全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子 p1Ac指导
Cry1Ac蛋白表达的特性分析
马君兰 1, 2 束长龙2 刘东明 1, 2 张杰 2 宋福平 2 黄大昉 3
( 1东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030; 2中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室,
北京 100193; 3中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 对利用苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis, B t)强启动子 cry1Ac基因启动子 p1Ac指导 cry基因在大肠
杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子 p1Ac指导表达的 Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的 C ry1A c
蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达 cry基因时形成不
易溶解的包涵体问题。同时, 还对 p1Ac指导的 cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。
关键词: cry1Ac基因启动子 p1A c 大肠杆菌 Cry1Ac蛋白 表达 发酵条件
The Nature Analysis of Expressed Cry1Ac Protein Initiated by Strong
Promoter p1Ac from Bacillus thuringensis inEcoli
M a Junlan
1, 2 Shu Chang long2 L iu Dongm ing1, 2 Zhang Jie2 Song Fuping2 Huang Dafang3
(
1
College of L ife Sciences, N ortheast Agricultural University,H arb in 150030;
2
StateK ey Laboratory forB iology of
PlantD iseases and Insect Pests, Institute of P lantProtection, Chinese A cademy of Agricultural Sciences,
Beijing 100193;
3
B io technology Research Institute, Chinese A cademy of A gricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstrac:t Th is study w as on the expression o f Cry1Ac prote in in E coli in itia ted by the promo ter o f cry1Ac gene( p1Ac) from Ba
cillus thur ing iensis ( B t) The resu lts show ed that there are som e sim ilarities betw een Cry1Ac prote in initiated by prom o ter p1Ac inEco
li and C ry1Ac prote in from B t on alka li so luble na ture, trypsin activated nature and tox ic ity. Th is m ethod so lved the problem tha t com
m ercia l expression vectors for cry gene expression a re susceptib le to fo rm inso luble inclusion bodies. M eanwh ile, we ana lyzed the fe r
m enta tion cond ition that C ry1A c expression in itia ted by p1Ac.
Key words: P romo ter o f cry1Ac gene p1Ac E coli Cry1Ac pro te in Expression Ferm enta tion cond ition
收稿日期: 20101020
基金项目: 973计划项目 ( 2009CB 118902)
作者简介:马君兰,女,博士研究生,研究方向:农业微生物; Em ai:l xiuq ingzh ang@ cau edu cn
通讯作者:黄大昉,研究员,博士生导师,研究方向:农业微生物与植物基因工程; Em ai:l dfhuang@ ippcaas cn
苏云金芽胞杆菌 ( Bacillu s thuring ien sis, B t)
是广泛存在于土壤中的一类特殊革兰氏阳性细
菌, 伴随芽胞形成产生对昆虫具有特异毒性的杀
