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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
以全氟辛烷磺酸盐（Perflourooctane，PFOS）为
代表的全氟化合物（PFcs），曾被作为无毒化合物
使用了 50 多年，使用范围涉及生产生活的诸多方
面［1-3］。PFOS 具有稳定的 C-F 结构，不易降解，具
有生物积累作用，能够通过食物链富集，从陆地到
海洋，从低等藻类到高等哺乳类和鸟类都能检测到
PFOS 的存在［4］。已知 PFOS 集中分布于肝脏、肾
脏、肺脏、血液等部位［5，6］，损害生物体的内脏器
官［5，7-9］，并对发育生殖过程具有毒害作用。毒性机
理和药代动力学研究显示，PFOS 能够对体外培养的
细胞造成氧化压力，破坏细胞膜，改变基因表达，损
收稿日期 ： 2014-02-12
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31100377），山东省自然科学基金资助项目（ZR2011CQ018）
作者简介 ：宫晓宁，男，硕士研究生，研究方向 ；毒理学 ；E-mail ：gongxiaoning321@163. com
通讯作者 ：袁佐清，女，博士，副教授，研究方向 ：毒理学 ；E-mail ：yuanzuoqing2008@126.com
PFOS 对东亚三角涡虫 HSP70 蛋白及基因表达的影响
宫晓宁  袁佐清  白芸
（山东理工大学生命科学学院，淄博 255049）
摘 要 ： 全 氟 辛 烷 磺 酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS） 是 一 种 持 续 的 有 机 污 染 物， 是 全 氟 化 合 物（Perfluorinated
chemicals，PFCs）在环境中的代表性物质。以低等三胚层动物涡虫作为试验材料，使用 Western blot 及 RT-PCR 技术探究 PFOS 对
涡虫 HSP70 蛋白及基因表达的影响。结果表明，PFOS 短时间处理能诱导涡虫 hsp70 mRNA 表达量升高，涡虫再生 10 d mRNA 表达
受到抑制，HSP70 蛋白表达量在涡虫再生 4 d 和 7 d 时随 PFOS 浓度显著上升，其它组变化不明显，PFOS 对 mRNA 和蛋白表达量
趋势影响不一致，可能少量 PFOS 能抑制 HSP70 蛋白翻译，药物在涡虫体内积累量增加，蛋白高表达抵御毒性伤害。
关键词 ： PFOS 三角涡虫 HSP70 RT-PCR Western blot
Effects of PFOS on Expression of HSP70 in Planarian Dugesia japonica
Gong Xiaoning Yuan Zuoqing Bai Yun
（School of Life Science，Shandong University of Technogy，Zibo 255049）
Abstract: Perfluorooctane sulfonate（PFOS）is a persistent organic pollutant and has been found to be the predominant perfluorinated
chemicals（PFCs）in the environment. In this study, we used planarians Dugesia japonica, which belong to the phylum Platyhelminthes, class
Turbellaria, as an animal assay to evaluate the toxicological effects of PFOS on protein and mRNA expression of HSP70. The results indicated
that the expression of hsp70 mRNA of planarians increased exposed to PFOS in short time and decreased when planarians regenerated of 10-
days. However, protein expression of HSP70 increased significantly after regenerating planarians exposed to PFOS for 4- and 7-days, and other
groups were not influenced significantly. The trend of mRNA expression were inconsistent with protern. It may be that little PFOS would inhibit
the translation of HSP70, and the number of HSP70 increased to protect from toxicity of PFOS as that was accumulated in planarians.
