全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2012-01-10
基金项目 : 重庆市科技攻关项目 (CSTC,2010AA1023)
作者简介 : 沈进娟 , 女 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向 : 榨菜遗传育种与生物技术 ; E-mail: jinjuanshen@126.com
茎瘤芥（榨菜）高效离体再生体系的建立
沈进娟 范永红 冷容 李娟 冉广葵
（重庆市涪陵区农业科学研究所 南方芥菜品种改良与栽培技术国家地方联合工程实验室
榨菜品种改良栽培技术重庆市工程实验室，涪陵 408000）
摘 要： 利用离体培养技术，以榨菜的 3个主栽品种的子叶、带柄子叶和下胚轴为外植体，对影响榨菜植株再生的关键因
素进行了优化。结果表明，培养 25 d不定芽的分化率最高；最佳不定芽诱导的激素组合为 6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L，其中带柄
子叶不定芽的分化率达 94.4%；“蔺市草腰子”和“郫县榨菜”容易诱导不定芽，而“永安小叶”不容易被诱导，说明基因型的影
响比较大；不定根的最佳诱导激素为 NAA 0.2 mg/L，其生根率为 83.4%。榨菜高效离体再生体系的成功建立，为榨菜遗传转化、
突变体筛选和种质资源保存打下了基础。
关键词： 离体培养 榨菜 外植体 诱导 高效再生体系
Establishment of High-frequency in vitro Regeneration
System in Tuber Mustard
Shen Jinjuan Fan Yonghong Leng Rong Li Juan Ran Guangkui
（Fuling Agricultural Science Institute of Chongqing，National & Local United Engineering Laboratory of South Mustard Varietal
Improvement and Cultivation Techniques，Chongqing Engineering Laboratory of Tuber Mustard Varietal Improvement and
Cultivation Techniques，Fuling 408000）
Abstract: The key factors that affected tuber mustard（Brassica juncea var. tumida Tsen & Lee）plant regeneration were optimized
by in vitro culture technology, with the cotyledons, cotyledons with petiole, and hypocotyls of three main cultivated varieties of tuber mustard as
explants. The results showed that, the differentiation rate of adventitious buds was the highest when explants were cultivated for 25 days. A fairly
high shoot differentiation rate（94.4%）was obtained when cotyledons with petiole were cultivated on the phytohormone combination of 6-BA 2
mg/L + NAA 0.2 mg/L, which was optimized for shoot induction. The frequency of shoot regeneration was significantly affected by the genotype,
for example, multiple shoots were easily induced in “Lin-shi Cao-yao-zi” and “Pi-xian Zha-cai” but hardly induced in “Yong-an Xiao-ye”. The
appropriate phytohormone combination for adventitious root differentiation was NAA 0.2 mg/L, with the rooting rate reaching 83.4%. The study
