全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):150-157
收稿日期 ：2015-04-04
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31172304），辽宁省博士启动基金项目（20081078）
作者简介 ：姜平，女，硕士，研究方向 ：动物解剖学与免疫学 ；E-mail ：1224763183 @qq.com
通讯作者 ：高凤山，男，博士，教授，研究方向 ：基因工程和动物分子免疫学 ；E-mail ：gfsh0626@126.com
额尔敦木图，男，博士，教授，研究方向 ：动物解剖学与黏膜免疫学 ；E-mail ：erdemtu962@sina.com
荷包猪 SLA-DRB 基因 cDNA 的克隆及分子进化
特征分析
姜平1，2  额尔敦木图1  高凤山1，2
（1. 内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特 010018 ；2. 大连大学生命科学与技术学院，大连 116622）
摘 要 ： 旨在研究荷包猪 SLA-DRB 基因的分子特征，设计引物用 RT-PCR 扩增 3 头荷包猪 DRB 基因 cDNA，并克隆至
pMD18-T Vector，阳性克隆测序并做序列分析，分别进行同源性、分子进化及主要氨基酸变异位点分析。结果表明，成功从 3 头荷
包猪中扩增得到 SLA-DRB 基因，分别命名为 SLA-DRB-HB01-03，经序列测定后，证实 cDNA 全长为 836 bp，其中 1-801 为 ORF 区，
共编码 266 个氨基酸。同源性分析显示，SLA-DRB-HB 与其他 SLA-DRB 等位基因的同源性介于 90.3%-99.8% 之间。分子进化分析表
明，荷包猪 SLA-DRB-HB 独立分支，与其他等位基因相比较，进化更加原始。氨基酸变异位点和多态性分析结果显示，SLA-DRB-
HB 本身存在一定的多态性。
关键词 ： 荷包猪 ；SLA-DRB ；分子进化 ；多态性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.022
The Cloning of cDNA of SLA-DRB from Hebao Pigs and the Analysis of
Their Molecular Evolutionary Characteristics
Jiang Ping1，2 Erdemtu1 Gao Fengshan1，2
（1. College of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018 ；2. College of Life Science and Technology，
Dalian University，Dalian 116622）
Abstract: In order to study the molecular characteristics of SLA-DRB derived from Hebao pigs, a pair of primers were designed to amplify
the cDNA of SLA-DRB from 3 Hebao pigs. Then the amplified cDNA were cloned into pMD18-T vector and the positive clones were sequenced
and analyzed by homology comparing, molecular evolution analysis, and comparing and analyzing the key amino acid sites. It was shown that the
SLA-DRB alleles were amplified successfully from the tissues of the 3 Hebao pigs, and the alleles were designated as SLA-DRB-HB01, 02, and
03. After sequencing, the results showed that the cDNA of SLA-DRB-HB alleles was 836 bp, and the open reading fragments（ORF）of SLA-
DRB-HB locating at sites of 1-801, encoding 266 amino acids. By homology analyzing, the SLA-DRB-HB genes had a homology value of 90.3%-
99.8% with other SLA-DRB alleles. The analysis of molecular evolution showed that the SLA-DRB-HB alleles were clustered an independent
branch of phylogenetic tree, and SLA-DRB-HB evolved more primarily in contrast to other SLA-DRB alleles. The analysis of the mutated amino
acids sites and the polymorphism of SLA-DRB-HB demonstrated that they had polymorphism.
