全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-09-27
基金项目 : 重大新药创制国家科技重大专项课题（2009ZX09103-644）, 国家自然科学基金项目（81160503）
作者简介 : 于海鹏 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 水生生物技术与海洋药物 ; E-mail: guepng.yuhaipeng@163.com
通讯作者 : 罗素兰 , 女 , 教授 , 博士生导师 ; E-mail: luosulan2003@163.com
乙酰胆碱受体 α4β2亚型在非洲爪蟾卵母
细胞中的表达
于海鹏 李宝珠 房立丛 沈立姿 朱晓鹏 胡远艳
张本 长孙东亭 罗素兰
（海南大学热带生物资源教育部重点实验室 海南大学海口市海洋药物重点实验室， 海口 570228）
摘 要： 通过建立乙酰胆碱受体 α4β2亚型（α4β2 nAChR）在非洲爪蟾卵母细胞中的表达模型，以便以 α4β2 nAChR为作用
靶点进行药物筛选。将乙酰胆碱受体亚基基因 α4、β2体外转录获得的 cRNA，通过显微注射的方法注入非洲爪蟾卵母细胞，并对
该受体的表达情况进行检测。结果显示，乙酰胆碱受体 α4β2亚型在蛙卵细胞中获得了有效表达，记录到典型的 ACh 配体门控的
离子通道内向电流。
关键词： 乙酰胆碱受体亚型 α4β2 非洲爪蟾卵母细胞 受体基因表达 配体门控离子通道
Expression of α4β2 Acetylcholine Receptor in Xenopus laevis Oocytes
Yu Haipeng Li Baozhu Fang Licong Shen Lizi Zhu Xiaopeng Hu Yuanyan Zhang Ben
Zhangsun Dongting Luo Sulan
（Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education, Hainan University；
Key Laboratory for Marine Drug of Haikou, Hainan University, Haikou 570228）
Abstract: It is to establish a drug screening model with the molecular target of mammal α4β2 nicotinic acetylcholine receptor（nAChR）.
Rat α4 and β2 nAChR subunits’ cRNA were produced by in vitro transcription, which were mixed with equal amount and then microinjected in
the fresh oocytes of Xenopus laevis. Two-microelectrode voltage clamp （TEVC） was used to detect the acetylcholine （Ach） gated current of α4β2
nAChR. Results showed that the typical Ach gated inward current was recorded in the α4 and β2 cRNA injected oocytes, and α4β2 nAChR was
expressed in Xenopus laevis oocytes successfully. This can be used as the experimental model to screen bioactive toxins with the drug target of
α4β2 nAChR, and also can be a reference for other acetylcholine receptors expressed in Xenopus laevis oocytes.