had successfully established a highly-efficient in vitro regeneration system in tuber mustard, which laid the foundation for genetic transformation,
mutant screening and germplasm resources conservation of mustard tuber.
Key words: In vitro culture Tuber mustard Explants Induced High-frequency regeneration system
茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen & Lee）
是十字花科芸薹属的一类蔬菜，是重庆市特色农业
资源“榨菜”的原料作物，在三峡库区农业和农村
经济发展中占有极其重要的地位。虽然榨菜育种工
作者目前已经培育出几个丰产、品质和抗性较好的
榨菜新品种并在生产上应用，但是随着榨菜生产和
加工规模的逐步扩大，对榨菜的品质、抗性和产量
都有了更高的要求。目前榨菜品种改良主要采用选
择育种等常规育种法，育种周期长，且在改良一些
不良性状方面（如先期抽薹、茎瘤空心、发病多等），
有一定的局限性。离体培养作为一种重要手段，可
以通过遗传转化、体细胞无性系变异、突变体筛选
等途径进行榨菜品种改良，然而建立高效再生体系
且不定芽的再生率达到 80% 以上［1］是离体培养的关
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期72
键步骤。目前对芸薹属作物中的白菜［2-4］、甘蓝［5, 6］、
油菜［7］和青花菜［8, 9］等植株再生体系方面有很多的
相关报道，榨菜起源于中国，有关榨菜再生体系的
研究报道，国外研究较少［10］，国内主要集中于浙江
当地主栽榨菜品种［1, 11, 12］，但作为榨菜最大主产区
的西南地区研究较少。许多研究表明，不同基因型、
不同品种的植物其再生频率有显著的差异［13, 14］，而
且材料的基因型是决定体细胞变异类型及频率的重
要因素［15］，不同品种变异率［16, 17］差异比较大。本
研究以西南地区 3 个常规榨菜主栽品种的子叶、下
胚轴和带柄子叶为外植体，对影响榨菜植株再生的
关键因素进行优化，并建立一个高效的离体再生体
系，对榨菜的遗传转化、突变体筛选、品种改良以
及种质资源的保存等研究具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
榨菜品种 ：郫县榨菜、永安小叶和蔺市草腰子，
为目前生产上的榨菜主栽品种，均由重庆市涪陵区
农业科学研究所提供。
基本培养基 ：MS 培养基和 B5 培养基［18］（不含
蔗糖）；无菌苗培养基：MS + 琼脂粉 8.0 g/L ；分化培
养基 ：MS/B5 + 蔗糖 30 g/L + 琼脂粉 8.0 g/L+ AgNO3
5 mg/L+ 6-BA/NAA/2，4-D ；伸长培养基 ：MS/B5 + 蔗
糖 30 g/L + 琼脂粉 8.0 g/L + AgNO3 5 mg/L ；生根培养
基 ：MS/B5 + 蔗糖 30 g/L + 琼脂粉 8.0 g/L + NAA ；培
养基 pH 值调到 5.8-6.0，易高温分解的 AgNO3（使
其终浓度为 5 mg/L）过滤灭菌后待培养基温度降至
60℃以下时加入。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的培养 挑选当年生饱满的榨菜种子，
在超净工作台内，先用 70% 酒精表面杀菌 30 s，再
用 5% 的次氯酸钠溶液振荡灭菌 10-15 min，最后
用无菌水冲洗 4-5 次，将灭菌后的种子接种到无菌
苗培养基上，25℃光照培养箱内培养，光照时间 ：
16 h/8 h（昼 / 夜），光强为 3 000 lx（下同）。
1.2.2 不定芽的分化 取培养 4-5 d 的榨菜无菌苗，
在超净工作台内用手术刀片切下带子叶柄的子叶（以
下简称 ：带柄子叶）、只有子叶块无子叶柄（以下
简称 ：子叶）及其下胚轴等 3 种外植体，分别接种
于分化培养基上培养诱导不定芽分化，分化培养基
中添加的激素及其浓度为 6-BA 2 mg/L+NAA 0、0.2、
0.4、1.0 mg/L ；6-BA 2 mg/L +2， 4-D 0.2、0.4 mg/L ；
6-BA 2 mg/L +NAA 0.2、0.4 mg/L +2，4-D 0.2 mg/L。
每瓶接种 10 个外植体，3 个重复，培养 10 d 和 20 d
