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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第11期
苏 云 金 芽 胞 杆 菌（Bacillus thuringiensis， 简 称
Bt）杀虫晶体蛋白是一类具有高度特异性的杀虫蛋
白，被广泛的用于农业、林业、卫生害虫的防治［1，2］。
从 2006 年至今仅中国就有 166 个杀虫晶体蛋白被发
掘命名［3］，对杀虫晶体蛋白基因的克隆及功能研究
已经成为当前 Bt 研究的热点之一。
cry1Ie 是本实验室宋福平等克隆的具有自主知
收稿日期 : 2012-04-06
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31171911）, 国家“973”计划项目（2009CB118902）, 国家“863”计划项目（2011AA10A203）
作者简介 : 张春鸽 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生防微生物分子生物学 ; E-mail: lzcg0451@yahoo.com.cn
通讯作者 : 张杰 , 男 , 博士生导师 , 研究方向 : 生防微生物分子生物学 ; E-mail: jzhang@ippcaas.cn
不同启动子表达 Cry1Ie 蛋白的特性分析
张春鸽1，2 赵灿1，2 束长龙2 孙冰2 宋福平2 高继国1 张杰2
（1 东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030 ；2 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害
生物学国家重点实验室，北京 100193）
摘 要 ： 苏云金芽胞杆菌启动子 P1Ac 与 T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白对鳞翅目害虫小菜蛾（Plutella xylostella）幼虫的杀虫
活性有较大差异。P1Ac 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白 LC50 为 1.73 μg/mL，T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白 LC50 为 18.18 μg/mL，后者是前
者的 10.5 倍。主要从形态、碱溶性及抗胰蛋白酶稳定性等方面对其进行了初步的探索。结果显示，两者在形态上无显著差异，均
有相对较为规则的颗粒存在 ；在碱溶性方面无显著差异，均有约 20.0% 的包涵体能溶解于 pH10.5 50.0 mmol /L Na2CO3 的溶液 ；在
对抗胰蛋白酶的稳定性方面无明显差异，由此说明这三方面都不是二者活性差异的原因，推测是 T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白折叠
不正确导致其活性较差。
关键词 ： cry1Ac 基因启动子 P1Ac T7 启动子 大肠杆菌 Cry1Ie 蛋白 表达
Analysis of Expressed Cry1Ie Protein Initiated by
Different Promoters
Zhang Chunge1，2 Zhao Can1，2 Shu Changlong2 Sun Bing2 Song Fuping2 Gao Jiguo1 Zhang Jie2
（1College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030 ；2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect
Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）
Abstract: Insecticidal activity against Plutella xylostella between two proteins expressed under the promoter of cry1Ac gene（P1Ac）from
Bacillus thuringiensis（Bt）and T7 from E. coli respectively was very different. LC50 of Cry1Ie polypeptides expressed by P1Ac was 1.73 μg/mL,
and that expressed by T7 Promoter was 18.18 μg/mL. The latter is 10.5 folds of the former. In this study, the analyzes of Cry1Ie polypeptides
on shape, solubility in alkaline, resistance to trypsin were performed respectively. The results showed no significant difference in both shape
and solubility, the regular particles of expressed polypeptides could be observed under electric microscope, and approximate 20% inclusion
body of two expressed polypeptides could be resolved in 50.0 mmol/L Na2CO3 solution with pH10.5. Western blot result demonstrated that both
expressed Cry1Ie showed very poor stability against trypsin. All the results indicated that the reason of toxicity difference between two expressed
Cry1Ie was not resulted from shape, solubility and stability, but incorrect folding of Cry1Ie polypeptides expressed under strong promoter T7.