Key words: PFOS Planatian HSP70 RT-PCR Western blot
伤基因结构等［9-12］，但对其毒性作用原理仍不明确。
目前，对 PFcs 的研究多集中于小白鼠、鱼类
等脊椎动物，在无脊椎动物方面的研究仍很匮乏。
本试验以涡虫为对象，其作为低等扁形动物，对环
境变化十分敏感，并且具有强大的再生能力，是研
究再生与凋亡平衡的良好材料。涡虫暴露于高浓度
PFOS 中，产生一种外界环境压力，而 hsp70 正是一
种生物体应对外界压力的标志基因［13］。本研究通过
使用 Western blot 及 RT-PCR 技术检测 PFOS 诱导完
整涡虫和再生涡虫 HSP70 蛋白及基因表达的变化，
旨在初步探究 PFOS 对涡虫的毒性作用。
2014年第10期 157宫晓宁等：PFOS 对东亚三角涡虫HSP70 蛋白及基因表达的影响
1 材料与方法
1.1 材料
东亚三角涡虫采自博山泉河头的泉水中，22℃
凉 开 水 培 养， 试 验 前 饥 饿 7 d 处 理。PFOS 产 自
ALORICH 公 司，DMSO（Dimethyl Sulfoxide） 产 自
Klontech 公司。RNA 抽提液 Trizol 购自 Invitrogen 公司，
反转录酶、RNase 抑制剂、dNTP、Taq 酶等均购自
Thermo 公司，一抗和二抗分别为 Santa Cruz 生物技
术公司生产的 HSP70/HSC70（sc-33575）和 bovine-
rabbit IgG-HRP（sc-2370），Bioss 生 产 的 Anti-beta-
Actin（Loading Control）（bs-0061R）。DAB 显色液购
自天根公司。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR 用 涡 虫 的 处 理 PFOS 以 0.005% 的
DMSO 溶 液 溶 解， 配 置 为 0、0.5、1、5、15 和 30
mg/L 6 个浓度，每个浓度 3 个处理，每个处理 10 条
涡虫，每天更换 1 次培养溶液。处理 1、4 和 10 d
后取涡虫提总 RNA。再生涡虫自耳突下缘切去头部，
PFOS 处理方式与完整涡虫的相同。
1.2.2 涡虫总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 将 10 条
涡虫置于 1.5 mL 离心管中，吸干水，液氮中迅速
冷冻，使用塑料杵子研磨成粉末，加入 0.2 mL Trizol，
继续研磨成糊状，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min，取上
清液加入 1/5 体积三氯甲烷，4℃ 12 000 r/min 离心
15 min，取上清加入等体积异丙醇，4℃ 12 000 r/min
离心 10 min，弃掉上清，加入 1 mL 70% 乙醇洗涤沉
淀，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min，弃乙醇，干燥皿中
干燥 1 h，加入适量无 RNase 水溶解。使用 Reverse
Transcriptase M-MLV 进行涡虫总 RNA 反转录，合成
第一链 cDNA。
1.2.3 PCR 及 电 泳 自 NCBI 数 据 库 取 得 Djhsp70
mRNA 全长序列，设计一对引物如下 ：hsp70 sense ：
5-GGAGATACGCATTTAGGC-3，hsp70 anti-sense：5-
TCAACTGGTTCCAAGGTC-3，内参 β-actin sense［14］：
5-GGATGATGAGATGCGATGTTG-3，β-actin anti-
se-nse ：5-ATGCCAGGTCCAGATTCGTCA-3。PCR 反
应程序为 ：94℃ 5 min ；94℃ 50 s，52℃ 50 s，72℃
60 s，30 个循环 ；72℃ 10 min。保存电泳图片并使
用软件进行亮度分析。
1.2.4 Western blot 用涡虫的处理及蛋白提取 以 0、
0.5、1、5 和 10 mg/L 5 个浓度的 PFOS 溶液处理涡
虫，每个浓度 3 个处理，每个处理 30 条涡虫，每天
更换一次培养液，在 1、4 和 7 d 三个时间点取涡虫
提蛋白样品，试验分再生组与非再生组。提取蛋白
