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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第6期
非洲爪蟾（South African clawed toad）生长于南
非，其卵母细胞体型较大，直径可达 1.0-1.2 mm，
能有效地表达外源性基因编码的受体蛋白，所表达
的受体与天然受体具有相同或相似的生理生化特性，
因此又被形象地称为受体移植［1，2］。爪蟾卵母细
胞作为一种功能性表达系统，具有操作简单、易培
养、表达稳定等优点，因此被众多实验室使用［3，4］。
利用爪蟾卵母细胞建立的受体表达系统，在生物毒
素等活性物质的筛选过程中起到了重要的作用。国
内对非洲爪蟾卵母细胞表达体系研究和应用相对滞
后，在试验过程中，经常会遇到卵母细胞消化不完
全或消化过度、受体表达失败或电流过大过小等情
收稿日期 ：2012-12-07
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（81160503），国家“863”计划项目（2012AA021706），国家国际科技合作专项（2011DFR31210），长
江学者和创新团队发展计划项目（IRT1123）
作者简介 ：房立丛，女，硕士研究生，研究方向 ：海洋药物与生物技术 ；E-mail ：fanglicong1987@163.com
通讯作者 ：长孙东亭，男，副研究员，E-mail ：zhangsundt@163.com
受体在非洲爪蟾卵母细胞上表达方法的优化
房立丛  沈立姿  于津鹏  朱晓鹏  胡远艳  张本  罗素兰  长孙东亭
（海南大学 热带生物资源教育部重点实验室 海口市海洋药物重点实验室，海口 570228）
摘 要 ： 通过改变非洲爪蟾卵母细胞的消化时间、消化次数、消化用酶量等，优化乙酰胆碱受体的表达条件。结果显示，
采用两步消化法，在经过 0.5 mg/mL 的胶原酶消化 50-70 min 之后得到的非洲爪蟾卵母细胞的状态较好，利于受体的表达 ；同时优
化了受体在非洲爪蟾卵母细胞上的表达条件。试验所获得的优化表达条件对建立非洲爪蟾卵母细胞受体表达体系具有重要意义。
关键词 ： 非洲爪蟾卵母细胞 乙酰胆碱受体 表达 优化
Optimization of Receptors Expressed on Xenopus laevis Oocytes
Fang Licong Shen Lizi Yu Jinpeng Zhu Xiaopeng Hu Yuanyan Zhang Ben
Luo Sulan Zhangsun Dongting
（Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education，Key Lab for Marine Drugs of Haikou，
Hainan University，Haikou 570228）
Abstract:  It was to optimize the conditions of AChRs expressed on Xenopus laevis oocytes, including the oocytes’ digestion time,
frequency and the amount of collagenase. Results showed that when using two-step digestion method and 0.5 mg/mL concentration of collagenase,
the isolated Xenopus laevis oocytes was beneficial to express AChRs. The conditions of receptor expression on the oocytes were also optimized.
The optimized expression methods are significant to set up the expression system of AChRs on Xenopus laevis oocytes, which are the basis for
screening new drugs to target AChRs with this experimental model.
