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荷包猪一类缺失型SLA-3等位基因的克隆及生物信息学分析



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-01-10
基金项目 : 国家自然科学基金项目(30972169), 辽宁省博士启动基金(20081078),辽宁省教育厅科学计划项目(L2010018)
作者简介 : 乔翠 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 动物分子免疫学 ; E-mail: qiaocui250@126.com
通讯作者 : 高凤山 , 男 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 基因工程和动物分子免疫学 ; E-mail: gfsh0626@126.com
猪主要组织相容性复合体(major histocompatibi-
lity complex,MHC)I 类分子,即猪白细胞抗原(swine
leukocyte antigen,SLA)I,属于重要的免疫应答基
因群,主要起到介导细胞抗原递呈和引起组织排斥
作用[1]。SLA-I 类分子包括 3 类功能基因座,分别
为 SLA-1,SLA-2 和 SLA-3。 其 中,SLA-2 基 因 要
比 SLA-1 和 SLA-3 基因的信号肽多 3 个氨基酸。目
前,SLA-3 基因已对多种品系猪成功克隆并发表于
DDBJ/EMBL/GenBank,其基因编码区 1 086 个碱基
对,共编码 361 个氨基酸。其中,信号肽为 21 个氨
基酸,α1区编码90个氨基酸,α2区编码92个氨基酸,
α3 区编码 92 个氨基酸,穿膜区和胞内区共编码 66
个氨基酸[2]。SLA-3 基因与 SLA-1 和 SLA-2 基因功
能一样,在体内主要起到抗原递呈和免疫识别作用。
荷包猪一类缺失型 SLA-3等位基因的克隆及
生物信息学分析
乔翠1 许崇波1 张兴会2 张文军2 郭丹2 张胜2 高凤山1
(1 大连大学生物工程学院 生物化学和分子生物学实验室,大连 116622 ; 2 辽宁省畜牧科学研究院,辽阳 111000)
摘 要: 为研究荷包猪 SLA-3基因特征,设计引物克隆了荷包猪 SLA-3,经生物信息学软件分析其基因特征。结果显
示,所克隆的荷包猪 SLA-3基因(暂命名为 SLA-3-HB02)碱基序列长度为 1 417 bp,其中 2-1 054为 ORF区,共编码 350个氨
基酸,在其编码的氨基酸 334-344处存在缺失。SLA-3-HB02与其他 SLA-3、SLA-2及 SLA-1等位基因群的氨基酸同源率分别为
87.8%-98.6%、82.8%-87.8%和 83.7%-90.0%。分子进化关系分析,SLA-3-HB02与美国的 Hanford遗传距离较近;各功能区分析,
SLA-3-HB02保留了 HLA-A2等的部分功能基因位点,并与 HLA-B15和 H-2K1有一定的交叉识别位点。同源模建揭示 SLA-3-HB02
分子与 HLA-A2及 H-2K1 3D结构相似。
关键词: 荷包猪 SLA-3基因 缺失型 等位基因 生物信息学
Cloning and Analyzing a Deleted Type of SLA-3 Allele in
Hebao Pigs by Bioinformatics
Qiao Cui1 Xu Chongbo1 Zhang Xinghui2 Zhang Wenjun2 Guo Dan2 Zhang Sheng2 Gao Fengshan1
(1 Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology,College of Life Science and Technology in Dalian University,Dalian 116622;
2 Institute of Animal Husbandry of Liaoning Province,Liaoyang 111000)
Abstract: To study the genetic characteristics of Hebao pigs,a pair of primers was designed to clone SLA-3 gene followed by analyzing
its genetic characteristics by bioinformatics. The results were shown that the SLA-3 (named as SLA-3-HB02) was 1 417 bp with an ORF domain
which coded for 350 amino acids and there is a deletion between 334-344 amino acid sites. The amino acid identical ratios between SLA-3-
HB02 and other SLA-3,SLA-2,and SLA-1 alleles were 87.8%-98.6%,82.8%-87.8%,and 83.7%-90.0%,respectively. The phylogenetic
tree of the SLA-3-HB02 demonstrated that it was close to Hanford breed of swine in USA. The SLA-3-HB03 preserved some functional sites of
HLA-A2 and it also shared some functional sites to the HLA-B15 and H-2Kd. By homology modeling,the 3-dimentional (3D) structure of SLA-
3-HB02,HLA-A2 and H-2K1 was similar.