Key words: Hebao pig ；SLA-DRB ；molecular evolution ；polymorphism
动物识别自己、排除非己以维持机体正常生理
活动和抵抗疾病的能力是免疫系统的核心职能。这
种能力很大程度上是由各物种的主要组织相容性抗
原 复 合 体（Major histocompatibility complex，MHC）
基因所决定［1］。猪的主要组织相容性复合体又称
猪的白细胞抗原（Swine lymphocyte antigen，SLA），
2015,31(12) 151姜平等 ：荷包猪 SLA-DRB 基因 cDNA 的克隆及分子进化特征分析
由 Vaiman 等［2］ 和 Viza 等［3］ 于 1970 年首次发现。
Rabin 等［4］ 发 现 其 定 位 于 猪 的 第 7 号 染 色 体 上 ；
Geffrotin 等［5，6］用原位杂交、染色体标记和基因间
常规连锁分析，进一步确定 SLA 基因位于第 7 号染
色体的短臂上。目前 SLA 可分为 3 个主要类群 ：Ⅰ
类区域基因、Ⅱ类区域基因和Ⅲ类区域基因［7］。其
中，Ⅱ类基因位于 SLA-D 区，它控制着机体的细胞
免疫和体液免疫应答，并在调节机体的抗病能力方
面起到非常重要的作用［8］。
SLA Ⅱ 类 基 因 主 要 包 括 DRa、DRb、DQa、
DQb、Dob、Dpa、TAP、LMP 等。Ⅱ类基因有 α 和
β 两种基因，分别编码 α 肽链和 β 肽链。SLA Ⅱ类
也包含多种基因座，其中只有 SLA-DR 和 SLA-DQ
在蛋白质水平上进行表达。SLA-DR 分子是跨膜异二
聚体，它由一条约 34 kD 的 α 链与一条约 29 kD 的
β 链以非共价键结合而成，每一条链分为 3 个区，N
端的胞外区、中间的穿膜区和 C 端的胞质区［9］。其
中穿膜区和胞质区与Ⅰ类分子的相应结构类似，而
胞外区则不同，该区可分为两个结构域，在 α 链上
为 α1 和 α2，β 链上为 β1 和 β2（α 和 β 链均包含约
90 个氨基酸残基），与免疫球蛋白的结构类似。α1
和 β1，特别是 β1 有较高的可变性，故呈现较高多
态性，这样有利于机体适应不同外来抗原。α1 和 β1
各形成 4 条 β 折叠股和 1 条 α 螺旋，8 条 β 折叠股
组成一个底层，支撑 2 个 α 螺旋，α 链和 β 链 2 个 α
螺旋形成肽结合区（PBD）深槽的侧面。跨膜片段
由 25 个疏水性氨基酸残基组成，可能形成 α 螺旋穿
过脂质双分子层，并使分子固定在细胞膜上［10］。
荷包猪是辽宁省特有的珍贵地方品种，也是国
家级的种质资源保护品种，已被列入《国家畜禽品
种资源保护名录》［11］。荷包猪由于其地处辽西交通
不便的山区一带——葫芦岛市建昌县和朝阳市凌源、
喀左、朝阳三县与建昌接壤的地方，长期进行自繁
自育，原始进化，因而推测其基因进化程度不高，
稳定的基因特征非常适合作为科学研究的模式实验
动物。目前为止，已经成功地克隆了荷包猪 SLA- Ⅰ
类基因全部序列，并分析了其分子进化特征［12］。为
了更全面地研究荷包猪的 SLA 分子进化特征，有必
要研究其他 SLA 功能基因。为此，本研究将选择
SLA-DR 基因为研究对象，克隆其 β 链序列，对其进
行分子进化和氨基酸变异位点多态性分析，旨在为
全面解析 SLA-Ⅱ类分子的进化特征提供新的数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 荷包猪脾脏（3 个个体）（辽宁省畜牧
科学研究院荷包猪保种场）。
1.1.2 主要试剂 pMD18-T Vector，E. coli JM109，总
核 酸 提 取 试 剂 盒 TRIZOL， 反 转 录 试 剂 盒 Reverse
Transcriptase M-MLV（RNase H-），DNA 回收试剂盒
Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0，EcoR Ⅰ 及
Hind Ⅲ限制性内切酶均为 TaKaRa 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引 物 设 计 扩 增 荷 包 猪 SLA-DRB 的 引
物 的 设 计 参 考 文 献 设 计 ：上 游 引 物 ：DRBF1 ：
5-GTTCTCCAGCATGTTGCATCTGTG-3 ；下游引物 ：
DRBR1 ：5-AGAGGATGCTTGCTTGGAGTCTC-3。
1.2.2 总 RNA 提取及 RT-PCR 采用 TRIZOL 试剂
盒并按照文献［13］方法从脾脏提取总 RNA。然后
以 Oligo（dT）作为引物，按照反转录试剂盒说明将
核酸反转录为 cDNA。然后以引物 DRBF1/DRBR1 扩
增 SLA-DRB，PCR 程序为 ：94℃ 3 min ；94℃ 1 min，
65℃ 1 min，72℃ 2 min，30 个 循 环 ；72℃ 10 min。
扩增 PCR 产物经纯化试剂盒回收。
1.2.3 基因克隆及重组子筛选 将纯化后的 SLA-
DRB 分 别 与 pMD18-T 载 体 连 接， 并 转 化 宿 主 菌
JM109。重组菌用含 Amp 的 LB 培养基进行抗性筛选，
碱裂解法提质粒，EcoR Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切鉴定，1%
琼脂糖凝胶电泳分析［14］。
1.2.4 序列测定与分析 通过将培养得到的 3 个体
阳性克隆送至上海生工测序，将获得的 3 个个体的
SLA-DRB 基 因 cDNA 分 别 命 名 为 ：SLA-DRB-HB01、
SLA-DRB-HB02 和 SLA-DRB-HB03，应用 GENTYX9.0
（Software Development co.，Ltd）软件进行拼接，序
列通过 SAKURA 系统登录入 DDBJ/GenBank。
1.2.5 SLA-DRB 同 源 性 分 析 从 DDBJ/EMBL/Gen-
Bank 中搜索所有 SLA-DRB 各等位基因 cDNA 全序列，
见 表 1。 用 DNAMAN Version 5.2.2（Lynnon Biosoft）
对各等位基因之间氨基酸序列进行比较，按照文
献［15］所述方法并略作改动进行关键位点氨基酸
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12152
表 1 DDBJ/EMBL/GenBank 中 SLA-DRB 基因
SLA-DRa 等位基因 登录号 物种 参考文献
SLA-DRB-HB01 LC20542 Hebao In this article
SLA-DRB-HB02 LC20543 Hebao In this article
SLA-DRB-HB03 LC20544 Hebao In this article
SLA-DRB*gz AY102480 Chinese Guangzhou ［16］
SLA-DRB*yn AY102481 Chinese Yunan Banna ［16］
SLA-DRB*C16A03 AY135578 unknown ［17］
SLA-DRB*wx AF464032 Yucatan ［17］
SLA-DRB*z AF464034 Yucatan ［17］
SLA-DRB*gx AY102479 Chinese Guangxi ［17］