虫晶体蛋白 ( insect ic ida l crysta l p rote in s, ICP s) ,
并且其对人畜无害, 因此在生物防治中得到了广泛
的应用 [ 1, 2 ]。目前在大肠杆菌中表达 C ry蛋白经
常使用含有 T7等启动子的商品化表达载体 [ 3, 4] ,
但是由这些启动子指导表达的 C ry蛋白往往缺
乏某些蛋白折叠的辅助因子、表达量过高或者
是所处的环境不适等原因而不能正确折叠, 形成
不易溶解的包涵体 [ 5, 6]。 Schnepf等 [ 7]研究了苏云
金芽胞杆菌 cry1A c基因的启动子 ( p1A c) , 研究表
明, 大肠杆菌的 因子可以与启动子 p1A c结合 ,
并且 p1A c能够指导 cry1A c基因在大肠杆菌中表
达。但是, Schnep f工作没有涉及对启动子 p1A c
利用。
本研究通过对 p1Ac指导 cry1Ac基因在大肠杆
菌中表达的 C ry1A c蛋白性质与活性分析、发酵条件
2011年第 2期 马君兰等:大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子 p1Ac指导 Cry1Ac蛋白表达的特性分析
筛选等研究,旨在探索利用苏云金芽胞杆菌 cry1A c
基因的启动子表达 Cry蛋白的方法,解决通常 cry基
因在大肠杆菌中表达易形成不易溶解的包涵体蛋白
的问题,为苏云金芽胞杆菌 C ry蛋白优质高效表达
提供了新方法。
1 材料与方法
11 材料
111 菌株和质粒 所用菌株和质粒见表 1。
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特征 来源
B thuring iensis
HD73 W ild B tsub spkurstaki stra in con tain ing cry1A c gen e 本实验室
E sch erichia coli
JM 109 R ecA 1 supE 44 endA 1 hsdR 17 gyrA 96RELa1 thi ( lacproAB )F [ traD36proAB + la cIq lacZM 15] 本实验室
pB lue1A cJM109 JM 109 contain ing pB lu escriptcry1Ac p lasm id and cry1A c promoter vector 本研究
pEB1AcRossetta Rossetta contain ingpEB cry1Ac p lasm id 本实验室
pB luescript LacZ, Am pr, ori ( pBR322) T aKaRa
pB luescriptcry1A c pB luescript carrying cry1Ac gene in itiated by cry1Ac p rom oter 本研究
pEBCry1Ac pEB vector carrying cry1A c gene in itiated by T7 本实验室
112 培养基 LB培养基: 1%胰蛋白胨, 05%酵
母提取物, 10% N aC ;l 2 LB培养基: 2%胰蛋白
胨, 1%酵母提取物, 20% NaC;l牛肉膏蛋白胨培养
基: 05%蛋白胨, 03%牛肉膏, pH70。
113 生化试剂 限制性内切酶,连接试剂盒购于
TaKaRa公司。DNA回收试剂盒购于美国 Axygen公
司。丙烯酰胺、N, N 亚甲基双烯酰胺、过硫酸胺、
Tris、巯基乙醇购于 Ameresco。胰蛋白酶 ( trypsin)
购于 S igma公司
PrimerSTAR高保真 DNA聚合酶 (购于 TaKa
R a)、二硫代苏糖醇 ( DTT )和考马斯亮蓝 R250购
于 Sigma公司。其他试剂均为国产分析纯和生化
试剂。
114 供试昆虫 小菜蛾由本实验室人工饲养。
12 方法
121 pB luescriptcry1Ac载体的构建 根据 B th
uringiensis subspkurstakiHD73 cry1A c基因序列设
计了 cry1Ac基因全长扩增引物 (含 C ry1A c启动子 )
正向引物: 1AcF: 5GCAGGTAAATGGTTCTAACAT
GTATAAGTGT3, 反向引物: 1A cR: 5TTCCTCCA
TAAGGAGTAATTCC3。
以 HD73基因组 DNA为模板, 利用 Prim er
STAR HS DNA po lymerase( TaK aRa)高保真 DNA聚
合酶进行 PCR扩增。 PCR程序: 94 5 m in; 94
1m in, 50 1 m in, 72 4 m in, 30 cycles; 72
10m in。回收 PCR 产物, 连接 Sma I消化后的
pB luescript载体, 将其转化大肠杆菌 JM 109。用引
物 1A cF和 1A cR鉴定阳性克隆。 cry1A c基因的测
序工作由中国农科院农作物基因资源与基因改良国
家重大科学工程开放实验室测定完成。DNA序列
的分析采用 In formax2003 V ectorNTI Su ite9软件。
122 Cry1Ac蛋白的表达 B t菌株的培养:用牛肉
膏蛋白胨培养基, 30 培养 24 h左右至菌体裂解后,