Key words:  Xenopus laevis oocytes Acetylcholine receptor Expression Optimization
况。为有效解决上述问题，本研究以乙酰胆碱受体
为例，通过优化爪蟾卵母细胞消化时间、消化次数、
消化用酶量、培养液是否含抗生素、注射时间、注
射 cRNA 量等条件，确定受体在爪蟾卵母细胞膜上
的表达条件，对建立非洲爪蟾卵母细胞受体表达体
系具有重要意义，旨在为采用此模型、以受体为药
物靶点筛选靶向性药物提供技术方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试 验 动 物 美 国 进 口 的 性 成 熟 雌 性 爪 蟾
（Xenopus laevis），实验室人工养殖半年以上，养殖环
境温度 16℃左右，养殖用水净化、沉淀、去氯等处理。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期168
1.1.2 试剂与仪器 胶原酶（Mannheim）、乙酰胆
碱（Sigma）；其他试剂为国产分析纯 ；OR-2（96.0
mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2，5
mmol/L HEPES，pH7.1-7.7）；ND96（96.0 mmol/L
NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.8 mmol/L CaCl2，1.0 mmol/L
MgCl2，5 mmol/L HEPES，pH7.1-7.5）；ddH2O ；膜片
钳仪器（Axon 900A）；微电极拉制仪（Sutter，P-97）；
抛光仪（Narishige，MF-830）；研究级体视显微镜
（OLYMPUS，SZX-ILLD2-200）；显微注射仪（Sutter，
Nanoliter 2000）； 细 胞 培 养 箱（Rikakikai，KCL-
2000A）；小型真空泵 ；冷光源 ；浴槽 ；灌流装置等。
所有用于 RNA 试验的非玻璃器皿用 0.1% DEPC 浸
泡 12 h 以上，玻璃器皿经 250℃烘烤 6 h 以上。体
外转录的乙酰胆碱受体 cRNA 由本实验室制备。
1.2 方法
1.2.1 非洲爪蟾卵母细胞的采取 选择近半年内未
取过卵母细胞的爪蟾，冰浴 30-45 min，待其四肢
麻痹，翻正反射消失后，在其下腹部正中皮肤及内
部肌肉处切一个 0.5-1 cm 的小口，拉出宫瓣，剪出
试验所需量的爪蟾卵母细胞，置于含 OR2 溶液（41
mmol/L NaCl，1 mmol/L KCl，0.5 mmol/L MgCl2，2.5
mmol/L HEPES）的培养皿中待用，缝合爪蟾的肌肉
及皮肤，置于浅水中（注意使其头部露在水面上方），
使其自然苏醒。将培养皿中成串的卵母细胞剪成小
块，转移至 50 mL 离心管中反复用 OR2 溶液清洗，
至清洗后的 OR2 溶液澄清为止［5］。
1.2.2 爪蟾卵母细胞分离条件的优化［4，6］ 将剪成
小块并清洗干净的卵母细胞，在含有不同浓度胶原
酶的 OR2 溶液中室温下振荡消化后，于 17℃恒温培
养箱中培养，分离当天或培养过夜后进行注射，具
体分离条件见表 1。
1.2.3 乙酰胆碱受体的表达 以 α7 烟碱型乙酰胆
碱受体（nAChRs）亚型为例，选择 3 种 α7 nAChRs
cRNA 体积分别注射上述分离产生的非洲爪蟾卵母细
胞，并以未注射的卵母细胞和注射等体积的 ddH2O
作为对照组。3 种注射体积分别为每个卵母细胞注
射 41.4、50.6、60.9 nL cRNA 或 ddH2O。α7 nAChRs
cRNA 的浓度为 0.32 μg/μL，即 3 种注射体积对应的
每个卵母细胞的注射质量分别为 13.3、16.2 和 19.5
ng。注射后的卵母细胞于 17℃培养 1-2 d 后，利用
双电极电压钳系统检测乙酰胆碱受体电流表达情况。
将卵母细胞固定在容积为 30 μL 的细胞槽中，接好
灌流系统，每分钟给 2 s 的 200 μmol/L 的 Ach 脉冲，
25℃室温下记录 Ach 脉冲产生的内向电流。采样软
件为 pClamp10.0（美国 Axon 公司）。其他试验参数
见表 2。
表 2 乙酰胆碱受体电流检测试验参数
参数名称 参数设置
钳制电压 -70mV
采样模式 Episodic stimulation
采样频率 Slow100HZ