Key words: α4β2 acetylcholine receptor Xenopus laevis oocytes Receptor gene expression Ligand gated ion channel
烟碱乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine recep-
tors, nAChRs）是乙酰胆碱门控离子通道的受体，是
研究药物作用机制、突触传递以及跨膜信号分子构
效关系的经典模型［1］，其广泛分布于中枢神经系
统中，通过影响递质释放、细胞兴奋性及神经整合
过程等对神经网络进行调节并参与许多生理功能和
病理过程。神经型乙酰胆碱受体由 α2 - α7 亚基和
β2 - β4 亚基组成，其结构与肌肉型乙酰胆碱受体基
本相似［2, 3］，在人体中主要有（α4） 2 （β2） 3，（α4） 2
（β2）2α5，（α3）2 （β4） 3，（α3）β2β4α5，（α3） 2 （β4） 2
α5，（ α7）5［4］ 等亚型。神经乙酰胆碱受体有两个分
支，一个分支由 α2 - α6 亚基和 β2 - β4 亚基组成异聚
体，如（α4） 2 （β2） 3，亚基之间按 α4β2α4β2β2 方式
排列于离子通道周围，乙酰胆碱的两个结合位点在
α4β2 之间。另一分支由 α7 - α9 同源亚基组成，如
（α7） 5［5］ 。其中 α4β2 亚型占脑内与烟碱有高亲和力
的 nAChRs 的 90%［6］，其主要分布在前脑、脑顶叶
和颞叶皮质、海马、基底神经节和小脑。研究表明
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期142
α4β2 亚型 nAChRs 与癫痫、帕金森氏症、孤独症等
中枢神经系统疾病有一定联系［7］。
非洲爪蟾是一种在南非生长的爪蟾（ South Afri-
can clawed toad）。非洲爪蟾卵母细胞表达体系能有
效地表达外源性 mRNA 编码的受体蛋白质，并能进
行翻译后加工，最后将组成蛋白质分子的各亚单位
通过胞内运输管道，以正确的方向组装在卵母细胞
表面，形成有效的功能单元，与天然受体具有相同
或相似的生理生化特性，因此又被形象地称为受体
移植［8］。非洲爪蟾卵母细胞表达离子通道，进而进
行结构功能的研究已有几十年的历史，近年来随着
电压钳技术的发展、膜片钳技术的应用、分子生物
学技术检测方法的不断创新，使非洲爪蟾卵母细胞
表达体系在这方面的研究有了极其广泛的应用。目
前，许多离子通道的结构已逐步弄清，许多相应离
子通道的 cRNA 已被克隆，将 cRNA 转录成 mRNA
在非洲爪蟾卵母细胞上进行功能表达研究，对阐明
离子通道的结构与功能的关系和离子通道基因突变
与疾病的发生机制都具有重要意义［9］。所以爪蟾卵
母细胞已成为实验室常用的基因表达系统之一。
本研究拟建立乙酰胆碱受体 α4β2 nAChR 在非
洲爪蟾卵母细胞中的表达模型，以便利用该模型进
行药物筛选。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、质粒及培养基 -70℃保存大肠杆菌
DH5α 甘油菌 ；分别含有 α4、β2 乙酰胆碱受体基因
的质粒 ；LB 培养基。
1.1.2 试验动物 美国进口的雌性爪蟾（Xenopus
laevis）。实验室人工养殖半年以上，养殖环境温度
16℃左右，养殖用水净化、沉淀、去氯等处理。
1.1.3 试剂与仪器 质粒中量抽提试剂盒、限制性
内切酶（EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ）、分子量标准等（TaKaRa）；
SanPrep 柱式 PCR 产物纯化试剂盒（Sangon）；cRNA
合成试剂盒 mMessage mMachine SP6 、T7 Kit、MEGA
clear Kit（Ambion）；胶原酶（Mannheim）、乙酰胆碱
（Sigma）；其他试剂为国产分析纯；OR-2（96.0 mmol/L
NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，5 mmol/L
HEPES，pH7.1-7.7）；ND96（96.0 mmol/L NaCl，
2.0 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L MgCl2，
5 mmol/L HEPES，pH7.1-7.5）；紫 外 分 光 光 度 计
（Bio-Rad，Smart SpecTM plus Spectrophotometer）； 膜
片钳仪器（Axon 900A）；微电极拉制仪（Sutter，P-97）；
抛光仪（Narishige，MF-830）；研究级体视显微镜
（OLYMPUS，SZX-ILLD2-200）；显微注射仪（Sutter，
Nanoliter 2000）；细 胞 培 养 箱（Rikakikai，KCL-
2000A）；小型真空泵 ；冷光源 ；浴槽 ；灌流装置等。
1.2 方法
1.2.1 α4、β2 乙酰胆碱受体 cRNA 的制备 用中量
质粒提取试剂盒分别提取含 α4、β2 乙酰胆碱受体基
因的质粒，分别用限制性内切酶 EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ
对质粒进行酶切。酶切产物进行浓缩纯化。分别用
mMessage mMachine SP6 、T7 Kit 对纯化后包含目的
基因的线性 DNA 进行体外转录。用 MEGA clear Kit
分别对转录产物 cRNA 进行纯化，受体 RNA 纯化后
测定 OD 值，确定其浓度。
1.2.2 非洲爪蟾卵母细胞的分离 选择约半年未取
过卵母细胞的爪蟾，冰浴 30-45 min，待其四肢麻
痹，翻正反射消失后，在其下腹部正中皮肤及内部
肌肉处切一个 0.5-1 cm 的小口，拉出宫瓣，剪出试
验所需量的爪蟾卵母细胞，置于含 OR2 溶液的培
养皿中待用，缝合爪蟾的肌肉及皮肤，置于浅水中
（使其头部露在水面上方），使其自然苏醒。将培养
皿中成串的卵母细胞剪成小块，转移至 50 mL 离心
管中反复用 OR2 溶液清洗，至清洗后的 OR2 溶液
为澄清为止。在含胶原酶（0.5 mg/mL）的 OR2 溶
液中室温下振荡消化 1 h 左右，待溶液浑浊后，将
卵母细胞转移至另一个含胶原酶（0.5 mg/mL）的
50 mL 离心管中，进行二次消化，待大多数细胞呈
单个细胞时终止消化。用 OR2 溶液反复清洗后，
在解剖显微镜下进行筛选，选择Ⅴ/Ⅵ期的卵母细
胞，其直径应 >1 000 μm，且动植物级界限分明，置
于含适量种类抗生素（青霉素 10 μg/mL，链霉素
10 μg/mL，庆大霉素 100 μg/mL）的 ND96 溶液中，
17℃恒温培养箱中培养过夜。
1.2.3 受体 cRNA 的显微注射 将培养过夜的卵母
细胞再次进行筛选，去除死亡及状态不好的卵母细
胞，其余的用于显微注射。拉制显微注射针，直径
2012年第4期 143于海鹏等 ：乙酰胆碱受体 α4β2 亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
约 0.25 μm，灌入矿物油，吸入 α4、β2 乙酰胆碱受
体 cRNA，注射位置于动植物级分界线处的细胞质
内，注射过程中避免破坏卵母细胞，细胞注射量为
10.86 ng/cell，注射体积为 46 nL/cell。注射后的卵母
细胞，17℃恒温培养箱中培养，24 h 后开始检测。
培养过程中，剔除死亡的细胞，并及时更换新鲜培
养液。
1.2.4 乙酰胆碱（Ach）门控电流记录［10］ 注射后
24 h，利用双电极电压钳系统检测 α4β2 受体电流表
达情况。将卵母细胞固定在容积为50 μL的细胞槽中，
接好灌流系统。使用微电极拉制仪拉制玻璃微电极，
电极规格 ：尖端直径为 1-3 μm，电阻为 0.5-2 MΩ，
灌充 3 mol/L 的 KCl 溶液。将两根玻璃微电极接到放
大器的探头上。调整电极位置，当电极尖端进入细
胞槽液面后，将放大器面板上的 mV、V 调节至零电
位，同时测量电极的电阻是否满足试验需要。如上