Key words: Hebao pig SLA-3 gene Deleted-type Allele Bioinformatics
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期88
但由于 SLA-3 基因的多态性不如 SLA-1 和 SLA-3 丰
富,目前国内外对 SLA-3 的研究报道不多,尤其对
我国地方品系猪 SLA-3 基因的研究报道比较缺乏。
荷包猪是我国的地方特色品系猪,分布于辽西
封闭山区,属于东北民间猪的一个小型类群,因其
外形酷似“荷包”而得名,主要分布于辽西一带交
通不便的山区。荷包猪抗逆性强,耐粗饲,肌间脂
高,由于其肌纤维细密,大理石花纹明显,肉质细
嫩,肉味香浓,故有“北方香猪”之美称,是我国
宝贵的地方良种资源,1987 年被农业部列为国家一
级保护猪种,2002 年被列入《国家畜禽遗传资源保
护名录》,2006 年被确定为《国家级畜禽遗传资源
保护品种》,是辽宁省乃至东北地区唯一得到国家保
护的猪种 [3]。目前,课题组已经报道了我国荷包猪
SLA-2 基因的研究[4],但对于荷包猪 SLA-3 基因的
研究还未见报道。
为全面研究荷包猪 SLA-I 类分子功能基因,本
研究将以荷包猪为研究材料,拟采用 RT-PCR 等方
法克隆 SLA-3 功能基因,经序列测定及同源性比较,
绘制种间分子进化树,并进一步分析荷包猪 SLA-3
的分子进化、功能区位点及空间结构,旨为今后阐
明荷包猪的分子进化背景及基因资源的开发研究奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 猪品种 荷包猪来源于辽宁荷包猪场。
1.1.2 载体及菌株 pMD18-T Vector,E. coli JM109,
总核酸提取试剂盒 TRIZOL,反转录试剂盒 Reverse
Transcriptase M-MLV(RNase H-),DNA 回收试剂盒
Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,EcoR Ⅰ 及
Hind Ⅲ限制性内切酶均为 TaKaRa 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 扩增猪 SLA-3 所用的引物 :参
照 DDBJ/EMBL/GenBank 基因库中猪 SLA-3 基因序
列(AF464049),采用 Oligo6.0 软件设计引物。引
物 pM-3F1 :5-GGCTGAGGATCATGGGGCCCCG-3,
pM-3R2 :5- GAACCCTGCCTTTGGAACTGTG-3,引
物由上海生工生物工程有限公司(Sangon)合成。
1.2.2 RT-PCR 扩增猪 SLA-3 基因 称取约 100 mg
猪脾脏组织,剪碎放入 1.5 mL 的 Eppendorf 管中,
加入 300 μL 的 TRIZOL,用研棒研磨直至形成匀浆,
再补加 TRIZOL 700 μL。然后按照试剂盒说明进行总
mRNA的提取。最后分离的沉淀加入20 μL 0.1%DEPC
水溶解,在 60℃下孵育 5 min,-80℃保存。
取 2 μL 猪脾脏总 mRNA,分别加入 2 μL 的
Oligo (dT )(15T) (100 mol/L)、2 μL AMV buffer、
4 μL dNTP (2.5 mol/L)、1 μL AMV (10 U),最后用
0.1%DEPC水补充至20 μL,42℃作用1 h进行反转录。
反转录后,取反转录第一链 cDNA 2 μL (约 0.5
μg),加入 50 μL PCR 体系中,PCR 扩增条件 :94℃
5 min 预变性 ;然后 94℃ 45 s,64℃ 30 s,72℃ 1
min,33 个循环;最后 72℃延伸 10 min,取出,-20℃
保存[5]。
1.2.3 基因克隆 PCR 产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳,