后调查分化情况，之后每隔 5 d 调查一次，观察统
计不定芽的分化率。
1.2.3 不定根的诱导 培养 25 d后继代培养1-2次，
将继代后的不定芽接种到伸长培养基上进行壮苗培
养 1 周左右，再接种到生根培养基中培养，添加激
素浓度 NAA 0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L，3-4 周后观察
统计不定芽的生根率。
2 结果
2.1 培养时间对不定芽的诱导效果
组织培养时间很关键的，试验结果（表 1）表明，
蔺市草腰子培养 25 d 得到的不定芽再生率最高，子
叶的不定芽再生率为 72.2%，带柄子叶的不定芽再
生率为 94.4%，下胚轴的不定芽再生率为 25.0%（图
1），培养时间不能过长，否则不定芽由于营养不足
生长缓慢甚至死亡，最终影响植株的再生。
表 1 培养时间对分化培养基中蔺市草腰子不定
芽分化率的影响
培养时间（d）
不定芽分化率（%）
子叶 带柄子叶 下胚轴
10 - - 5.3
20 25.0 85.0 20.0
25 72.2 94.4 25.0
分化培养基为 MS 培养基中添加 6-BA 2 mg/L+NAA 0.2 mg/L ； -. 愈伤组织
A. 培养 10 d 的愈伤组织 ；B. 培养 20 d 的不定芽 ；C. 培养 25 d 的不定芽
图 1 培养时间对分化培养基中蔺市草腰子
不定芽分化的影响
2.2 激素类型及浓度配比对不定芽的诱导效果
从表 2 中看出，蔺市草腰子在 MS 培养基中
NAA 浓度为 0.2 mg/L 时生长得最好，带柄子叶的分
2012年第5期 73沈进娟等 ：茎瘤芥（榨菜）高效离体再生体系的建立
化率最高，而子叶和下胚轴在 NAA 浓度为 0.4 mg/L
时分化率最高，当 NAA 浓度高于 0.4 mg/L 时不定
芽的生长被抑制。2， 4-D 对不定芽的分化率也有一
定的促进作用，但明显没有 NAA 的效果好，分化
率都比 NAA 低。当两者混合使用时，对分化率的
影响不明显。如上分析，选择激素配比为 6-BA 2
mg/L+NAA 0.2 mg/L 时外植体的分化效果最佳。
有诱导出不定芽，而在 B5 分化培养基中不定芽分化
率达 65.0%；蔺市草腰子的最佳培养基是 MS 培养基；
郫县榨菜在两种分化培养基中差异不明显，其外植
体不定芽的分化率均能达到 80% 以上。
表 2 蔺市草腰子在MS培养基中添加不同激素
不定芽的分化率（%）
激素配比（mg/L） 不定芽分化率（%）
NAA 2， 4-D 6-BA 子叶 带柄子叶 下胚轴
0 0 2 40.0 0 5.0
0.2 0 2 72.2 94.4 25.0
0.4 0 2 75.0 63.2 45.0
1.0 0 2 21.1 30.0 25.0
0 0.2 2 10.0 10.0 30.0
0 0.4 2 0 10.0 30.0
0.2 0.2 2 10.0 15.0 15.0
0.4 0.2 2 0 15.0 5.0
2.3 基因型在不同培养基中对不定芽的诱导效果
培养基是决定组织培养成败的重要因子。在上
述试验的基础上，选用 B5 和 MS 培养基为分化培
养基并添加最佳激素组合（6-BA 2 mg/L+NAA 0.2
mg/L），以 3 个不同基因型的榨菜品种为材料，探讨
不同基因型在不同培养基中诱导不定芽分化的差异
（表 3）。以 B5 培养基为分化培养基时，不同榨菜品
种之间外植体不定芽的分化率差异不大，但是同一
榨菜品种不同外植体不定芽的分化率差异比较明显，
以子叶为外植体不定芽的分化率最高，带柄子叶次
之，而下胚轴最不容易被诱导分化。以 MS 培养基
为分化培养基时，不同榨菜品种之间外植体不定芽
的分化率差异明显，“蔺市草腰子”和“郫县榨菜”
容易诱导不定芽，其中“蔺市草腰子”的带柄子叶
不定芽分化率达到 94.4%，“郫县榨菜”的子叶不定
芽分化率达到 80.0%，而“永安小叶”不容易被诱导，
其外植体的分化率均比较低，说明基因型的影响比
较大。
同一基因型的外植体在不同的分化培养基中培
养其不定芽分化率也有明显差异，其中差异最明显
的是“永安小叶”，其外植体在 MS 分化培养基中没
表 3 不同基因型的榨菜品种在不同培养基中
不定芽的分化率（%）
基因型
B5 培养基 MS 培养基
子叶 带柄子叶 下胚轴 子叶 带柄子叶 下胚轴
永安小叶 65.0 35.0 36.7 0 33.3 10.0
蔺市草腰子 84.2 60.0 14.2 72.2 94.4 25.0
郫县榨菜 83.7 59.4 32.9 80.0 51.3 41.2
2.4 再生苗的不定根诱导
不定芽（图 2-A）在 B5+NAA 0.1、0.2、 0.5 、 1.0
mg/L 培养基中培养 3 周左右形成不定根，其中子叶