Key words: Promoter of cry1Ac gene P1Ac T7 promoter E. coli Cry1Ie protein Expression
识产权的新基因［4，5］，对小菜蛾、亚洲玉米螟等具
有高毒力，应用前景良好。但该基因因缺少形成晶
体所需的 C-末端，无法在 Bt 中形成晶体，但是其可
在大肠杆菌中正常表达［6，7］。本实验室正在开展该
基因的杀虫机制、单克隆抗体制备等相关研究。
研究发现基于 T7 启动子商业化表达载体表达的
Cry 蛋白往往形成不易溶解的包涵体，不利于进一步
2012年第11期 193张春鸽等 ：不同启动子表达 Cry1Ie 蛋白的特性分析
的功能研究与生化分析［8，9］。马君兰等［10］研究表明，
利用 cry1Ac 基因的启动子（P1Ac）可以在大肠杆菌
中表达 Cry 蛋白，表达产物具有与来源于 Bt 的蛋白
具有相似的性质。
本研究利用 P1Ac 在大肠杆菌中表达了 Cry1Ie
蛋白，并将其与利用 T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白
进行了功能及生化特性比较。发现苏云金芽胞杆菌
强启动子 P1Ac 与 T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白对鳞
翅目害虫小菜蛾幼虫的杀虫活性有较大差别。并从
形态学、碱溶性及胰蛋白酶敏感性等几个方面对其
杀虫活性差异的原因进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 详见表 1。
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特征 来源
Escherichia coli
Rosetta（DE3） F-ompT hsdSB（RB
- mB
-）gal dcm λ（DE3［lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5］），pLysSRARE（CamR） 本实验室
JM109 RecA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17（rK-mK+），e14-（mcrA-），supE44，relA1，Δ（lac-proAB）/ F’［traD36，
proAB+，lacIq，lacZΔM15
本实验室
pMD19-T Vector AmpR，multiple cloning site，lacZ operon TaKaRa
pEB AmpR，lacZ operon，T7 promoter，multiple cloning site ［11］
pEB-cry1Ie AmpR，pEB containing cry1Ie gene 本研究
pBlue-p1Ac-cry1Ie AmpR lacZ operon，T7 promoter containing cry1Ie gene 本研究
1.1.2 培养基 LB 液体培养基：1.0% 胰蛋白胨，0.5%
酵母提取物，1.0% NaCl，调 pH 至 7.0，15 磅灭菌
20 min ；2×LB 液体培养基 ：2.0% 胰蛋白胨，1.0%
酵母提取物，2.0% NaCl，调 pH 至 7.0，15 磅灭菌
20 min ；固体 LB ：在 LB 液体培养基中加入 1.3% 琼
脂粉，调 pH 至 7.0，15 磅灭菌 20 min。
1.1.3 抗生素 氨苄青霉素、卡那霉素，配制成 100
mg/mL 水溶液，用一次性滤器过滤除菌，置于 -20℃
保存。氯霉素用无水乙醇溶解，配制成 34 mg/mL 溶
液，置于 -20℃保存。
1.1.4 SDS-PAGE 试剂及 Western blot 缓冲液 参照
分子克隆手册［12］。
1.1.5 Western blot 试剂 尼龙膜（NylonM）购自美
国 Millipore 公司；NBT+BCIP 购自美国 Bio-Rad 公司；
二抗购自康为试剂公司。
1.1.6 生化试剂 丙烯酰胺、N，N-亚甲基双烯酰
胺、过硫酸胺、Tris 购于美国 Ameresco 公司。DNA
回收试剂盒、二硫代苏糖醇（DTT）和考马斯亮蓝
R250 购于美国 Axygen 公司。胰蛋白酶（trypsin）购
于 Sigma 公司。
1.1.7 供试昆虫 小菜蛾二龄幼虫，由本实验室提