用 DNA 回收试剂盒将扩增片段纯化后连接到 pMD-
18T 载体,4℃过夜,然后转化到感受态细胞 E. coli
JM109,涂布于含有 Amp、IPTG、X-gal 的 LB 平板上,
37℃培养过夜,蓝白斑筛选及酶切鉴定阳性克隆。
1.2.4 基因序列测定与分析 将鉴定的阳性克隆送
上海生工(Sangon Inc.)测序,序列通过 SAKURA
系统登录入 DDBJ/GenBank。核苷酸及氨基酸的序列
比对采用 CLUSTALW 法外加手动调整 ;氨基酸序列
的推导、比对采用 GENETYX version 9.0(Software
Development Co.,Ltd,Tokyo,Japan)及 DNAman Ve-
rsion5.2.2 (Lynnon BioSoft Co.,Ltd),分子进化树采
用 DNAman 和 Mega5 软件(Mega software Co.,Ltd)
的 Neighbor-joining 法绘制。SLA-3 各功能区功能位
点的推测分析参照文献[6]的方法进行。
1.2.5 同源模建 SLA-3-HB02 3D 结构 根据 SLA-
3-HB02 基因分子结构分析,以蛋白质结构数据库
(PDB) (http ://www. expasy. Org. swiss-mod/SWISS-
MODEL.htmL)同源模建 SLA-3-HB02、HLA-A2 及
H-2K1 胞外区蛋白的三维结构,应用 RASWIN 分析
软件绘制其结构图,比较三者 3D 结构的异同。
2 结果
2.1 SLA-3基因的克隆
经过 RT-PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳,在 α 成
像仪下显示约 1 400 bp 的条带,产物命名为 SLA-3-
2012年第9期 89乔翠等 :荷包猪一类缺失型 SLA-3 等位基因的克隆及生物信息学分析
HB02(图 1)。SLA-3-HB02 的序列经克隆、鉴定后测
序,序列通过 GENETYX 9.0 分析,长度为 1 417 bp,
2-1 054 为 ORF 区,共编码 350 个氨基酸,分别在第
122、185、224 和 281 位置出现半胱氨酸残基。序列
登录入 DDBJ/EMBL/GenBank (登录号 :AB691529)。
他动物 MHC Ⅰ类基因相比,SLA-3-HB02 在系统进
化关系上与牛 MHC I 最接近 ;其次为兔、马、猴、
黑猩猩、人、鼠、禽类(鸡、鹅)、两栖类(蛙)和
鱼类(斑马鱼、虹鳟鱼)等 MHC I 类分子。
2.4 SLA-3-HB02各功能区主要功能位点推测分析
SLA-3-HB02 与 DDBJ/EMBL/GenBank 上有代表
性的鼠、人相应 MHC I 类等位基因进行比较,分析
各功能区的主要氨基酸的变化,见图3。在信号肽区,
SLA-3-HB02 基因编码氨基酸与 H-2K1、HLA-B15 及
HLA-A2 的氨基酸差异很大,其差异氨基酸分别达
到了 9,11,8。α1 和 α2 区是抗原多肽结合的主要
区域,比较发现,SLA-3-HB02 保留了人 HLA-A2 与
抗原多肽结合的 8 个关键性氨基酸其中的 7 个,即
Y7、Y59、Y84、T143、K146、Y159 和 Y171。在 α1
和 α2 区 HLA-A2 与 β2m 结 合 的 19 个 氨 基 酸 中,
SLA-3-HB02 保留了其中的 13 个。α3 区,199-205、
211 和 221 位是 MHC I 类分子与 CD8 分子结合的必
需氨基酸,SLA-3-HB02 发生了两个必需氨基酸的变
异,在 199(V/A)和 211(K/A);相对于 H2-K1,
SLA-3-HB02 的 变 异 位 点 为 211(K/A);相 对 于
HLA-B15,变异位点为 199(V/A)和 211(K/A)。