述情况皆满足，将两个电极刺入卵母细胞，设置钳
制电压为 -70 mV，采样模式为 Episodic stimulation，
采样频率 Slow100 Hz，根据试验需要选择其他参
数。细胞灌流液为含有 1 mol/L atropine 和 0.1 mg/mL
BSA 的 ND96 缓冲液，灌流速度为（1-2）mL/min，
每分钟给 1 s 的 100 μmol/L 的 Ach 脉冲，25℃室
温下记录 Ach 脉冲产生的内向电流。采样软件为
pClamp10.0（美国 Axon 公司）。
2 结果
2.1 α4、β2乙酰胆碱受体cRNA的制备
分别提取含有 α4、β2 nAChR 基因的质粒，取
1 μL 质粒 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。用 EcoR Ⅰ、
Hind Ⅲ对质粒分别进行酶切线性化，取 3 μL 电泳检
测（图 1-A）。酶切产物用 SanPrep 柱式 PCR 产物纯
化试剂盒纯化后，取 3 μL 电泳检测（图 1-B）。
A. α4 和 β2 受体质粒酶切线性化，M1. DL2000 DNA Marker，1. α4 质粒， 2. β2 质粒，3. α4 质粒酶切线性化， 4. β2 质
粒酶切线性化，M2. λ-Hind Ⅲ DNA Marker ；B. 线性化 α4 和 β2 受体质粒纯化结果，M1. DL2000 DNA Marker，1. α4
质粒酶切纯化产物，2. β2 质粒酶切纯化产物，M2. λ-Hind Ⅲ DNA Marker
图 1 α4和 β2亚基质粒酶切线性化（A）及亚基质粒纯化（B）结果
2.2 α4、β2乙酰胆碱受体cRNA浓度测定
取 1 μL 纯化后 cRNA 稀释 50 倍，用分光光度计
分别检测其在波长 260 nm、280 nm 的 OD 值，两种
受体 cRNA OD值A260 A280 分别为 1.802 8 和 1.978 5，
符合后续卵母细胞注射对纯度的要求，纯化后 α4、
β2 受体亚基 cRNA 终浓度分别为 0.585 5 μg/μL，
0.406 1 μg/μL。
2.3 α4β2乙酰胆碱受体Ach门控电流的检测
细胞注射培养 24 h 后，经双电极电压钳系统全
细胞模式检测 α4β2 nAChR 在蛙卵中成功表达，对
表达了该受体的卵母细胞进行 Ach 脉冲激活时，产
生了明显的内向电流，其电流大小在一定范围内随
Ach 浓度的改变而改变 ；将钳制电压设置为 -70 mV
时用不同浓度的 ACh 作为激动剂，得到 Ach 浓度与
电流的量效关系图（图 2）。
3 讨论
文献报道［11］ 爪赡卵母细胞具有 5 种天然的 M
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期144
型 ACh 受体，其中两种的电流较明显。通过消化去
膜后，卵母细胞的静息膜电位及补偿电流无改变，
说明去膜对细胞的生理状态影响不大。但去膜后不
能记录到 ACh 激发的电流，说明去膜已消除了内源
性受体，同时本试验过程中灌流所用 ND96 中含有
膜 GABA 释放和中脑多巴胺能神经控制十分重要 ；
β2 亚单位参与学习和记忆功能的调控，在烟碱导致
的认知行为中起重要作用［15］。给予试验动物 α4β2
受体激动剂 SIB 1765F、α4β2 受体竞争性拮抗剂
DHβE，观察大鼠注意能力的变化，结果发现烟碱和
α4β2 受体激动剂明显提高大鼠的注意作业成绩（准
确率和反应时间），这种作用可以被 DHβE 所逆转。
提示 α4β2 受体在注意和行为抑制过程中起着重要的
作用［16］。α4β2 亚型还参与痛觉调控［17］。
试验过程中，要特别注意减少 cRNA 的降解，
由于 RNA 酶广泛存在，其活性很难完全控制，因此
抽提纯化时必须注意所用器具、药品的处理，严格
防止 RNase 的污染 ；体外转录的所有操作应在低温
下进行［18］；在受体 cRNA 的显微注射时，操作过程
中应注意带口罩帽子，保证无污染。
在显微注射受体 cRNA 时，注射量应根据试验
情况适时调整，cRNA 浓度低时，可适当增加注射