收集菌体。 pB lue1AcJM 109菌株的培养: 用 2 LB
培养基, 30 培养 24 h后,收集菌体。 pEB1A cRos
setta菌株的培养: 在 LB培养基中, 37 培养, 当
OD600 = 05左右, 用 1 mo l/L IPTG诱导, 20 培养
过夜,收集菌体。
123 不同来源 C ry1A c蛋白的提取 将收集的菌
体用 20mmo l/L TrisHC l( pH 80)悬浮后,超声波破
碎。 12 000 r /m in离心 15 m in,用 2% T riton洗 1遍
不溶物去掉膜蛋白。 12 000 r/m in离心 15 m in, 水
洗 1遍不溶物, 用水悬浮。 SDSPAGE检测蛋白的
表达情况。
124 Cry1Ac蛋白溶解性和酶解性分析 在相同
条件下, 用 pH105 50 mmol /L N a2 CO3 ( 3% 巯基
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
乙醇, 2 mmo l/L DTT )溶解蛋白, 37 孵育 1 h,
12 000 r /m in离心 15 m in, 吸取上清,并用与上清同
样体积的水悬浮不溶物。 SDSPAGE检测可溶组分
以及不可溶组分。
125 C ry1A c蛋白生物活性的测定 将新鲜的甘
蓝菜叶浸入蛋白样品, 20 s, 自然晾干, 接入待测幼
虫,放入人工气象器中, 96 h调查结果,计算致死中
浓度 ( LC50 ) , Tukey法比较显著性。
126 启动子 p1A c指导 cry1A c基因在 E coli中
表达条件的优化 通过设计正交试验, 确定 p1A c
指导 C ry1A c表达的发酵的时间,温度和装液量。用
B ioRad凝胶呈像的 Quantityone软件分析 C ry1A c
蛋白表达量与总蛋白表达量,计算 C ry1A c蛋白相对
于总蛋白的含量。
2 结果和分析
21 cry1A c基因启动子 p1A c指导 C ry1A c毒素在
大肠杆菌中的表达
B tHD73菌株在牛肉膏蛋白胨中 30 培养 24
h,至菌体裂解。 pB lue1A cJM 109在 2 LB中 30
培养 24 h。 pEB1AcRossetta在 LB培养基中 37 培
养至 OD值为 05, IPTG低温 ( 20 )诱导过夜。将
这 3个菌株培养后的菌体离心, 20 mmo l /L TrisHC l
( pH80)悬浮,超声波破碎。 12 000 r /m in,离心 15
m in,用水悬浮沉淀 SDSPAGE检测。分析结果 (图
1)表明, cry1Ac基因的启动子 p1A c能够指导 cry1A c
在大肠杆菌中表达,其蛋白条带的大小与 Bt中表达
的 Cry1A c蛋白大小一致,为 130 kD (图 1, 2泳道 )。
M. H igh p roteinM ark er; 1. HD73表达的 Cry1Ac蛋白 (阳
性对照 ); 2. pB lu e1AcJM 109表达的 Cry1Ac蛋白; 3.阴
性对照 ( pB luescrip t转 JM109 ) ; 4. pEB1AcRossetta表
达; 5.阴性对照 ( pEB转 Rossetta)
图 1 启动子 p1Ac指导 Cry1Ac毒素在大肠杆菌中
表达的 SDSPAGE分析
22 不同来源 C ry1A c蛋白溶解性比较
用 50 mmol /L N a2 CO3 ( pH105 2 mmo l/L DTT
3% 巯基乙醇 )悬浮 HD73表达的 Cry1Ac蛋白以
及大肠杆菌 pB lue1A cJM 109、pEB1AcRossetta表达
的 C ry1A c蛋白, 37 孵育 1 h, 12 000 r/m in离心后,
吸取上清,并用与上清同样体积的灭菌水悬浮不溶
物。对其可溶性组分 (上清 )和不可溶性组分 (不溶
物 )进行 SDSPAGE分析,结果 (图 2)表明,由 T7启
动子指导表达的 C ry1A c蛋白很难溶于 50 mmo l/L
Na2CO3 ( pH105 2mmol /L DTT 3% 巯基乙醇 )溶
液中,其大部分还是以不可溶的组分存在。但是,以
p1Ac启动子指导表达的 Cry1A c蛋白与 B t中表达的
C ry1Ac蛋白一样, 大量溶解于 50 mmo l/L N a2CO3
( pH105 2 mmo l /L DTT 3% 巯基乙醇 )的溶液
中, 不可溶成分相对较少。
M. H igh proteinM arker; 1. HD73表达的 C ry1Ac蛋白 (阳性对照 ) ; 2. pB lue1A cJM109表达的 C ry1Ac蛋白; 3.阴性对照 ( pB lusecript
转 JM 109 ) ; 4. pEBAcRossetta表达; 5.阴性对照 ( pEB转 Rossetta)
图 2 不同来源 Cry1Ac蛋白溶解性比较
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2011年第 2期 马君兰等:大肠杆菌中利用苏云金芽胞杆菌强启动子 p1Ac指导 Cry1Ac蛋白表达的特性分析
23 胰蛋白酶活化不同来源 C ry1A c原毒素
用胰蛋白酶分别消化 HD73、pB lue1A cJM 109
表达 C ry1A c蛋白的可溶组分以及空载体蛋白 (来