SLA-DRB AB205163 Crossbreed ［18］
SLA-DRB*65N19 AY135581 unknown ［17］
SLA-DRB*n AY126721 Hanford ［17］
SLA-DRB*m AY135575 Sinclair ［17］
SLA-DRB*a-1 AY135582 Hanford ［17］
SLA-DRB*a-2 AY135583 Sinclair ［17］
SLA-DRB*t AY135584 Sinclair ［17］
SLA-DRB*bs133 AY191776 unknown ［19］
SLA-DRB AY243103 Taihu Unpublished
SLA-DRB AY243107 Wuzhishan Unpublished
SLA-DRB*Wu01 DQ395123 Wuzhishan Unpublished
SLA-DRB1*1101 DQ883225 Korean native pig ［20］
SLA-DRB-c M55165 Inbred miniature pig ［23］
SLA-DRB-d M55166 Inbred miniature pig ［23］
注 ：表中所列 SLA-DRB 基因为包含整个编码区的基因序列
置换率的计算和统计。之后应用 DNAStar 7.2 分析各
等位基因之间核酸序列同源性。
1.2.6 SLA-DRB 分子进化研究 以人的 HLA-DRB3
（U66825）为参照，运用 DNAMAN Version 5.2.2（Ly-
nnon Biosoft） 和 Mega5.0 软 件（Mega software co.，
Ltd）的 Neighbor-Joining 法绘制 SLA-DRB 各等位基
因之间分子进化树。
1.2.7 SLA-DRB 多 态 性 分 析 首 先 通 过 获 得 荷 包
猪 SLA-DRB 基 因 序 列 推 导 其 氨 基 酸 序 列， 应 用
DNAMAN 对获得的 3 个个体的氨基酸序列的主要氨
基酸变异位点进行比较分析，发现其变异位点。然
后与从 GenBank 中获得人的经典 HLA-DRB 基因序列
推导获得的氨基酸序列，以 HLA-DRB 多态性位点作
为参照，分析荷包猪 SLA-DRB-HB 的多态性。
2 结果
2.1 猪SLA-DRB基因座的克隆
3 个 个 体 的 RNA 利 用 引 物 DRBF1/DRBR1 经
RT-PCR 得 到 大 约 800 bp 的 条 带， 与 理 论 计 算 值
836 bp 大 小 相 符 合， 产 物 命 名 为 SLA-DRB-HB01、
SLA-DRB-HB02 和 SLA-DRB-HB03，（ 图 1-A）。 分 别
将 SLA-DRB-HB01-03 克 隆 入 pMD18-T 载 体， 转 化
JM109，培养后用碱裂解法提质粒，EcoR Ⅰ和 Hind
Ⅲ双酶切筛选和鉴定，证实插入片段与目的基因大
小相符（图 1-B）。
2.2 猪SLA-DRB基因座序列测定
经序列测定和 GENTYX9.0（Software Developm-
ent co.，Ltd）软件分析，SLA-DRB-HB 长度为 836 bp，
其 中 1-801 为 ORF 区， 共 编 码 266 个 氨 基 酸。3
个 个 体 SLA-DRB-HB01、SLA-DRB-HB02、SLA-DRB-
HB03 序列分别提交至 GenBank，获得序列号分别为
LC20542、LC20543 和 LC20544。
2.3 猪SLA-DRB基因座序列比较与分析
经 与 DDBJ/EMBL/GenBank 上 所 有 SLA-DRB 序
列比较，发现 SLA-DRB-HB 推导的氨基酸序列与其
2015,31(12) 153姜平等 ：荷包猪 SLA-DRB 基因 cDNA 的克隆及分子进化特征分析
它 SLA-DRB 等位基因的突变位点主要集中在信号肽
区（1-29）、β1 区（30-123） 和 β2 区（124-217）。
其中信号肽区超过 4 个等位基因发生氨基酸突变的
位点包括 2、10、11、17、18 和 19。在 β1 区超过 4
个以上等位基因发生氨基酸突变的位点有 27 个。β2
区突变位点有 11 个，然而超过 4 个等位基因发生突
变的位点只有 201 位。穿膜和胞浆功能区（218-226）
变异位点共有 6 个，其中只有第 232 位超过 4 个等
位基因发生氨基酸位点突变（图 2）。
2.4 SLA-DRB各等位基因之间氨基酸置换率分析
经计算各等位基因主要位点氨基酸置换率，发
现变异主要集中在 β1 区，其中置换率超过 0.5 的有
13 个位点，置换率超过 1 的有 5 个位点。β2 只有一
个位点置换率超过 0.5。其余的功能区氨基酸置换率
均在 0.5 以下（图 3）。
2.5 SLA-DRB-HB与SLA-DRB各等位基因同源关系
分析
SLA-DRB-HB 与其它 SLA-DRB 序列通过 DNAStar
7.2 进行同源比较和分析，同源性在 90.3%-99.8%
之 间。 其 中 与 美 国 辛 克 莱 Sinclair 品 系 AY135575
和中国 Taihu 品系 AY243103 同源性最高，均达到
了 99.8%， 与 AY135581 同 源 性 最 低， 仅 为 90.3%
（图 4）。
2.6 SLA-DRB种内分子进化特征分析
根据猪 SLA-DRB-HB 各等位基因以及所有 SLA-
DRB 等位基因，利用 DNAMAN 和 Mega5.0 软件绘制
SLA-DRB-HB 基因的分子进化树。结果（图 5）显示，
荷包猪 3 个个体 SLA-DRB-HB 聚类成一个遗传关系
最近的家族，其中 SLA-DRB-HB01 和 SLA-DRB-HB02
相对接近。荷包猪与我国贵州 SLA-DRB-AY102480、
美国的 Sinclair 品系 SLA-DRB-AY24135575-Sinclair 以
及我国的太湖 SLA-DRB-AY243103 遗传关系相对接
近，而与我国的五指山品系 SLA-DRB-DQ395123 以
及韩国的 SLA-DRB*1101-DQ883225 遗传关系较远。
2.7 荷包猪SLA-DR-HB多态性分析
2.7.1 SLA-DRB-HB 分子内可能的变异位点比较
将 SLA-DRB-HB 3 个等位基因利用 DNAMAN 进行序
列比较分析，结果（表 2）发现变异主要集中在 β1
和 β2 区，其中 β1 区存在 5 个变异位点，分别是 38
（S → F）、53（V → M）、57（D → E）、69（S →
F → L）和 116（D → V）；β2 区也有 5 个位点发生
变 异， 分 别 在 128（A → V）、130（V → A）、158
（A → V）、174（A → T）、183（A → T） 和 213
（V → A）；而穿膜区则仅出现了 1 个变异位点，265
位（P → L）。
2.7.2 SLA-DRB-HB 与人 HLA-DRB 多态性位点比较
分析 SLA-DRB-HB 经过与人 HLA-DRB 相比较，发
现在人 DRB β1 区 17 个典型的多态性氨基酸残基位
点中，SLA-DRB-HB 只有 1 个位点（β25）保留，而
参照序列保留了 4 个位点（β25、β28、β30 和 β31）
（图 6）。
3 讨论
本 研 究 克 隆 的 荷 包 猪 SLA-DRB-HB 基 因， 与