灌流液 0.1 mg/mL BSA 的 ND96 缓冲液
灌流速度 1-2 mL/min
2 结果
2.1 非洲爪蟾卵母细胞的采集和分选
已消化分离的卵母细胞大致分为 3 类，包括未
成熟的、Ⅴ/Ⅵ期成熟的和过成熟的卵母细胞，如图
1 所示，在解剖显微镜下易于区分。只有没有带血
丝的Ⅴ/Ⅵ期卵母细胞，其直径 >1 000 μm，且动植
物极界限分明的类型，才能用于注射受体 cRNA 进
行表达。注射前需在解剖显微镜下进行分选，挑出
健康圆鼓的Ⅴ/Ⅵ期成熟卵母细胞用于注射。
2.2 爪蟾卵母细胞分离条件的优化
爪蟾卵母细胞处理条件的优化试验结果为 ：当
消化时间约为 40 min 时，卵母细胞呈团块状，且有
血丝粘连，卵巢膜和滤泡膜未完全去除 ；当消化时
间约为 45 min 时，卵母细胞呈团状，卵巢膜和滤泡
表 1 爪蟾卵母细胞的分离条件
消化方法 抗生素 消化用酶量
（mg/mL）
注射时间 消化时间
（min）
一步消化法 含抗生素 0.3 分选后立即注射 40
45
0.5 50
55
两步消化法 不含抗生素 0.7 培养过夜后
（16 h 以上）注射
60
65
70
75
2013年第6期 169房立丛等 ：受体在非洲爪蟾卵母细胞上表达方法的优化
膜仍未完全去除，但已有单个游离的卵母细胞存在；
当时间在 50、55、60、65 和 70 min 时，卵母细胞
颜色鲜亮，多数为单个游离状，卵巢膜和滤泡膜去
除完全，显微注射时具有弹性。当消化时间大于 70
min 时 ；卵母细胞多数为单个游离状，但细胞膜明
显受到伤害，植物极颜色发暗，显微注射时无弹性
（图 2）。
一步消化法和两步消化法均能达到较好的消化
效果，其中两步消化法的优点是 ：通过清洗第一次
消化的浑浊液，在二次消化时更容易把握消化时间
避免消化不完全或消化过度，但其缺点为操作相对
繁琐、酶的用量是一步消化法的两倍。
胶原酶浓度为 0.3 mg/mL 时，当消化时间超过
2 h 的时候仍有很多卵母细胞呈团块状 ；当胶原酶浓
度为 0.5 mg/mL 时，仅消化 50-70 min，卵母细胞颜
色鲜亮，多数为单个游离状，显微注射时具弹性 ；
而胶原酶浓度为 0.7 mg/mL 时，消化过程用时较少，
但是消化时间不易把握，容易消化过度，从而影响
后续试验。
培 养 液 分 别 选 用 不 含 抗 生 素 的 ND96 溶 液
（96 mmol/L NaCl，2.0 mmol/L KCl，1.0 mmol/L MgCl2·
6H2O，1.8 mmol/L CaCl2·2H2O）和含适量种类抗生
素（青霉素 10 μg/mL，链霉素 10 μg/mL，庆大霉素
100 μg/mL）的 ND96 溶液对已分选的卵母细胞进行
培养。其中培养液为含抗生素的 ND96 溶液的卵母
细胞隔夜培养后，破损蛙卵少，且蛙卵饱满，培养
液较清澈 ；培养液为不含抗生素的 ND96 溶液的卵
母细胞隔夜培养后，部分蛙卵受污染、破损严重，
培养液浑浊。
消化后立即进行显微注射的卵母细胞，在后续
的培养过程中，存活时间较少 ；而经过过夜培养后
（培养 16 h 以上）注射的卵母细胞，存活时间较长，
表达效果也更好，更利于后续试验的进行。出现此
结果考虑过夜培养有利于消化过程中受伤的细胞膜
进行自我修复。
ᵚᡀ⟏Ⲵথ⇽㓶㜎䗷ᡀ⟏Ⲵথ⇽㓶㜎
V/VIᵏথ⇽㓶㜎
图 1 不同时期的爪蟾卵母细胞
A B
C D
A ：未消化的卵母细胞 ；B ：消化不完全的卵母细胞 ；
C ：消化良好的卵母细胞 ；D ：消化过度的卵母细胞
图 2 不同消化阶段的爪蟾卵母细胞
2.3 乙酰胆碱受体的表达
以 α7 nAChRs 在上述分离的健康卵母细胞上的
表达为例，测定了 α7 nAChRs cRNA 不同注射体积
在爪蟾卵母细胞膜上的表达情况。注射了 α7 乙酰
胆碱受体 cRNA 的卵母细胞，培养 24 h 后在双电极
电压钳系统上检测受体电流表达情况，结果表明 3
种注射剂量都能表达出有功能的 α7 nAChRs，而未
注射的空白卵母细胞组和注射 ddH2O 的对照组，均
未能检测出任何电流（图 3-A，图 3-B）。注射了 α7
nAChRs cRNA 的卵母细胞在 200 μmol/L Ach 的门控
下，检测到了典型的 α7 nAChRs 的内向电流，其电
流值约为 700 nA（图 3-C）。虽然 3 种注射剂量都能
表达 α7 nAChRs，但是相比之下，注射 cRNA 量为
41.4 nL 的卵母细胞表现最正常，状态良好，极少发