自于 pB luescript转 JM 109菌株 )的可溶组分。 SDS
PAGE分析, 结果 (图 3 )表明, pB lue1A cJM 109
表达 Cry1A c蛋白与来源于 HD73的 C ry1A c蛋白
相似,可溶部分都可以被胰蛋白酶消化成 60 kD的
毒素。
M. H igh proteinM arker; 1. HD73表达的 C ry1A c蛋白 (阳
性对照 ) ; 2. pB lue1A cJM109表达的 C ry1Ac蛋白; 3.阴
性对照 ( pB lu secript转 JM109)
图 3 胰蛋白酶活化不同来源 Cry1Ac
24 不同来源 C ry1A c毒素的生物活性测定
对来源于 HD73 C ry1A c蛋白以及启动子 p1A c
指导表达的 C ry1A c蛋白进行生物活性测定,结果表
明 HD73所表达的蛋白对小菜蛾的活性为 LC50均
值为 1911 g /mL, 置信区间为 0913 - 2907;
pB lue1AcJM 109所表达的蛋白对小菜蛾的活性
LC50为 1527 g /mL, 置信区间为 0996 - 2058。
Tukey法比较二者显著性发现, 这两种蛋白无显著
性差异 ( 5%显著水平 )。
25 C ry1A c蛋白表达条件的优化
由于启动子 p1A c在大肠杆菌中指导表达的
C ry1A c蛋白溶解性好, 所以 p1Ac在大肠杆菌中指
导 Cry毒素表达的体系有良好应用前景。对表达条
件进行优化, 旨在提高 C ry1Ac蛋白的产量, 设计了
正交试验 (表 2)。根据发酵时间定时收集样品, 提
取蛋白,用 SDSPAGE检测 (图 4)。经分析表明, 温
度对 C ry1A c表达的影响很大, 与 20 和 30 的发
酵温度相比, 37 的发酵温度对 C ry1A c的表达最为
不利。另外,发酵时间对蛋白表达量也有一定的影
响, 可以增加目标蛋白的积累,加大装瓶量控制通气
条件也有利于提高目标蛋白的表达量。 9个发酵条
件中, 30 的发酵温度, 48 h发酵时间,发酵液与装
瓶的体积比 ( V /V )为 4 /5时 (表 3)最适合目标蛋白
的表达,相对蛋白含量为 732%。
表 2 正交试验设计
序号 发酵时间
( h)
发酵温度
( )
装液量 /瓶子的
体积比 ( V /V )
24 20 1 /5
48 20 2 /5
72 20 4 /5
24 30 2 /5
48 30 4 /5
72 30 1 /5
24 37 4 /5
48 37 1 /5
72 37 2 /5
M. H igh proteinM arker; 1- 6.分别对应正交试验 - 号设计; 7.阴性对照 ( pB lu escript转 JM 109) ; 8, 9. B t中提取的 C ry1Ac蛋白;
10- 12.分别对应正交试验 - 号设计; 13.阴性对照 ( pB luescrip t转 JM 109)
图 4 发酵条件对启动子 p1Ac指导的 Cry1Ac毒素蛋白表达量的影响
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
表 3 不同发酵条件下启动子 p1A c指导的
Cry1A c毒素蛋白表达的相对含量
发酵条件 蛋白相对含量 (% )
278
263
340
667
732
369
143
224
191
3 讨论
应用 cry1Ac基因启动子所表达的 C ry1A c蛋白
与 T7启动子指导的 Cry1Ac蛋白的可溶性有很大差
别,可能由于 cry1A c基因指导蛋白的表达调控机制
与 T7启动子指导蛋白的表达调控机制不一样所造
成的。T7噬菌体启动子属于组成型的强启动子,被
T7 RNAP(约 100 kD的单链蛋白质 )识别后起始的
转录非常活跃, 并几乎能完整的转录其下游所有
DNA序列 [ 8 ]。在苏云金芽胞杆菌中, cry1Ac基因的
启动子是由 E、K等因子调控, 在芽孢开始形成时
表达, 具有时间上的特异性 [ 9 ]。由于大肠杆菌与苏
云金芽胞杆菌中的 因子有较高的相似性 [ 10] , 在大
肠杆菌中,启动子 p1A c指导 cry1Ac基因表达与苏
云金芽胞杆菌中在调控上有较好的一致性。因此,
大肠杆菌中 p1A c表达的 Cry1Ac蛋白的表达与折叠
以及性质都与 B t相似。本研究展示了利用启动子
p1Ac在大肠杆菌中表达与苏云金芽胞杆菌来源相
似的 C ry蛋白, 进一步可以利用 cry基因启动子构建
一系列表达载体, 用于 C ry蛋白快速高效表达。本
研究还探索了大肠杆菌中 p1Ac指导 cry1Ac基因表
达的特点, 优化了其表达的条件。研究表明,温度、
通气量、发酵时间对蛋白表达均有较大影响。 30
培养条件下通过加大装瓶量、控制通气条件更有利
于抑制本底蛋白表达以提高目标蛋白的表达量。另
外, 发酵时间对蛋白表达量和目标蛋白的积累也有
一定影响。研究结果为快速优质表达 C ry蛋白提供
了新的方法, 为新型 cry基因表达与功能验证、C ry
蛋白杀虫机理等研究的进一步开展创造了有利
条件。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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