DDBJ/EMBL/GenBank 上 所 有 SLA-DRB 序 列 进 行 比
较， 发 现 SLA-DRB-HB 推 导 的 氨 基 酸 序 列 与 其 他
SLA-DRB 等位基因的突变位点主要集中在 β1 区（30-
123）和 β2 区（124-217）。经过氨基酸置换率分析，
进一步发现氨基酸置换率高的位点均分布在 β1 区。
β1 区的氨基酸突变主要集中在 37-42 以及 52-60，
该研究结果与之前的报道基本一致［21］。而 β1 区是
承担 SLA II 类分子抗原多肽结合与递呈的功能区［16］，
从结果可以推测 β1 区某些关键的氨基酸位点或区
域由于不断与不同抗原多肽结合，在进化上造成选
择压力，从而导致氨基酸位点突变。因此，β1 区的
37-42 以及 52-60 非常可能与抗原多肽结合及递呈
有关。
2000
bp
836
bp
MA 1 2 3
1000
750
500
250
100
2000
bp 䖭փ䍘㋂ᨂޕ⡷⇥bpMB 4 5 6 71000
750
500
250
100
1-3 ：分别为 3 个个体的 SLA-DRB-HB 基因 RT-PCR 扩增结果 ；4-6 ：分别
为 3 个个体 pMD18-T/SLA-DRB-HB 的酶切鉴定结果 ；7 ：重组质粒 ；M ：DL
2000 DNA ladder
图 1 PCR 扩增 SLA-DRB-HB 基因（A）及双酶切鉴定（B）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12154
SLA-DRB-HB 与 SLA-DRB 其他等位基因同源性
比较，同源率介于 90.3%-99.8% 之 间。其 中与美
国辛克莱 Sinclair 品系 AY135575 和中国的 Taihu 品
系 AY243103 同源性最高，均达到了 99.8%，而与
AY135581 的同源性最低，只有 90.3%。结果说明荷
包猪很可能与美国辛克莱 Sinclair 品或中国的 Taihu
猪在进化上或遗传上具有某种联系。
从分子进化树中发现，在人 HLA-DRB 作为参
照的情况下，SLA-DRB-HB 在遗传关系上位于 SLA-
DRB 基因家族的较远分支且独立成一支。说明该
Signal peptide(1-29,29aa) * Beta 1 domain ˄ 30-123,94aa˅
HB-DRB01 MLHLCFSRGFWMAALTVMLVVLSPPLALARDTPPHFLSLGKFECHFFNGTEQVRLLERQYYNGEEFVRSDSDVGEYRAVTELGRPDAKNY 90
HB-DRB02 -------------------------------------F------------------------------F--------------------- 90
HB-DRB03 -------------------------------------F--------------M---------------L--------------------- 90
AY102480 -------------------------------------F------------------------------F--------------------- 90
AY102481 -------------------------------------L-V-S---------R--FM--H------H--F----------------S--YW 90
AY135578 -AC------S-------IV------------I----FFM--S---------R--Y-LKYL--------F---L----E----------YW 90
AF464032 ------------V------------------------H-V-H--R------R-L--D-YF--------F------F------------YW 90
AF464034 -------------------------------------Y-L-----------R-------------Y--F----------------V--DW 90
AY102479 ----------R-V------------------------H-V-H--R------R-L--D-YF--------F------F------------YW 90
AB205163 --------A-------E-------S------------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F---S--YW 90
AY135581 -AC------S-------IV------------IAQ--FFM--S---------R--Y-QKYL--------F---L--F------------YW 90
AY126721 ----------------M--------------------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F------YW 90
AY135575 -------------------------------------F------------------------------F--------------------- 90
AY135582 -------------------------------------H-L-----------R--------------L-F-------------------DW 90
AY135583 -------------------------------------H-L-----------R--------------L-F-------------------DW 90
AY135584 -AC------S-------IV------------IAQ--FFM--S---------R--Y-QKYL--------F---L--F------------YW 90
AY191776 ----------------M--------------------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F---S--YW 90
AY243103 -------G-----------------------------F------------------------------F--------------------- 90
AY243107 ----------------M--------------------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F------YW 90
DQ395123 ----------------M--------------------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F------YW 90