在 α3 区 HLA-A2 与 β2m 结合的氨基酸中,SLA-3-
HB02 几乎保留了其中所有的氨基酸残基。在细胞
质区和穿膜区,SLA-3-HB02 与 HLA-A2、 H2-K1 和
HLA-B15 的氨基酸变异程度要远远大于其他区域,
尤其是 SLA-3-HB02 在胞内区存在一个 10 个氨基酸
的缺失。
2.4 同源模建SLA-3-HB02 3D结构
按照文献报道[7],在 http://www.expasy.org/swiss-
mod/swiss-model.html 服 务 器 上 进 行 SLA-3-HB02、
HLA-A2 和 H-2K1 重链胞外区 3D 结构同源模建。结
果(图 4)显示,SLA-3-HB02 的抗原多肽结合区(PBD)
含有 2 个反向平行的 α-螺旋和 8 条 β-片层组成。比
较荷包猪 SLA-3-HB02、人 HLA-A2 及鼠的 H-2K 蛋
白分子的同源模建结构图,可以看出,三者具有极
为相似的空间结构。另外,3D 结构图显示,荷包猪
SLA-3-HB02 与 HLA-A2、H-2K1 所共有的 7 个决定
抗原结合肽的关键氨基酸均位于多肽结合槽的 α-螺
旋或 β-折叠上,而决定于 CD8 分子结合的两个关键
A:RT-PCR 扩增 SLA-3-HB02 基因;B:pMD18-T/SLA-3-HB02 的酶切鉴定。
1.SLA-3-HB02 基因 RT-PCR 扩增结果 ;2.pMD18-T/SLA-3-HB02 的酶切鉴
定结果 ;M.DL2000 DNA ladder
图 1 PCR 扩增 SLA-3-HB02基因(A)及双酶切鉴定(B)
2.2 SLA-3-HB02与SLA-I类分子序列比较
将 SLA-3-HB02 的序列与 DDBJ/EMBL/GenBank
上 SLA-3(SLA-A)的序列进行比较,发现 SLA-3-
HB02 在 334-344 处缺失,另外在 7 位(V)、56 位
(W)、74 位(Q)、137 位(F)、237 位(S)、320 位(M)
和 357 位(Q)均为特征性氨基酸(图略)。SLA-3-
HB02 的序列与 DDBJ/EMBL/GenBank 上 SLA-2(SLA-
B)和 SLA-1(SLA-C)基因序列进行比较,发现
SLA-3-HB02 比 SLA-2 基因在起始密码子处少 3 个
氨基酸。同源性关系分析揭示,SLA-3-HB02 与
其他 SLA-3、SLA-2 及 SLA-1 等位基因群的氨基
酸 同 源 率 分 别 为 87.8%-98.6%、82.8%-87.8% 和
83.7%-90.0%。
2.3 SLA-3-HB02等位基因系统进化树
根 据 猪 SLA-3 各 等 位 基 因、 部 分 SLA-2 和
SLA-1 的代表性等位基因,以及代表主要脊椎动
物分类的动物全长 MHC Ⅰ类分子氨基酸序列(鹅
MHC I 为含完整成熟肽的部分序列),用 DNAMAN
和 Mega5 软件绘制 SLA-3-HB02 的分子进化树。结
果(图 2)显示,SLA-3-HB02 (AB691529)与美国
的 Hanford 及细胞系 EU432094 遗传距离较近,与其
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期90
猪 SLA-2,SLA-1,SLA-3 各等位基因的命名为基因名称加“-”族系 /-单倍型“-”基因
登录号表示 ;其他动物的命名用动物的名称加“-”加基因登录号表示
图 2 SLA-3-HB02系统进化树
2012年第9期 91乔翠等 :荷包猪一类缺失型 SLA-3 等位基因的克隆及生物信息学分析
左侧为 4 个比较的氨基酸序列 :SLA-3-HB02(AB691529)、H-2K1 (P04223)、HLA-B15 (CAC33086)、HLA-A2 (K02883),序列上面和下面数
字分别显示 SLA-3-HB02 及其他各序列氨基酸从 α1 区开始计算,序列右边的数字表示各序列从信号肽开始计算,* 缺失 ; - 相同的氨基酸 ;