在 B5+NAA 0.2 mg/L 不定根诱导率最高，而且根系
粗壮，根毛较多，高达 83.4%（图 2-B）。随着 NAA
浓度的增加不定根的诱导率降低，且容易出现根发
黄发黑现象（图 2-C）；而在 B5+NAA 0.1 mg/L 培养
基上只有少数不定根，根毛也少。通过表 4 可以看
出子叶诱导的不定芽更容易诱导出不定根，下胚轴
则较难诱导出不定根。应用 MS 生根培养基中添加
NAA 得到结果一致，但其不定根生长缓慢，且不定
根的数量少。
表 4 不同外植体在不同生根培养基中
不定芽的生根率（%）
NAA（mg/L）
B5 培养基 MS 培养基
子叶 带柄子叶 下胚轴 子叶 带柄子叶 下胚轴
0.1 42.2 48.6 5.1 18.8 29.5 2.5
0.2 83.4 73.0 16.8 66.7 47.7 9.4
0.5 60.8 50.2 0 37.5 25.0 5.0
1.0 55.1 25.7 0 29.2 16.7 0
A. 不定芽（无不定根）；B. B5+NAA 0.2 mg/L ；C. B5+NAA 0.5 mg/L
图 2 不定根的生长情况
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期74
3 讨论
影响植物离体再生的因素很多，有关研究认为
确定适宜的外植体类型与培养基成分及其浓度最为
关键，直接决定着器官分化的模式和程度［8］。子
叶、带柄子叶和下胚轴是芸薹属作物离体培养常用
的外植体，本试验中，不同的外植体类型诱导不定
芽的分化差异较大，其中子叶和带柄子叶分化率都
较高，且带柄子叶分化率最高，这与青花菜和白菜
研究结果一致［3, 8］。下胚轴在不同分化培养基中不
定芽的分化率均偏低，可能是因为下胚轴太细小，
镊子夹取时容易将其夹坏，或者伤口太小不容易被
诱导。大部分芥菜再生植株体系的建立选用 MS 培
养基［1, 11, 12］，为获得不同基因型榨菜的高效离体再
生体系，本试验选用两种基本培养基（B5 和 MS 培
养基），结果表明，永安小叶更适宜在 B5 分化培养
基中被诱导，在 MS 分化培养基中较难获得不定芽，
其他两种榨菜品种在不同的培养基中差异不明显。
在分化培养基中添加适宜浓度的 6-BA 和 NAA 有利
于不定芽的分化，单独添加 2， 4-D，或者混合添加，
都不利于不定芽的诱导，而愈伤组织诱导率增加，
说明 2， 4-D 有利于愈伤组织的诱导，而不利于不定
芽的分化。
目前，芸薹属生根培养基常选用 MS 培养基［1, 8］，
而本试验证明，B5 培养基更利于不定根的生长，分
析原因可能是 B5 培养基含有较低的铵，而铵这一
营养成分可能对有些培养物有抑制生长的作用。在
生根培养基中，随着 NAA 浓度的升高，不定根的诱
导率升高，当达到 NAA 浓度为 0.2 mg/L 时最高，浓
度继续增大不定根的诱导率反而降低，而且容易出
现褐化现象，可能是因为 NAA 本身有毒性，适量
的 NAA 能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增
加，高浓度的 NAA 对培养物产生刺激作用和抑制作
用，不利于不定根的生长。试验过程中，添加适宜
的 AgNO3，比没有添加 AgNO3 更有利于不定芽的分
化。一般认为，AgNO3 的作用机制是 Ag+ 作为乙烯
活性抑制剂，竞争性作用于乙烯作用部位而促进器
官和体细胞胚胎发生 ；也有研究者认为 AgNO3 由于
Ag+ 存在，乙烯不能干扰多胺的合成，Ag+ 通过促进
多胺的合成提高器官和体细胞胚胎发生的频率［19］。
4 结论
本试验对影响榨菜植株再生的关键因素进行优
化，试验证明诱导分化时间不宜过久，最佳诱导时
间为 20-25 d ；分化培养基中添加激素的浓度 6-BA
为 2 mg/L，NAA 为 0.2-0.4 mg/L 时，不定芽分化率
最高。此外，添加 5 mg/L 的 AgNO3 有利于不定芽的
分化 ；不同基因型在不同的分化培养基中不定芽的
分化率差异明显，其中“蔺市草腰子”和“郫县榨菜”
在 MS 和 B5 分化培养基中均容易诱导不定芽，而“永
安小叶” 在 B5 分化培养基中易被诱导，在 MS 分化
培养基中却较难被诱导 ； B5 培养基中添加 0.2 mg/L
NAA 不定芽的生根率最高。本试验成功建立了不定
芽的分化率达 94.4%，不定根的诱导率达 83.4% 的
榨菜高效离体再生体系，为榨菜遗传转化、突变体
筛选、脱毒培养和种质资源保存等奠定了基础，为
榨菜品种改良和榨菜小孢子培养植株再生体系的建
立提供可靠的理论依据及技术支撑。
参 考 文 献
［1］ 陈石头 , 余小林 , 曹家树 , 等 . 榨菜子叶和带柄子叶再生植株的
研究 . 浙江农业学报 , 2005, 17（1）：27-30.