DQ883225 ---------------------------------T---H-V-S--R------R--F-D-YF--------F------F-E---F-----EYW 90
M55165 -AC------S-------IV------------I-----HQL-----------R----Q-NC-----Y--F-------------------YR 90
--------------H-L-----------R--------------L-F-------------------DW 90 M55166 -----------------------
Beta 1 domain ˄ 94aa˅ * Beta 2 domain (124-218,95aa)
HB-DRB01 NSQKDLLEQRRAEVDTYCRHNYRTSDTFLVPRRAEPRATVYPAKTQPLQHHNLLVCSVTGFYPGHVEARWFRNGQEEAAGVVSTGLIPNG 180
HB-DRB02 -------------------------------------V-A---------------------------V---------------------- 180
HB-DRB03 -------------------------V-----------V-----------------------------V---------------------- 180
AY102480 -------------------------------------V-----------------------------V---------------------- 180
AY102481 -----I--EK---------------------------V--------------------------R--V---------------------- 180
AY135578 -----------EK---------GV--S---------TV-----------------------------V---------------------- 180
AF464032 -----I--DS--S-----I----IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AF464034 -------------------------------------V-----------------------------V---------------------- 180
AY102479 -----I--DS--S-----I----IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AB205163 -----FM--K------V-----EI-E-----------V-----------------------------V---------V------------ 180
AY135581 ------M--K--V----------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AY126721 -----FM--K------V-----EILE-----------V-----------------------------V---------------------- 180
AY135575 -------------------------------------V-----------------------------V---------------------- 180
AY135582 -----------------------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AY135583 -----------------------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AY135584 ------M--K--V----------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
AY191776 -----FM--K------V-----EI-E-----------V-----------------------------V---------V------------ 180
AY243103 -------------------------------------V-----------------------------V---------------------- 180
AY243107 -----FM--K------V-----EILE-----------V---------P-------------------V---------------------- 180
DQ395123 -----FM--K------V-----EILE-----------V-----------------------------V---------------------- 180
DQ883225 --L--F---S-TA------Y--GVF-G---S------V-----------------------------V---------------------- 180
M55165 ------------A----------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180
-------IL-----------TV-----------------------------V---------------------- 180 M55166 ----------------
Beta 2 domain (124-218,95aa) * Transmembrane domain (49aa)
HB-DRB01 DWAFQTMVMLETVPQSGEVYSCRVEHPSLTSPVTVEWRARSESAQGKMMSGIGGFVLGLLFVAVGLFIYFKNQKGRPALQPTGLPS 266
HB-DRB02 --T----------------------------------------------------------------------------------- 266
HB-DRB03 --T-----------------------------A---------------------------------------------------L- 266
AY102480 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AY102481 --T-----------------T------------------------------V--------------------------------L- 266
AY135578 --T------------------------------------------------V--------------------------------L- 266