量，一般情况保证 70% 以上卵母细胞表达的电流在
500-2 000 nA 为宜，但由于卵母细胞承受量所限，
注射量也不宜过多，一般应小于 70 nL。本实验室注
射受体 cRNA 时，采用过一次注射和两次注射等方
法，一次注射为一次性将所需受体 cRNA 注射到卵
母细胞内，两次注射为将仪器的注射体积调整为所
需注射体积的一半，当第一次注射几秒后，再次注
射一次，两次加和正好为所需体积。一次注射操作
相对简单，两次注射则适用于注射体积较大时使用，
以防止一次性注射体积过大，有受体 cRNA 从针孔
处外泄。
注射过受体 cRNA 的卵母细胞应分小盘培养，
为防止细菌感染，培养液为含抗生素（青霉素
10 μg/ mL，链霉素 10 μg/mL，庆大霉素 100 μg/mL）
的 ND96，其中 ND96 为高压湿热灭菌，抗生素为过
滤除菌。培养过程中需每天更换培养液，去除死细胞。
在受体电流检测过程中，应根据所取卵母细胞
的实际情况，以初始漏电流不大于 -100 nA 为宜。灌
流速度不宜过大，否则对卵母细胞冲击过大。不同
受体对 Ach 的敏感度也不同，有些受体与 Ach 结合
紧密，需要灌流很长时间的ND96才能使其回归基线，
应根据具体情况调整记录程序。记录过程中，关好
屏蔽网，关闭显微镜灯光，减少电生理实验室使用
A. 注射 α4β2 在钳制电压为 - 70 mV 时，使用浓度分别为 0、1、20、
100 和 500 μm 的 ACh 导致的典型电流图 ； B. 钳制电压为 -70 mV 时
ACh 的量效关系图，其 EC50 = 21 μmol /L
图 2 已表达 α4β2受体的卵母细胞由不同浓度乙酰胆碱
（ACh） 激发的电流变化图和 ACh 的量效关系
1 μmol/L 的阿托品溶液，其对去膜后残余的少量
ACh 受体所产生的电流具有阻断作用。
α4β2 亚型 nAchRs 是由 2 个 α4 和 3 个 β2 亚单
位组成的五聚体，即（α4） 2（β2） 3，其又可分为
α4-1β2 和 α4-2β2［12, 13］。其中 α 亚基是受体的结合亚
基，与配体或激动剂结合 ；β 亚基为结构亚基，维
持受体结构的稳定性。人类和啮齿类动物神经系统
中，α4β2 亚型 nAchRs 超过 90% 并广泛分布于中枢
各个区域。α4β2 亚型 nAchRs 与很多中枢神经系统
疾病相关，如阿尔茨海默病、帕金森氏症、精神分
裂症等。此外一种名为 Varenicline 的药物于 2006 年
被美国 FDA 批准用于戒烟治疗［14］。
α4 或 β2 基因敲除小鼠的研究表明，α4β2 异源
受体促进多巴胺能神经末梢释放多巴胺，对突触前
2012年第4期 145于海鹏等 ：乙酰胆碱受体 α4β2 亚型在非洲爪蟾卵母细胞中的表达
交流电的仪器，将实验操作台上的管线用锡纸包裹，
减少人为干扰等，都是减少干扰电流的有效方法。
4 结论
本试验成功地在非洲爪蟾卵母细胞膜上表达了
α4β2 亚型乙酰胆碱受体，为筛选作用于此靶点的药
物提供了模型，此模型具有操作简单、易培养、表
达稳定等优点，也为其他乙酰胆碱受体亚型的表达
模型建立提供了方法参考。
参 考 文 献
［1］ Chernyavsky AI, Arredondo J, Qian J, et al. Coupling of ionic events to
protein kinase signaling cascades upon activation of α7 nicotinic rec-
eptor. The Journal of Biological Chemistry, 2009, 284: 22140-22148.
［2］ Garza A , Huang LZ , Son JH, et al. Expression of nicotinic acetylch-
oling receptors and subunit messenger RNAs in the enteric nervous
system of the neonatal rat. Neuroscience, 2009, 158: 1521-1529.
