10 μg） +
赖氨酸脱羧酶 - 先锋霉素（30 μg） + O/129（150 μg） +
+ ：阳性 ；- ：阴性 ；+w ：弱阳性
图 2 菌株 K1-L 的鞭毛染色 图 3 菌株 K1-L 的扫描电镜照片
0.005
79
90
9541
63
100
75
59
60
84
100
50
94
100 Photobacterium iliopiscarium ATCC 51760T/AY643710
Photobacterium kishitanii pjapo.1.1T/AY341439
Photobacterium aplysiae GMD509T/AY781193
Photobacterium lutimaris DF-42T/DQ534014
Aliivibrio wodanis NVI 88/441T/AJ132227
Aliivibrio sifiae H1-1T/AB464964
Aliivibrio finisterrensis CMJ 11.1T/EU541604
Aliivibrio fischeri ATCC 7744T/X74702
Vibrio hippocampi BFLP-4T/FN421434
Vibrio hippocampi CN83T/EU082035
Vibrio agarivorans CECT 5085T/AJ310647
Aliivibrio mangrovi MSSRF38T/EU144014
Vibrio litoralis MANO22DT/DQ097523
Vibrio rumoiensis S-1T/AB013297
Vibrio casei WS 4539T/FJ968723
Vibrio sp. K1-L
Vibrio diabolicus HE800T/X99762
Vibrio commuris R-40496T/GU078672
Vibrio rotiferianus LMG 21460T/AJ316187
96
62
获得菌株 K1-L 的 16S rRNA 基因序列，获得大小为
1 498 bp 的序列，GenBank 登录号为 ：JF930162。菌
株 K1-L 的 16S rRNA 序列与弧菌属 Vibrio diabolicus
HE800T 和 Vibrio rotiferianus LMG 21460T 等 细 菌 的
16S rRNA 最大相似性均为 99%，并与同源性高的相
关菌株构建系统发育树（图 4）。
每个分支点处的数字为 Bootstrap（1 000 次抽样）的支持百分率 ；标尺代表 0.5% 的序列差异度
图 4 菌株 K1-L 的系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期130
2.2.3 盐浓度对细菌生长的影响 由图 5 可以看出
K1-L 在 1%-15% 盐浓度下均可生长。菌株 K1-L 的
生长最适盐浓度范围是 2%-6%，可耐受盐浓度的范
围较广。
3 讨论
Drancourt［16］ 认 为 16S rRNA 基 因 序 列 相 似 性
≥ 99% 的 菌 株 为 同 一 个 种。 通 过 对 菌 株 K1-L 的
16S rRNA 基因序列同源性比对发现，该菌株与弧菌
属（Vibrio）的 VibriodiabolicusHE800T 、副溶血性弧
菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌等的序列相似性均为 99%，
确定其为弧菌属。弧菌属细菌分布广泛，是普通的
水生菌，海水和淡水中最为常见，人及动物的消
化道中也有。从构建的进化树上看，菌株 K1-L 与
VibriodiabolicusHE800T 和 VibrioEx25 的聚在一支上，
VibriodiabolicusHE800T 和 VibrioEx25 生 长 在 极 端 环
境中，该地区有丰富的金属，而有些金属正好是这
些反应所需酶的稳定剂或催化剂［17］。而菌株 K1-L
取自山西运城盐湖，该湖是一个常温、常压和盐含
量高的环境，可见，它们的生存环境具有较大差异。
菌种的形态特征是由遗传物质和生存环境等因
素共同决定的，利用基于形态学、生理生化及分子
生物学等技术的多相分类鉴定方法现已广泛应用于
微生物分类学研究领域［18］。对其生理生化指标进行
试 验 后 发 现，K1-L 与 VibriorotiferianusLMG21460T、
VibriodiabolicusHE800T 等 的 氧 化 酶 阳 性 和 对 O/129
（150 μg） 敏 感 是 它 们 共 有 的 特 性。 对 其 生 长 的
条 件 的 比 对 发 现， 副 溶 血 性 弧 菌［16］ 和 溶 藻 弧
菌［16，17］、VibriorotiferianusLMG21460T［19］、Vibriod-
iabolicusHE800T 盐浓度生长范围较窄，而菌株 K1-L
生长范围较广，且在 15% 的盐浓度下还能生长，有
较高的耐盐性，原因可能是盐湖夏季水分蒸发导致
湖水盐浓度提高，菌株 K1-L 经过长期的进化适应了
这种环境。
已知 VibriodiabolicusHE800T（表 2）生长在极端
环境中，该地区有丰富的金属，而有些金属正好是
这些反应所需酶的稳定剂或催化剂。Vibriodiabolicus-
HE800T 的胞外分泌物表多糖（EPS）具有固着和吸
附的作用，这种作用正好可以吸附重金属使其自身
免受伤害［19］。由此可见，可能是由于长期的环境作
用导致 VibriodiabolicusHE800T 和实验室所分离 K1-L
向不同方向的进化，且菌株 K1-L 可在较高盐浓度下
存活，根据信欣报道［20］，传统生物法无法去除含高
浓度有机污染物的废水，而耐盐菌可以降解高浓度
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0 0.5 1 2 3 4 5 6 7 10 12 15 20
O
D
60
0n
m
ⴀ⎃ᓖ%
图 5 盐浓度对菌株 K1-L 生长的影响
2.2.4 温度对细菌生长的影响 由图 6 可以看出，
K1-L 在 22-40℃的温度范围内均能生长，最适生长
温度范围是 30-40℃。
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
22 25 28 30 34 37 40
O
D
60
0n
m
3.5
⑙ᓖć
图 6 温度对菌株 K1-L 生长的影响
2.2.5 培养基 pH 值对细菌生长的影响 由图 7 可
以看出，K1-L 对环境中的 pH 有较强的耐受能力，
尤其耐碱，在 pH5.0-10.0 的范围内都能生长。K1-L
最适生长 pH 范围是 6.0-7.0。
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
4.0 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11
pH
O
D
60
0n
m
图 7 培养基 pH 值对菌株 K1-L 生长的影响
2014年第4期 131王菲等 ：一株耐盐弧菌 Vibrio sp.K1-L 的分离与鉴定
有机废水，取得了良好的效果。
4 结论
本研究针对自山西运城盐湖水中分离得到的细
菌 K1-L 进行多相分类学鉴定，并最终确定为弧菌属，
且此菌具有一定的生理生化特征及酶学活性，且可
在较高盐浓度下存活，在高浓度污水处理方面也有
较好的应用前景及实践意义。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）
表 2 菌株 K1-L 与 Vibrio diabolicus HE800T［5］特征比较
菌株
特性
赖氨酸
脱羧酶
氧化酶
O/129
（150 μg）
过氧化
氢酶
葡萄糖 甘露糖 肌醇 蔗糖
阿拉
伯糖
吲哚
产生
极性
鞭毛
革兰氏
最大耐受
盐浓度
最适生长
温度（℃）
最适生
长 pH
G+C
（%）
Vibriodiabolicus
HE800T
+ + + + + + - - - + + - 10% 30-45 7.0-8.0 49.60
K1-L - + + + - - - + - - + - 15% 30-40 6.0-7.0 46.06
+ ：反应为阳性 ；- ：反应为阴性