AF464032 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AF464034 --T------------------------------------------------V--------------------------------L- 266
AY102479 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AB205163 --T-H---------------T---------------------------------------------------------------L- 266
AY135581 --T------------------------------------------------V-----------------------........-L- 258
AY126721 --T-----------------T---------------------------------------------------------------L- 266
AY135575 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AY135582 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AY135583 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
AY135584 --T------------------------------------------------V--------------------------------L- 266
AY191776 --T-----------------T---------------------------------------------------------------L- 266
AY243103 --T--------------------------------------------------------------------S----------A-L- 266
AY243107 --T-----------------T--------------------------------------------------------------PL- 266
DQ395123 --T-----------------T------------------------------------------------I--------------L- 266
DQ883225 --T------------------------------------------------V--------------------------------L- 266
M55165 --T------------------------------------------------V--------------------------------L- 266
M55166 --T---------------------------------------------------------------------------------L- 266
SLA-DRB 分 为 4 个 功 能 区 ：信 号 肽 区 ：1-29 aa ；β1 功 能 区 ：30-123 aa ；β2 区 ；124-217 aa ；穿 膜 和 胞 浆 功 能 区（218-266 aa）：
“-”代表相同氨基酸 ；“*”代表 SLA-DRB 前一个功能区最后的氨基酸，氨基酸用粗斜体表示
图 2 SLA-DRB-HB 与 DDBJ/EMBL/GenBank 上其他 SLA-DRB 的多重序列比较
2015,31(12) 155姜平等 ：荷包猪 SLA-DRB 基因 cDNA 的克隆及分子进化特征分析
基因与其他 SAL-DRB 具有相对远的遗传距离和亲
缘关系，是 SLA-DRB 等位基因家族的一个远系成
员，进化比较缓慢。其中，SLA-DRB-HB 与我国贵
州 SLA-DRB-AY102480、 美 国 的 Sinclair 品 系 SLA-
DRB-AY24135575-Sinclair 以及我国的太湖 SLA-DRB-
AY243103 遗传关系相对接近，基本上与上述同源性
分析的结果一致，荷包猪是否与这些同源性和进化
关系密切的品种存在共同的祖先，有待于进一步调
查。经分析，该荷包猪只分布于我国辽宁省偏僻的
山区，这种原始低等进化的分子特征是由于地理生
殖隔绝造成的［22］。今后，可以以荷包猪为选配品种，
进行优化育种，而本研究为今后荷包猪的遗传育种
提供基因方面的参考数据。
通过对 3 个个体 SLA-DRB-HB 的氨基酸序列进
行比较发现，主要变异位点集中在 β1 区和 β2 区，
而且这些位点比较分散，只有 2 个变异位点（38 和
57）位于 β1 区的 37-42 和 52-60，另外还有一个位
点位于胞质区。推测这些变异位点并不是由于在进
化过程中不断接触不同的抗原肽形成选择压力等造
成的，而可能是存在其他外来因素，如在该品系进
化过程中某一阶段有过与其他品种发生杂交等造成。
进一步分析荷包猪 SLA-DRB-HB 与人 HLA-DRB 主要
多态性位点发现，荷包猪只保留了 1 个人 HLA-DRB
0
0.2
0.4
0.6ケਈ⦷ 0.81.01.21.4 β1४ β2४≘ส䞨ս⛩8 11 18 32 37 40 52 55 58 64 69 78 88 93 99 103 110 115 121 130 158 185 232 263
从上到下第一条虚线代表氨基酸置换率为 1，第二条虚线代表氨基酸置换率
为 0.5。氨基酸置换率为整个等位基因群中突变的氨基酸位点数目除以未突
变的氨基酸位点数目。未突变的氨基酸指不同等位基因同一位点相同氨基
酸最多的氨基酸
图 3 SLA-DRB 各等位基因氨基酸置换率
图 4 SLA-DRB-HB 与其他 SLA-DRB 同源性比对
的典型多态性位点［23］，而参照序列保留了 4 个。该
结果进一步说明荷包猪与人的亲缘关系相对于其他
品系更远，亦即其进化更原始，该结论与之前对荷
包猪的研究所得出的结论基本一致［24］。该结果也揭
示作为进化更原始的荷包猪，其基因资源非常宝贵，
适合于作科学研究的模型材料。
4 结论
本研究成功克隆了荷包猪 SLA-DRB-HB 三个等
位基因，获得基因序列号，序列分析证明荷包猪的
SLA-DRB 相对于其他品系猪基因进化比较原始。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12156
参 考 文 献
［1］ Gao C, Jiang Q, Guo D, et al. Characterization of swine leukocyte
antigen（SLA）polymorphism by sequence-based and PCR-SSP
methods in Chinese Bama miniature pigs［J］. Dev Comp Immunol,
2014, 45（1）：87-96.