供的标准化试虫。
1.2 方法
1.2.1 蛋白的表达 pBlue1Ac-JM109 菌株的培养 ：
在固体 LB 培养基上划线培养菌株，挑单菌落于 2 ×
LB 液体培养基，220 r/min 30℃培养 24 h 后，收集
菌体。pEB-T7-Rossetta 菌株的培养 ：在固体 LB 培
养基上划线培养菌株，挑单菌落于 5 mL 液体培养基
中活化菌株，按 1% 接菌量转接于液体 LB 培养基中，
220 r/min 37℃培养，当 OD600=0.5 左右，用 12 μg/mL
IPTG 诱导，30℃培养过夜，收集菌体。
1.2.2 Cry1Ie 蛋白提取 将收集的菌体用 20 mmol/L
Tris-HCl（pH8.0）悬浮后，超声波破碎。12 000 r/min
离心 10 min，用 2.0% Triton 洗一遍不溶物去掉膜蛋
白。12 000 r/min 离心 10 min，水洗一遍不溶物，用
20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）悬浮。
1.2.3 Cry1Ie 蛋 白 生 物 活 性 测 定 小 菜 蛾 选 用 2
龄 幼 虫 ：采 用 人 工 饲 料 的 方 法， 人 工 饲 料 购 于
Southland Products Incorporated 公司，配制方法见产
品说明。称取饲料 10 g 与 1 mL 待测样品稀释液混匀，
平均分到 3 个无菌培养皿中。每个培养皿接 20 头，
25℃生化培养箱中保温，培养 48 h 后调查死、活虫数，
并观察幼虫取食情况。
1.2.4 电子扫描显微镜观察 扫描电镜制样 ：蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期194
包涵体悬浊液均匀涂于盖玻片上，干燥，离子溅射
喷金（2 nm）Hitachi S-4800 扫描电镜观察拍照。
1.2.5 Cry1Ie 蛋白溶解分析 在相同条件下，用 pH
10.5 的 50.0 mmol/L Na2CO3（ 含 有 2.0 mmol/L DTT）
溶解蛋白，37℃孵育 6 h，12 000 r/min 离心 15 min，
分别收集上清和沉淀，将沉淀悬浮于 20 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）中，这些样品用于 SDS-PAGE 分析。
1.2.6 胰蛋白酶活化 将可溶组份蛋白与胰蛋白酶
以 10 1（质量比）的比例混合，37℃温育，2 h 后取
样，SDS-PAGE 检测。
1.2.7 Western blot 分析 方法见分子克隆手册［12］。
2 结果
2.1 生物活性测定
两种不同启动子表达的蛋白对小菜蛾的杀虫活
性结果（表 2）表明，P1Ac 启动子表达的 Cry1Ie 蛋
白 LC50 为 1.73 μg/mL，T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白
LC50 为 18.18 μg/mL，后者是前者的 10.5 倍，说明前
者的杀虫活性远远高于后者。
表 2 两种不同启动子表达的 Cry1Ie 蛋白对小菜蛾的毒力测定结果
样品 试虫 半致死中浓度（μg/mL）LC50 95% 置信限
Cry1Ie（P1Ac） P. xylostella 1.73 0.89-2.90
Cry1Ie（PT7） P. xylostella 18.18 11.38-31.61
2.2 扫描电子显微镜观察
两种不同启动子表达的蛋白包涵体均有相对较
为规则的颗粒存在，二者无显著差异（图 1）。
A B
图 1 两种启动子表达的蛋白扫描电镜观察结果
A: Cry1Ie-1Ac 启动子 ；B: Cry1Ie-T7 启动子
2.3 蛋白溶解性比较
两种不同启动子表达的蛋白碱溶性没有显著差
异，均有约 20.0% 的包涵体能溶解于 50.0 mmol/L
Na2CO3（2.0 mmol/L DTT）pH10.5 的溶液。结果见图
2-B（斜线部分）。
2.4 胰蛋白酶活化及Western blot分析
两种不同启动子表达的 Cry1Ie 蛋白可溶组分经
过胰蛋白酶按 10 1 比例混合，37℃处理 2 h 后二者
消化结果条带略有不同（如图 3-A 中 1、2 样品），
但 Western blot 分析二者均无 50-60 kD 左右的蛋白
与抗体结合，均有30 kD左右的两条蛋白与抗体结合，