［2］ 张凤兰, 高田畑粦 , 徐家炳, 等 . 大白菜子叶离体培养再生植株.
园艺学报 , 2002, 29（4）：348-352.
［3］ 曹家树 , 余小林 . 提高白菜离体培养植株再生频率的影响 . 园
艺学报 , 2000, 27（6）：452-454.
［4］ 张松 , 魏毓棠 , 温孚江 , 等 . 利用乙烯抑制剂 AgNO3 建立大白
菜高频植株再生体系 . 园艺学报 , 1997, 24（1）：94-96.
［5］ 赵秀枢 , 李名扬 , 张文玲 , 等 . 观赏羽衣甘蓝高频再生体系的建
立 . 基因组学与应用生物学 , 2009, 28（1）：141-148.
［6］ 朱艳 , 张正英 , 陈玉梁 . 几种影响甘蓝再生分化体系的因素 .
植物生理学通讯 , 2004, 40（4）：452-452.
［7］ 李振岐 . 甘蓝型油菜花茎高效再生体系研究 . 中国农学通报 ,
2005, 21（6）：86-88.
［8］ 秦耀国, 雷建军, 曹必好, 等 . 青花菜高效离体再生体系的建立.
西南农业大学学报 ： 自然科学版 , 2005, 27（5）：653-656.
［9］ 李艳红 , 宋秀珍 , 庄木 , 等 . 青花菜组织培养再生体系的研究 .
首都师范大学学报 ： 自然科学版 , 2001, 22（3）：48-53.
［10］ Fazekas GA, Sedmach PA , Palmer MV. Genetic and environmental
effects on in vitro shoot regeneration from cotyledon explants of
Brassica juncea. Plant Cell, 1986, 6 ：177-180.
2012年第5期 75沈进娟等 ：茎瘤芥（榨菜）高效离体再生体系的建立
［11］ 曹必好 , 雷建军 , 宋洪元 , 等 . 榨菜继代培养愈伤组织及其再
生植株的变异性分析 . 核农学报 , 2007, 21（3）：237-241.
［12］ 曹必好 , 雷建军 , 宋洪元 , 等 . 芥菜农杆菌高效遗传转化体系
初步建立 . 华南农业大学学报 ： 自然科学版 , 2003, 24（4）：
48-51.
［13］ Zhang FL, Takahata Y, Xu JB. Medium and genetype factors
influencing shoot regeneration from cytoledonary explants of
Chinese cabbage（Brassica campestris ssp. pekinensis）. Plant Cell
Reports, 1998, 17 ：780-786.
［14］ Yuji O, Yoshihito T, Norihiko K. Effects of genotype on shoot
regeneration from cytoledonary explants of rapeseed（Brassica
napus L.）. Plant Cell Reports, 1994, 14 ：13-17.
［15］ Jain SM. Tissue culture-derived variation in crop improvement.
Euphytica, 2001, 118 ：153-166.
［16］ Al-zahim MA, Ford-Lloyd BV, Newbury HJ. Detection of somac-
lonal variation in garlic（Allium sativum L.）using RAPD and
cytological analysis. Plant Cell Reports, 1999, 18 ：473-477.
［17］ Devarumath RM, Nandy S, Rani V. RAPD, ISSR and RFLP
fingerprints as useful markers to evaluate genetic integrity of
micropropagated plants of three diploid and triploid elite tea clones
representing Camellia sinensis（Chia type）and C.assamica ssp.
Assamica（Assam-India type）. Plant Cell Reports, 2002, 21 ：
166-173.
［18］ 张献龙 , 唐克轩 . 植物生物技术［M］. 北京 ：科学出版杜 ,
2004, 24-25.
［19］ Mets TD, Dixit R, Earle ED, et al. Agrobacterium tumefaciens -
mediated trasformation ofbroccoli（Brassica oleracea var. italica）
and cabbage（B. oleracea var. capitata）. Plant Cell Reports, 1995,
15 ：287-292.
（责任编辑 李楠）