［2］ Vaiman M, Renard C, LaFage P, et al. Evidence for a histocompatib-
ility system in swine（SL-A）［J］. Transplantation, 1970, 10（2）：
155-164.
SLA-DRB-HB-DRB01
SLA-DRB-HB-DRB02
SLA-DRB-HB-DRB03
SLA-DRB*gz-AY102480
SLA-DRB*m-AY135575-Sinclair
SLA-DRB-AY243103-Taihu
SLA-DRB-d-M55166
SLA-DRB*a-1-AY135582-Hanford
SLA-DRB*a-2-AY135583-Sinclair
SLA-DRB*z-AF464034-Yucatan
SLA-DRB*yn-AY102481
SLA-DRB-c-M55165
SLA-DRB*C16A03-AY135578
SLA-DRB*65N19-AY135581
SLA-DRB*t-AY135584
SLA-DRB*wx-AF464032-Yucatan
SLA-DRB*gx-AY102479
SLA-DRB-AB205163
SLA-DRB*bs133-AY191776
SLA-DRB*n-AY126721-Hanford
SLA-DRB-AY243107-Wuzhishan
SLA-DRB*Wu01-DQ395123-Wuzhishan
SLA-DRB*1101-DQ883225-Korean
HLA-DRB3-U66825
100
95
100
92
72
93
100
65
37
16
20
10054
63
31
61
39
99
26
17
0.02
采用的 SLA-DRB 类分子的氨基酸序列均为完整的编码序列，包括 DDBJ/EMBL/GenBank 上所有的 SLA-DRB 基因，各基因
的表示为 ：等位基因名称“-”基因序登录号“-”品系表示 ；HLA-DRB-U66825 为参照序列
图 5 SLA-DRB-HB 各等位基因的分子内关系进化树
KFECHFFN TEQVRLLER YYNGEEFVR DSDVGEYRA TELGRPDAK YNSQKDLLEQRRAEVDTYC HNYRTSDTF
10 20 30 40 50 60 70 80 90
*** * ** * ** ** * * * ** *
L G Q S V N R LSLA-DRB-HB01 RDTPPHFLS G VPRR 94
SLA-DRB-HB02 --------F------------------------------F------------------------------------------------------ 94
SLA-DRB-HB03 --------F--------------M---------------L----------------------------------------------V------- 94
SLA-DRB-AY243107 --------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F------YW-----FM--K------V-----EILE------- 94
SLA-DRB-DQ395123 --------F---A---------R----D-YF---D-Y--F------F-E---F------YW-----FM--K------V-----EILE------- 94
HLA-DRB-U66825 G--R-R--E-R-S---------R--Y-D-YFH-Q---L-F----------------V-ESW---------K-GR--N------GVGES-T-Q-- 94
LA-DRB-M20430 G--R-R--WQP-R---------R--F-D-YF--Q--S--F------F-----------EYW-----I---A--A---------GVVES-T-Q-- 94 H
* 代表人 HLA-DRB 的 17 个典型的多态性位点
图 6 SLA-DRB-HB 与人 HLA-DRB β1 多态性位点比较
表 2 比较 SLA-DRB-HB 各等位基因的氨基酸变异位点
位置
序列
β1 区 β2 区 穿膜和胞浆功能区
38 53 57 69 116 128 130 158 183 213 265
HB01 S V D S D A V A A V P
HB02 F V E F D V A V T A P
HB03 F M E L V V A V T A L
2015,31(12) 157姜平等 ：荷包猪 SLA-DRB 基因 cDNA 的克隆及分子进化特征分析
［3］ Viza D, Sugar JR, Binns RM. Lymphocyte stimulation in pigs ：
evidence for the existence of a single major histocompatibility locus,
PL-A［J］. Nature, 1970, 227（5261）：949-950.