• 与抗原多肽结合的 8 个关键性氨基酸残基,p 人(HLA-A2)与抗原多肽结合的相关氨基酸残基,b HLA-A2 与 β2m 结合的氨基酸残基; = β-片层,
# α-螺旋 ;HLA-A2 下面的数字 1,2,3,8 表示人 HLA-A2 的链间结构(1 与 α1 接触,2 与 α2 接触,3 与 α3 接触,8 与 CD8 接触)
图 3 猪 SLA-3-hb02(AB691529)等位基因各功能区与鼠 H-2K及人 HLA-A2、HLA-B15的比较
图 4 比较荷包猪 SLA-3-HB02(A)、人 HLA-A2(B)和鼠 H-2K1(C)同源模建图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期92
氨基酸位于 α3 区的 199 位和 211 位,这两个位点显
示了 SLA-3-HB02 与 HLA-A2 和 H-2K1 具有差异。
3 讨论
SLA-3 为猪 SLA-I 的一个基因座,它与 SLA-2
和 SLA-1 共同构成 SLA-I 类分子的 3 个功能基因座,
其中,SLA-3 在基因特征上与 SLA-2 相比有明显的
特征,即在信号肽起始密码子处比后两者少 3 个氨
基酸[8];目前,我国北方特色品系荷包猪 SLA-3 基
因还未报道,与其相关的 SLA-1 和 SLA-2 基因的特
征不久将报道。本研究通过分子克隆手段,从荷包
猪脾脏克隆了一类特殊的 SLA-3 等位基因,即 SLA-
3-HB02。序列测定证实,该克隆基因 cDNA 全长为
1 417 bp,其中 2-1 054为编码区,编码350个氨基酸;
SLA-3-HB02 推导的氨基酸序列在 122、185、224 和
281 处有 4 个半胱氨酸残基,推测其含有 2 对链内二
硫键。经氨基酸序列比较,SLA-3-HB02 与 SLA-3、
SLA-3 和 SLA-1 等位基因群的氨基酸同源率分别为
87.8%-98.6%、82.8%-87.8% 和 83.7%-90.0%,该基
因在信号肽起始密码子处比 SLA-2 少 3 个氨基酸,
而且该基因与 SLA-3 其他等位基因高度同源,说明
SLA-3-HB02 最可能属于 SLA-3 基因。然而,SLA-3-
HB02 与其他 SLA-3 等位基因比较后发现在 334-344
处存在一段缺失,该缺失位置属于胞内区,该缺失
序列对于 SLA-3 基因在细胞内定植是否会产生影响
或产生何种影响,有待于进一步研究。
经过与 44 类 SLA-3 等位基因、2 类有代表性的
SLA-2、2 类有代表性的 SLA-1 及其他脊椎动物包括
哺乳动物(牛、兔、马等)、灵长类动物(猴、黑猩猩)、
人、两栖动物(蛙)及鱼类 MHC I 等位基因氨基酸
比较,绘制系统进化树,发现 SLA-3-HB02 在遗传
关系上与美国的 Hanford 及细胞系 EU432094 遗传距
离较近。与其他动物 MHC Ⅰ类基因相比,SLA-3-
HB02 在系统进化关系上与牛 MHC I 最接近,其次
为兔、马、猴、黑猩猩、人、鼠、禽类(鸡、鹅)、
两栖类(蛙)和鱼类(斑马鱼、虹鳟鱼)等 MHC I
类分子。结果说明,SLA-3-HB02 在分子遗传关系上
属于 SLA-3 基因,并且该基因接近于美国的 Hanford
品系猪的 SLA-3 基因。但相比较于 SLA-2 和 SLA-1
基因,SLA-3 基因总体比较保守,推测该基因在进
化过程中比较缓慢,也说明该基因在动物体内的利
用率可能不如 SLA-1 和 SLA-2 基因座。
目前,人 HLA-A2 及小鼠 H-2K1 分子各功能
区分子结构已经得到解析[9,10],本试验参照人的
HLA-A2 分子解析的分子结构数据,将 SLA-3-HB02
基因与人的 HLA-A2、HLA-B15 和小鼠 H-2K1 进行
比较,推测其可能的功能位点。比较发现,在 α1