生卵母细胞破裂的情况，生存时间最长，在注射后
的第 7-10 d 检测，其状态和电流仍然很好 ；而注射
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第6期170
量为 50.6 nL 的卵母细胞，有少部分卵细胞破损，可
生存较长时间，在 5 d 左右还可用于电流检测 ；注
射量为 60.9 nL 的卵母细胞，破损率较高，且生存
时间最短，一般在 3-4 d 之后全部死亡。由此可见，
注射体积越小，对卵母细胞的伤害越小，卵母细胞
生活时间越长，可用于电流检测的时间越长。因而，
应尽量提高 α7 nAChRs cRNA 的浓度，缩小 cRNA
的注射体积，减小对卵母细胞的伤害，延长受体成
功表达卵母细胞的使用时间，提高药靶筛选的工作
效率。
母细胞质量最好，不但细胞分散很好，且死细胞很少，
更有利于后续的培养和受体表达。试验结果表明两
步消化法优于一步消化法。一步消化法和两步消化
法虽然都能达到较好的消化效果，但两步消化法具
有以下优点 ：通过清洗第一次消化的浑浊液，在二
次消化时更容易把握消化时间，避免消化不完全或
消化过度，分离出的卵母细胞质量最好，但其缺点
为操作相对繁琐、酶的用量是一次消化法的两倍。
在对注射时间优化过程中发现，消化后立即进
行显微注射的卵母细胞，在后续的培养过程中，存
活时间较短 ；而经过过夜培养 16-24 h 后注射的卵
母细胞，存活时间较长，表达效果也更好，更有利
于后续试验的进行。出现此现象，主要是因为新鲜
分离的卵母细胞在消化过程中，其细胞膜可能受伤，
但经过过夜培养 16-24 h 后，有利于细胞进行自我
修复，更适合外源 cRNA 的注射和表达。本试验模
型所用培养液中的抗生素的含量分别为 ：青霉素 10
μg/mL，链霉素 10 μg/mL，庆大霉素 100 μg/mL。3
种抗生素的联合使用防止了卵母细胞培养过程中微
生物的污染，大大减少了细胞死亡的现象。若新鲜
分离的卵母细胞，其中大多数细胞是未成熟、过成
熟、或细胞表面出现大量血丝状的情况，应立即重取，
否则将严重影响后续试验的进行。本实验室利用该
优化的受体表达体系，已成功筛选出了 α-芋螺毒素
LtIA［8］等多种特异阻断乙酰胆碱受体亚型的新型芋
螺毒素。
由于非洲爪蟾卵母细胞的质量在很大程度上还
受非洲爪蟾本身发育状况和健康状况的影响，不同
厂家和批次的胶原酶活性不尽一致，因而各实验者
可根据自己的实际情况进行预试验，获得最适合的
参数条件，将会收到事半功倍的效果。
4 结论
以乙酰胆碱受体为例，确定了当爪蟾卵母细胞
消化时间为 50-70 min、消化用酶量为 0.5 mg/mL、
培养液为含抗生素的 ND96 溶液、cRNA 注射量为
41.4 nL 时为最优试验条件。所获得的受体优化表达
条件，对建立非洲爪蟾卵母细胞受体表达体系具有
重要的参考价值，可为利用此模型以受体为药物靶
点筛选靶向性药物，提供基础和技术方法。
A B C
250 nA
20 s
A ：未注射的空白卵母细胞电流图 ；B ：注射 ddH2O 的电流图 ；C ：注射 α7
nAChRs cRNA 的电流图
图 3 注射水及注射 α7 nAChRs 在爪蟾卵母细胞上表达的
电流图
3 讨论
非洲爪蟾卵母细胞的电生理试验是通过在卵母
细胞中表达特定的通道蛋白从而研究其属性。以包
含受体基因的质粒为模板体外转录成 cRNA，注射
到卵母细胞的细胞质中翻译、折叠并运输到细胞膜
上形成相应的受体通道蛋白。
在非洲爪蟾卵母细胞受体表达体系建立的过
程中，最易出现问题的步骤是卵母细胞的消化和
cRNA 的注射表达［8］，这将直接影响卵母细胞的质
量和受体是否能成功表达。本研究结果表明，消化
时间对分离的爪蟾卵母细胞质量影响很大。本研究
参考了国外一些试验室的做法，根据本实验室多次
预试验发现，在酶浓度为 0.5 mg/mL 时，消化时间
为 50 min 和 70 min 是消化不完全和消化过度的两个
分界点。消化时间短于 50 min 的处理，还存在大量
的未消化完全的相互粘连的卵母细胞聚集小块 ；若
消化时间长于 70 min 的处理，则消化过度，虽然每
个卵细胞都分离得很好，但很多卵细胞已受伤，细
胞很快死亡。然而消化时间在 50-70 min 之间的卵
2013年第6期 171房立丛等 ：受体在非洲爪蟾卵母细胞上表达方法的优化
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）