说明在蛋白与胰蛋白酶 10 1 比例、37℃ 2 h 反映条
图 2 两种不同启动子表达的蛋白碱溶性比较分析（A）及碱溶后不可溶组份比例（B）
A: M. Low protein marker ；1. Cry1Ie-T7 Promoter 碱溶前 ；2. Cry1Ie-T7 Promoter 碱溶后不可溶组份 ；3. Cry1Ie-T7 promoter 碱溶后可溶组份 ；4. Cry1Ie-
1Ac Promoter 碱溶前 ；5. Cry1Ie-1Ac Promoter 碱溶后不可溶组份 ；6. Cry1Ie-1Ac Promoter 碱溶后可溶组份 ；B: 1. Cry1Ie-T7 Promoter ；2. Cry1Ie-1Ac
Promoter
14
21
31
45
66
97
kD
M 1 2 3 4 5 6
A
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
1 2
B
нⓦ㓴ԭਟⓦ㓴ԭ
2012年第11期 195张春鸽等 ：不同启动子表达 Cry1Ie 蛋白的特性分析
件下两种不同启动子表达的 Cry1Ie 蛋白均被过度消
化，在抗胰蛋白酶稳定上没有明显差异。
的折叠，而 P1Ac 启动子在大肠杆菌受到与 Bt 类似
的 σ 因子帮助，转录时期和强度比较适合 Cry1Ie 蛋
白正确折叠，可能是二者杀虫活性差异的原因。
Bt Cry 蛋白在其作用过程中，进入昆虫体内 Cry
蛋白毒素在中肠碱性环境中被消化成有效活性毒
素［15，16］，本研究从碱溶性分析二者活性差异的原因，
但结果显示二者在碱溶性方面没有明显差异，说明
碱溶性不是二者活性差异的原因。
活性差异也可能是由于二者抗胰蛋白酶稳定性
不同，所以本研究比较胰蛋白酶消化结合 Western
blot，发现蛋白与胰蛋白酶 10 1，37℃处理 2 h 没有
产生约 55 kD 大小的核心区蛋白片段［7］，只产生 30
kD 左右小片段，说明两种不同启动子表达的 Cry1Ie
蛋白在这种处理条件下均消化过度。在以后的研究
中，需要采用昆虫中肠消化液来检验这两种表达蛋
白的稳定性。
4 结论
本研究比较了两种不同启动子表达的 Cry1Ie 蛋
白对小菜蛾的杀虫活性，结果显示，P1Ac 启动子表
达的 Cry1Ie 蛋白对小菜蛾的杀虫活性是 T7 启动子
的 10.5 倍。通过进一步的比较研究，结果表明两者
在形态、碱溶性、抗胰蛋白酶的稳定性方面均无显
著差异，由此推测二者活性差异的原因与蛋白的正
确折叠有关。
参 考 文 献
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kD
1 2 M 3 4
1 2 M 3 4
kD
81
100
75
50
37
25
20
15
10
A
B
1. Cry1Ie-1Ac Promoter 胰蛋白酶活化 ；2. Cry1Ie-T7 Promoter 胰蛋白酶
活化 ；3. Cry1Ie-1Ac Promoter 可溶组份 ；4. Cry1Ie-T7 Promoter 可溶组
份 ；M. 蛋白质 Marker
图 3 碱溶后胰蛋白酶活化蛋白（A）及活化后
Western blot 分析（B）
3 讨论
T7 启动子属于组成型强启动子，被 T7 RNA 聚
合酶识别后起始的转录活性非常强［13］，因此 T7 启
动子的商品化表达载体被广泛运用于蛋白的异源表
达。但是 T7 启动子表达的蛋白往往因缺乏某些蛋白
折叠的辅助因子或者表达量过高等原因而不能正确
折叠，形成不易溶解的包涵体［8-10，14］。苏云金芽胞
杆菌 cry1Ac 基因的启动子（P1Ac）是由 σE、σK 因
子指导的启动子，研究表明，大肠杆菌的 σ 因子可
以与启动子 P1Ac 结合，实现 P1Ac 能够驱动 cry1Ac
基因在大肠杆菌中表达［10］。本研究发现，Bt 启动子
P1Ac 较 T7 启动子所表达的 Cry1Ie 蛋白对小菜蛾幼
虫的活性高 10 倍以上。依据两种启动子的特点，推
测 T7 启动子表达的 Cry1Ie 蛋白由于启动子功能很
强，导致表达量过高来不及折叠，从而形成不正确
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第11期196
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（责任编辑 马鑫）