和 α2 区,SLA-3-HB02 保留了 HLA-A2 与抗原多肽
结合的 8 个保守氨基酸残基其中的 7 个,而在 147
位由人的 Trp(W)突变为猪的 Arg (R)[11],这与
之前报道过的 SLA-2-TPK 基因相似[12]。保留共同
的抗原结合位点提示猪和人之间在递呈抗原肽过程
中可能存在交叉。而变异位点的存在又提示 SLA-3-
HB02 在递呈人源多肽时,其识别位点存在差异。在
α1 和 α2 区 HLA-A2 与 β2m 结合的 19 个氨基酸中,
SLA-3-HB02 保留了其中的 13 个 ;在 3 个关系到
HLA-A2 与 CD8 分子结合的关键性氨基酸,即 Gln115
(Q),Asp122(D)和 Glu128(E)[13],SLA-3-HB02 在
相应位置保持了一致,该结果也在一定程度上证明
Chardon 等[8]报道人的 CD8+ 细胞可以直接识别猪
的 SLA-I 类分子的结论是正确的。α3 区,199-205、
211 和 221 位是 MHC I 类分子与 CD8 分子结合的必
需氨基酸[14,15],SLA-3-HB02 发生了两个必需氨基
酸的变异,在 199(V/A)和 211(K/A);相对于
H2-K1,SLA-3-HB02 的变异位点为 211(K/A);相
对于 HLA-B15,变异位点为 199(V/A)和 211(K/A)。
另外,根据 SLA-3-HB02 基因还具有 HLA-A2 识别
CD8 分子的关键位点,并且和鼠的相应位点高度同
源,推测荷包猪与人及鼠的 TCR 可以进行一定的
交叉识别[13]。在穿膜区和胞内区,SLA-3-HB02 与
HLA-A2、HLA-B15 及 H-2K1 比较变异较大,尤其
在胞内区存在一个 10 个氨基酸的缺失,是否在相应
位置存在缺失型的人或小鼠的 MHC I 类分子有待于
进一步研究。
目前,关于猪 SLA-3 基因的晶体结构还未报道,
其详细的蛋白分子二级结构及三级结构(3D)数据
缺乏。同源模建法是根据同源蛋白质三级结构的保
守性大于蛋白质序列的理论,进行蛋白结构模拟。
本研究在 SLA-3-HB02 与 HLA-A2 及 H-2K1 各功能
区氨基酸位点比较的基础上,根据同源模建原理,
2012年第9期 93乔翠等 :荷包猪一类缺失型 SLA-3 等位基因的克隆及生物信息学分析
绘制了 SLA-3-HB02 蛋白分子 3D 结构图,通过与人
和小鼠的 MHC Ⅰ类重链分子 3D 结构比较,发现猪
和人、小鼠的 MHC Ⅰ类分子 3D 结构较相似。其中,
猪 SLA-3-HB02 所保留的人和小鼠 MHC Ⅰ分子决定
抗原多肽结合的 7 个关键氨基酸全部位于抗原多肽
结合槽的 α-螺旋或 β-折叠上,即 SLA-3-HB02 同源
模建的 3D 结构与其功能区的分析一致。同源模建
的结果也显示,SLA-3-HB02 与 HLA-A2 及 H-2K1 存
在识别共同的抗原肽的可能性。另外,3D 结构显示
决定于 CD8 分子结合的两个关键氨基酸位于 α3 区
的 199 位和 211 位,这两个位点显示了 SLA-3-HB02
与 HLA-A2 和 H-2K1 具有差异性。由于起抗原结合
功能主要为 MHC I 类分子胞外区,因此同源模建的
SLA-3-HB02 分子不能显示其胞内区的结构。SLA-3-
HB02 在胞内区起始段存在一段 10 个氨基酸的缺失,
该缺失在动物体内是否会影响 SLA-3-HB02 分子结
合或递呈抗原多肽的功能,需要进一步的研究。
4 结论
本研究从荷包猪发现了一类缺失型的 SLA-3 等
位基因,即 SLA-3-HB02(AB691529),经分析该等
位基因仍然保留了典型的 SLA-3 基因的基本特征、
功能区结构,并与 HLA-A2、HLA-B15 和 H-2K1 基
因在关键位点上有一定的交叉,结构具有一定的相
似性。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)