过程为 ：涡虫放入 1.5 mL EP 管，洗净，将水吸干，
液氮中瞬时冷冻，加适量 PBS（M/V=1∶100，PBS
0.01 mol/L，pH7.4），用塑料杵子研磨至糊状，4℃
10 000 r/min 离心 30 min，取上清，4℃ 10 000 r/min
离心 15 min，取上清分装保存。
1.2.5 Western blot 检 测 涡 虫 体 内 HSP70 蛋 白 变
化趋势以 Western blot 法进行检测，β-Actin 作内参。
蛋白样品以 10% SDS-PAGE 胶电泳（Bio-Rad100-120
型电泳仪，Bio-Rad miniprotea 垂直电泳槽），半干法
转 膜（15 V，18 min，Bio-Rad Trans-Blot SD Cell），
PBST 漂洗一遍，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，4℃一
抗孵育 12 h，PBST 漂洗 3 遍，4℃二抗孵育 10 h，
PBST 漂洗数遍，DAB 显色。
2 结果
2.1 RT-PCR结果
PFOS 诱导完整涡虫 hsp70 mRNA 相对表达量变
化见图 1 和图 2。完整涡虫的 RT-PCR 结果（图 1）
显示，在 1 d 时，1-30 mg/L 组呈现高表达，表达量
超过对照组的 1.5 倍，到 4 d 和 10 d 时这种高表达
不明显。浓度为 30 mg/L 的 PFOS 超出涡虫的承受能
力，在处理 10 d 时，涡虫大量死亡，无法完成 RNA
提取，此组涡虫 hsp70 表达量没有数据。再生涡虫
的 RT-PCR 结果（图 2）表明，再生涡虫对 PFOS 更
加敏感，30 mg/L PFOS 处理 1 d 造成涡虫大量死亡，
10 mg/L PFOS 处理 10 d 造成涡虫大量死亡，所以将
PFOS 最高浓度调为 8 mg/L。诱导再生涡虫 1 d 时，
与对照组相比除 5 mg/L 组以外，hsp70 mRNA 表达
量均下降，4 d 时，各浓度 PFOS 对 hsp70 基因表达
量无显著影响，10 d 时，PFOS 抑制 hsp70 的表达，
并有一定浓度相关性。
2.2 Western blot结果
对于完整涡虫，HSP70 蛋白表达量变化与 PFOS
处理浓度存在一定相关性（图 3），多数处理条件下，
PFOS 诱导使涡虫 HSP70 蛋白表达量略有增加，仅 0.5
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期158
mg/L 处理 1 d 组以及 10 mg/L 处理 1 d 和 4 d 组表达
量下降，最多下降 50%。总体来说，PFOS 诱导没
有使涡虫 HSP70 蛋白表达明显变化。再生涡虫暴露
于 10 mg/L PFOS 7 d 时毒害作用最大，死亡率达到
50%。并且再生涡虫 HSP70 蛋白变化十分显著（图 4），
诱导 1 d 时各诱导浓度的涡虫 HSP70 蛋白表达变化
不显著 ；诱导再生涡虫 4 d 时，各组 HSP70 的量随
PFOS 的浓度增加而升高，5 mg/L 组达到最高，为对
照组的 8 倍，再生 7 d HSP70 呈先下降后上升的趋势，
1 mg/L PFOS 处理组表达量极低，到 5 mg/L PFOS 处
理组表达量最高，为对照组的 5 倍。
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
1041 ༴⨶ᰦ䰤dmRNA⴨ሩ㺘
䗮䟿 0 mg/L0.5 mg/L1 mg/L5 mg/L15 mg/L
30 mg/L
B
0
hsp70
1 d 4 d 10 d
β-actin
0.5 1 5 15 30 0 0.5 1 5 15 30 0 0.5 1 5 15
PFOS⎃ᓖmg/L
PFOS 浓度为 0、0.5、1、5、15 和 30 mg/L ；A ：hsp70 表达变化趋势（n=3）；
B ：hsp70 和 β-actin 电泳照片
图 1 完整涡虫 hsp70 mRNA 相对表达量变化
A
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
1041 ޽⭏ᰦ䰤dmRNA⴨ሩ㺘
䗮䟿 0 mg/L0.5 mg/L1 mg/L5 mg/L8 mg/L
B
0
hsp70
1 d
PFOS⎃ᓖmg/L
4 d 10 d
β-actin