［4］ Rabin M, Fries R, Singer D, et al. Assignment of the porcine
major histocompatibility complex to chromosome 7 by in situ
hybridization［J］. Cytogenet Cell Genet, 1985, 39（3）：206-209.
［5］ Geffrotin C, Popescu CP, Cribiu EP, et al. Assignment of MHC
in swine to chromosome 7 by in situ hybridization and serological
typing［J］. Ann Genet, 1984, 27（4）：213-219.
［6］ Smith TP, Rohrer GA, Alexander LJ, et al. Directed integration of the
physical and genetic linkage maps of swine chromosome 7 reveals
that the SLA spans the centromere［J］. Genome Res, 1995, 5（3）：
259-271.
［7］ Ando A, Imaeda N, Ohshima S, et al. Characterization of swine
leukocyte antigen alleles and haplotypes on a novel miniature pig
line, Microminipig［J］. Anim Genet, 2014, 45（6）：791-798.
［8］ Shinkai H, Arakawa A, Tanaka-Matsuda M, et al. Genetic variability
in swine leukocyte antigen class II and Toll-like receptors affects
immune responses to vaccination for bacterial infections in
pigs［J］. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2012, 35（6）：
523-532.
［9］ Chardon P, Renard C, Vaiman M. The major histocompatibility
complex in swine［J］. Immunol Rev, 1999, 167 ：179-192.
［10］ Lunney JK, Ho CS, Wysocki M, et al. Molecular genetics of the
swine major histocompatibility complex, the SLA complex［J］.
Dev Comp Immunol, 2009, 33（3）：362-374.
［11］宋恒元 . 辽宁地方良种—荷包猪［N］. 中国畜牧报 , 2005, 01,
26.
［12］ Gao FS, Bai J, Gong XJ, et al. Analyzing the genetic characteristics
and function of the swine leukocyte antigen 2 gene in a Chinese inb-
reed of pigs［J］. Microbiol Immunol, 2012, 56（3）：208-215.
［13］ 高凤山 , 夏春 , 张强 , 等 . 大肠杆菌表达的重组猪 β2 微球蛋
白二级结构的圆二色谱分析［J］. 微生物学报 , 2009, 49（12）：
1596-1600.
［14］ 高凤山 , 姜平 , 李新生 , 等 . 我国巴马小型猪 SLA-2 基因克隆
及分子特征［J］. 微生物学通报 , 2007, 34（4）：686-690.
［15］ 张宏 , 郑欣 , 吴桂丹 , 等 . HBsAg-/HBV DNA+ 献血者生物学分
布特征的研究［J］. 中国输血杂志 , 2014, 27（8）：838-842.
［16］ Chen F, Xie J, Zhou Y, et al. Novel SLA-DR alleles of three
Chinese pig strains and the related function in human T cell
response［J］. Cell Mol Immunol, 2004, 1（3）：212-218.
［17］ Smith DM, Lunney JK, Martens GW, et al. Nomenclature for factors
of the SLA class-I system, 2004［J］. Tissue Antigens, 2005, 65（2）：
136-149.
［18］ Gao FS, Wang L, Li XS, et al. Cloning α and β chains of SLA-DR
loci and reconstruction of their complex in vitro［J］. Frontiers of
Agriculture in China, 2008, 2（3）：355-360.
［19］ Zeng R, Zeng YZ. Molecular cloning and characterization of
SLA-DR genes in the 133-family of the Banna mini-pig inbred
line［J］. Anim Genet, 2005, 36（3）：267-269.
［20］ Lee YJ, Cho KH, Kim MJ, et al. Sequence-based characterization of
the eight SLA loci in Korean native pigs［J］. Int J Immunogenet,
2008, 35（4-5）：333-334.
［21］ 王燕 , 邢小为 , 薛立群 , 等 . 湖南大围子猪 SLA-DR 基因克隆
及其生物信息学分析［J］. 细胞与分子免疫学杂志 , 2009, 25
（9）：770-773.
［22］ 宋恒元 , 郑旭 , 王春艳 . 荷包猪品种资源调查报告［J］. 猪业
科学 , 2014, 31（9）：130-131.
［23］ Gustafsson K, Germana S, Hirsch F, et al. Structure of miniature
swine class II DRB genes ：conservation of hypervariable amino
acid residues between distantly related mammalian species［J］.
Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87（24）：9798-9802.
［24］ Gao FS, Xu CB, Zhang XH, et al . Analysing molecular
characteristics of the SLA-1 gene from Chinese Hebao pigs［J］. J
Genet, 2012, 91（2）：219-221.
（责任编辑 马鑫）