［3］ Pérez EG, Cassels BK, Zapata-Torres G. Molecular modeling of
the α9α10 nicotinic acetylcholine receptor subtype. Bioorganic &
Medicinal Chemistry , 2009, 19: 251-254.
［4］ Jia YS, Yamazaki Y, Nakauchi S, et al. α2 nicotine receptors function
as a molecular switch to continuously excite a subset of interneurons
in rat hippocampal circuits . European Journal of Neuroscience,
2009, 29: 1588-1603.
［5］ Romanelli MN, Gratteri P, Guandalini L, et al. Central nicotinic
receptors: structure, function, ligands, and therapeutic potential.
Chem Med Chem , 2007, 2: 746-767.
［6］ Nashmi R, Lester HA. CNS localization of neuronal nicotinic
receptors. Journal of Molecular Neuroscience, 2006, 30: 181-184.
［7］ Ulens C, Akdemir A, Jongejan A, et al. Use of acetylcholine binding
protein in the search for novel α7 nicotinic receptor ligands. In silico
docking, pharmacological screening, and X-ray analysis. Journal of
Medicinal Chemistry, 2009, 52: 2372-2383.
［8］ Buznikov GA, Shmukler YB, Lauder JM. From oocyta to neuron: do
neurotransm itters function in the same way throughout deve lopment.
Cellular and molecular neurobiology, 1996, 16（ 5）: 537.
［9］ Kolosha V, Anoia E, Cespedes C, et al. Novelmutation in 13 probands
with galactokinase deficiency. Human Mutation, 2000, 15（5） : 447-
453.
［10］ 车晶晶 , 扬璞 , 叶方立 . 一种简单、精确计算 EC50 的方法 .
数理医药学杂志 , 2001, 14（6）: 482-482.
［11］ Rogelio A, Edith G, Ricardo M. Muscarinic receptor heterogeneity
in follicle-enclosed Xenopus oocytes. Physiol, 1999, 521 : 409-19.
［12］ Goldman D, Deneris E, Luyten W, et al. Members of a nicotinic
acetyl-choline receptor gene family are expressed in different
regions of the mammalian central nervous system. Cell, 1987, 5
（48）:965-973.
［13］ Connolly J, Boulter J, Heinemann SF. a4-2β2 and other nicotinic ac-
etylcholine receptor subtypes as targets of psychoactive and addic-
tive drugs. British Journal of Pharmacology, 1992, 105: 657-666.
［14］ 聂慧贞 , 李薇 , 聂瑞丽 , 等 . 神经元烟碱 α4β2 亚型胆碱受体
与中枢神经系统疾病的关系 . 上海交通大学学报 ：医学版 ,
2009, 6（29）:744-746.
［15］ Xu W, Orr-Urtreger A, Nigro F, et al. Multiorgan autonomic dysfuv-
tion in mice lacking the α4 and β2 subunits of neuronal nicotinic
acetylchonine receptors. The Journal of Neuroscience, 1999, 19
（21）: 9298-9305.
［16］ Pradhan AAA, Cumming P, Clarke PBS, et al. Epibatidine-labelled
nicotinic receptors in the extended striatum and cerebral cortex: lack
of asso-ciation with serotonergic afferents. The Journal of Brain
Research Reseh, 2002, 954（2）: 227-236.
［17］ Holladay MW, Bai H, Li Y, et al. Structure-activity studies related
to ABT-594, a potent nonopioid analgesic agent:effect of pyridine
and azetidine ring substitutions on nicotinic acetylcholine receptor
binding affinity and analgesic activity in mice. Bioorganic &
Medicinal Chemistry , 1998, 8（19）: 2797-2802.
［18］ 聂辉 , 张培华 , 王育斌 , 等 . 大鼠脑组织 mRNA 在非洲爪蟾
卵母细胞的表达 - 外源性 GABA A 受体与内源性 GABA A 和
GABA B 受体的比较 . 中华现代中西医杂志 , 2003, 1（10）:
868-870.
（责任编辑 李楠）