0.5 1 5 8 0 0.5 1 5 8 0 0.5 1 5 8
PFOS 浓度为 0、0.5、1、5 和 8 mg/L ；A ：hsp70 表达变化趋势（n=3）；B ：
hsp70 和 β-actin 电泳照片
图 2 涡虫再生过程中 hsp70 mRNA 相对表达量变
HSP70
0 0.5
PFOS⎃ᓖmg/L
1 5 10
β-Actin
A
HSP70
β-Actin
B
HSP70
β-Actin
C
A ：涡虫暴露于 PFOS 中 1 d，B ：涡虫暴露于 PFOS 中 4 d，C ：涡虫暴露于
PFOS 中 7 d
图 3 完整涡虫暴露于各浓度 PFOS 中 HSP70 蛋白相对表
达量变化
HSP70
0 0.5
PFOS⎃ᓖmg/L
1 5 10
β-Actin
A
HSP70
β-Actin
B
HSP70
β-Actin
C
A ：涡虫暴露于 PFOS 中再生 1 d ；B ：涡虫暴露于 PFOS 中再生 4 d ；C. 涡虫
暴露于 PF0S 中再生 7 d
图 4 再生涡虫暴露于各浓度 PFOS 中 HSP70 蛋白相对表
达量变化
3 讨论
PFOS 能引起众多基因表达量变化，Hu 等［15］
将 小 鼠 癌 细 胞 暴 露 于 高 浓 度 PFOS 中， 约 400 个
基因表达受到显著影响，这些基因涉及脂肪酸同
化酶、细胞色素 450 以及激素调节等。有试验表
明 PFOS 能直接破坏 DNA 结构［16］，但也有试验显
示 PFOS 不造成基因的损伤［16］，而是具有细胞毒
性［10］。PFOS 的毒性机制虽然还没有完全清楚，但
2014年第10期 159宫晓宁等：PFOS 对东亚三角涡虫HSP70 蛋白及基因表达的影响
大量试验表明，其主要作用是造成细胞的氧化压力，
体外培养的细胞和动植物个体试验均显示，PFOS 诱
导能造成活性氧（ROS）含量升高［17］，过氧化氢
酶，超氧化物歧化酶等抗氧化酶类表达量均显著增
加［12，17-20］。hsp70 是生物体应对外界压力的标志性
基因，具有抗氧化的作用。本试验显示，完整涡虫
短时间暴露于 PFOS 中，诱导 hsp70 表达，但暴露时
间延长，逐步呈抑制表达状态，可能是 PFOS 在涡
虫体内积累量少时，能诱导 hsp70 表达，随积累量
增加，又存在抑制表达的作用。Anne 等［21］的试验
中大西洋鲑暴露于 15.1 mg/L 和 25.0 mg/L PFOS 中 1
d，hsp70 mRNA 表达量显著增加，暴露于 PFOS 中 2
d 时，25.0 mg/L 组 hsp70 表达量较 15.1 mg/L 组下降，
与本试验结果一致。
本试验分别检测了 hsp70 mRNA 和蛋白表达量
变化，通过比较发现 hsp70 mRNA 和蛋白表达量变
化趋势不一致，完整涡虫暴露于 PFOS 中 1 d 时，
hsp70 mRNA 表达量上升，但对应 HSP70 蛋白不存
在显著增加，再生涡虫长时间暴露于高浓度的 PFOS
中 hsp70 mRNA 表达量受到抑制，但对应的蛋白表
达量增加数倍。可能存在 PFOS 对蛋白表达的抑制
作用，低浓度的 PFOS 能通过某种作用，在 mRNA
高表达的情况下降低蛋白表达量，而高浓度的 PFOS
不存在这种抑制作用。
本试验中观察到，高浓度长时间 PFOS 处理完
整涡虫，会造成涡虫躯体出现孔洞、残缺以至完全
解体，再生涡虫比完整涡虫更敏感，推测试验过程
PFOS 对涡虫的氧化压力是存在的，并且能引起涡虫
的凋亡，hsp70 基因受到少量 PFOS 诱导作用而激活
转录，但在蛋白表达过程中被 PFOS 抑制，蛋白量
没有显著变化，大量 PFOS 抑制基因的转录，但对
蛋白表达没有影响，所以 HSP70 蛋白表达量上升。
另外，涡虫在再生过程中，hsp70 的表达量会有显著
升高，并且可能与再生早期干细胞的迁移聚集有关，
而与细胞分裂分化无关，因此 hsp70 的表达在再生
48 h 时开始下降［22］，可能是本试验中造成完整涡虫
和再生涡虫基因表达不同的原因。
4 结论
PFOS 刺激涡虫能够引起涡虫的应激反应，影响
hsp70 基因的转录，但 mRNA 量和蛋白量不成线性
关系，可能存在 PFOS 对蛋白表达的抑制作用 ；低
剂量 PFOS 对 hsp70 的影响大于高剂量，诱导转录抑
制蛋白量，而高剂量 PFOS 作用正好相反。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）